張雨竹，張明會，劉景輝，肖亞靜，張新，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319）

桃色頂孢霉粗蛋白對大豆鐮刀菌菌體電導率及抗氧化酶活性的影響

張雨竹，張明會，劉景輝，肖亞靜，張新，孫冬梅

（黑龍江八一農(nóng)墾大學，大慶 163319）

為了探明桃色頂孢霉粗蛋白對大豆茄病鐮刀菌的抑菌機理，測定了該粗蛋白對大豆鐮刀菌菌體抗氧化酶活性及電導率的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)粗蛋白處理過的菌體中過氧化物酶（POD）、過氧化氫（CAT）酶、超氧化物歧化酶（SOD）0～24 h內(nèi)均為上升狀態(tài)，在24 h時達到最高，分別是對照的1.95倍、2.16倍、1.67倍，隨著處理時間的延長，三種酶活性均下降，在96 h時降至最低；電導率則呈現(xiàn)先上升后保持平穩(wěn)的趨勢，當處理時間為24 h時，電導率變化率達到最高，為對照組的2.1倍。上述結(jié)果表明被粗蛋白處理過的菌體膜系統(tǒng)遭到破壞，細胞膜通透性變大，導致電解質(zhì)大量外滲，并破壞菌體細胞內(nèi)原有的抗氧化酶動態(tài)平衡狀態(tài)，對鐮刀菌造成傷害。

桃色頂孢霉；粗蛋白；抗氧化酶；電導率；大豆鐮刀菌

大豆根腐病是世界性土傳真菌病害之一，廣泛存在于中國各個區(qū)域。隨著大豆種植面積，特別是連作面積的擴大，大豆根腐病的危害越來越大[1]。該病害在中國各地都十分嚴重，其中以東北地區(qū)發(fā)病最重，一般會造成減產(chǎn)10%～30%，嚴重時可達60%[2]。大豆根腐病主要發(fā)生在大豆根部，初期莖部或胚根表皮出現(xiàn)淡褐色小斑，后期變紅褐色壞死斑，地下部分根瘤少，地上部分矮小瘦弱，植株葉片由下而上逐漸變黃，病株矮化，嚴重時，導致病株死亡[3]。頂孢霉屬于半知菌亞門，絲孢綱，叢梗綱目，淡色菌科，全世界共105種，分布廣泛。對于頂孢霉殺蟲有一些報道，樊美珍自林間的青楊天牛幼蟲蟲尸上分離出枝頂孢霉[5]，對該菌的形態(tài)、生物學特性和對青楊天牛毒力進行了生物測定和田間防治試驗，引起死亡率為48.72%，但是對于頂孢霉殺菌方面的研究還未見報道。實驗室前期工作已經(jīng)證實桃色頂孢霉粗蛋白對大豆鐮刀菌菌絲及孢子有較強的抑制作用[2]，為了探討桃色頂孢霉對大豆鐮刀菌生長的抑菌機理，試驗測定了桃色頂孢霉粗蛋白對該病原菌菌體電導率及抗逆酶活性的影響。在通常情況下，細胞膜作為分隔細胞質(zhì)和胞外環(huán)境的屏障，當細胞膜受到外界環(huán)境破壞時，會使電解質(zhì)大量外滲，導致電導率升高[6-8]。POD，CAT，SOD酶廣泛存在于動植物體中，在植物生長發(fā)育過程中它們的活性不斷發(fā)生變化，隨著細胞衰老越來越高。這是因為這三種抗氧化酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標[9-10]。而大量報道顯示，在外界脅迫條件下動植物體內(nèi)的保護酶會發(fā)生變化[11-13]，但是對于微生物在此條件下保護酶的應激反應卻鮮有報道。研究旨在通過研究桃色頂孢霉粗蛋白對病原菌體內(nèi)保護酶的影響，探討其粗蛋白抑制病原菌生長的抑菌機理，為下一步抑菌活性物質(zhì)——粗蛋白的分離純化提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

拮抗菌：桃色頂孢霉（A.percisinum）；病原菌：大豆根腐病茄病鐮刀菌（F.solanae）（黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院微生物實驗室提供）。

1.2 供試培養(yǎng)基

查氏培養(yǎng)基：NaNO32 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，蔗糖30 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 粗蛋白的制備

刮取一環(huán)已經(jīng)活化的桃色頂孢霉接入已滅菌的液體查氏培養(yǎng)基中，28℃120 r·min-1培養(yǎng)8～10 d后，用四層無菌紗布濾掉菌體，用兩層濾紙抽濾掉孢子后，再用0.22 μm的細菌過濾器除菌后收集濾液4℃保存?zhèn)溆?。? L的無菌濾液用冷凍干燥機濃縮至1 000 mL，用20%～70%飽和度的硫酸銨過夜沉淀[14]，透析除鹽后用0.05 mol·L-1pH6.0的磷酸緩沖液稀釋為1 000 mL，即為桃色頂孢霉粗蛋白。

1.4 病原菌的處理

用直徑5 mm的打孔器在生長5 d的鐮刀菌菌落同心圓環(huán)處制取菌碟，用接種針接種到PD中，27℃培養(yǎng)5 d。

1.5 試驗設計

將PD平板上培養(yǎng)5 d的直徑為8 cm的茄病鐮刀菌菌片2個用無菌水沖洗干凈后，分別置于盛有10 mL粗蛋白和不加菌的查氏培養(yǎng)基的燒杯中，分別處理2、4、6、8、10、12、24、48、72、96 h，將兩個燒杯均放置于4℃條件下，每個處理4次重復，以不加菌的查氏培養(yǎng)基為對照，將測定燒杯內(nèi)的電導率及菌體抗氧化酶的變化。

1.6 測定方法

電導率測定采用梅特勒電導率儀FE30 k。

抗氧化酶活性測定：

過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以1 min內(nèi)OD470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位（U）[15]；過氧化氫酶（CAT）活性測定采用紫外吸收法，以1 min內(nèi)A240減少0．1的酶量為1個過氧化氫酶活性單位（U）[15]；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT（氮藍四唑）光化還原法，以抑制NBT光還原50%的酶量為1個酶活力單位（U）[15]。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件

采用EXCEL2003進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃色頂孢霉粗蛋白對鐮刀菌菌體電導率的影響

結(jié)果如圖1所示，鐮刀菌菌片經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理后，隨著處理時間的延長，電導率前期變化不大，緩慢增加，細胞通透性變大，當處理時間為24 h時，電導率變化率達到最高，為對照組的2.1倍，處理時間為72 h時，電導率值最高，之后電導率基本不變。對照組電導率緩慢增加，一直保持平緩狀態(tài)，說明查氏培養(yǎng)基對鐮刀菌的傷害性較小。

2.2 桃色頂孢霉粗蛋白對鐮刀菌菌體內(nèi)過氧化物酶的影響

從圖2可以看出，實驗組POD酶活性隨著處理時間先升高后下降，24 h時達到最高值，為對照組的1.95倍，與對照組差異顯著，當處理時間為96 h時，POD酶活性降至最低，為對照組的32.9%，與其他處理時間活性相比差異較顯著。

圖1 桃色頂孢霉粗蛋白處理時間對鐮刀菌菌體電導率的影響Fig.1 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on conductivity of F.solanae

圖2 桃色頂孢霉粗蛋白處理對鐮刀菌POD酶活性的影響Fig.2 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of POD enzymes

2.3 桃色頂孢霉粗蛋白對鐮刀菌菌體內(nèi)過氧化氫酶的影響

圖3表明，隨著處理時間的延長，CAT酶活性逐漸升高，當處理時間為24 h時，CAT酶活性達到最高，為對照組的2.09倍，與對照組相比差異顯著，96 h時降至最低，為對照組的29.4%，且二者差異顯著。

圖3 桃色頂孢霉粗蛋白處理對鐮刀菌CAT酶活性的影響Fig.3 Effects of crude protein of extracted from A.percisinum fermentation on the activity of CAT enzymes

2.4 桃色頂孢霉粗蛋白對鐮刀菌菌體內(nèi)超氧化物歧化酶的影響

結(jié)果如圖4所示，SOD酶的變化趨勢與POD、CAT酶趨勢一致，隨著處理時間的增加，在24 h時達到最大值，為對照的1.67倍，此時與其他處理時間相比差異顯著，而后POD酶活性降低，在96 h時降到最低，為對照15.04%，說明POD酶對桃色頂孢酶粗蛋白的處理最敏感。

圖4 桃色頂孢霉粗蛋白處理時間對鐮刀菌菌體SOD酶活性的影響Fig.4 Effects of crude protein extracted from A.percisinum fermentation on the activity of SOD enzymes

3 結(jié)論與討論

細胞膜作為分隔細胞質(zhì)與胞外環(huán)境的屏障，同時也作為細胞與外界環(huán)境進行交換的通道，當細胞受到外界環(huán)境逆境傷害時，細胞內(nèi)容物會大量外滲，導致電導率激增，所以電導率作為一個衡量細胞受傷程度的生理指標是合理的[16-17]。研究表明經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理過的鐮刀菌燒杯內(nèi)電導率在24h時增長率最高，而后平緩上升，最后基本保持不變，而對照組緩慢上升，此現(xiàn)象說明桃色頂孢霉粗蛋白對鐮刀菌細胞膜結(jié)構(gòu)具有破壞功能，導致細胞膜受損，隨之電解質(zhì)滲漏嚴重。

POD、CAT、SOD與植物抗逆性密切相關[18-21]。POD是一種廣泛存在于真核生物各類細胞中的重要的活性較高的酶類，在植物體內(nèi)也大量存在，也和光合作用、呼吸作用相關，它會隨著植物生長不斷變化。一般老化細胞中POD酶含量高，幼嫩細胞中含量低，所以可將POD酶活性看作衡量細胞老化程度的生理指標。CAT普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，是一種酶類清潔劑，它可以促使H2O2分解為O2和H2O，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。SOD酶在生物界內(nèi)的分布極廣，從動物到植物，從人到單細胞幾乎都有它的存在，是一種具有特殊活性，可以清除自由基的新型酶類。現(xiàn)在已經(jīng)有研究表明SOD酶可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，減緩細胞衰亡，及時修復受損細胞。正常情況下細胞內(nèi)SOD、CAT和POD 3種保護酶協(xié)調(diào)一致處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)使自由基維持在一個低水平，從而防止自由基毒害，一旦自由基這種平衡受到破壞就可能產(chǎn)生傷害作用[22-24]。研究表明：經(jīng)桃色頂孢霉粗蛋白處理過的鐮刀菌菌體內(nèi)三種酶變化趨勢相近，均為先升高后下降，在24 h三種酶活性達到最高，與對照組相比差異顯著；結(jié)合電導率測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，電導率變化率也在24 h時，變化最大，而后期電導率基本不變，這可能與內(nèi)容物大量滲出有關。而酶活性也表現(xiàn)出24 h后下降趨勢，且在96 h時降至最低。但對照中菌體內(nèi)容物滲出量比較一致，而酶活性出現(xiàn)升高趨勢，具體原因有待進一步研究。綜上所述，桃色頂孢霉粗蛋白破壞了鐮刀菌菌體內(nèi)原有的保護酶系統(tǒng)的動態(tài)平衡，導致氧自由基清除系統(tǒng)出現(xiàn)障礙，導致電解質(zhì)大量外滲，菌體電導率先升高后保持不變，這可能是桃色頂孢霉粗蛋白抑制鐮刀菌生長的機理之一，是否存在其他機理還有待研究。

［1］肖彩霞，關雪松，王曉艷，等.東北三省大豆品種（系）對大豆根腐鐮孢菌的抗性分析［J］.中國油料作物學報，2013，35（2）：201－206．

［2］張雨竹，董雪梅，郭春蘭，等.桃色頂孢霉發(fā)酵液對大豆的促生及抗氧化酶活性的影響［J］.中國油料作物學報，2014，36（4）：519－523.

［3］朱文靜，伍輝軍，高學文.芽孢桿菌對大豆根腐病防治效果研究［J］.大豆科學，2011，30（4）：621-625.

［4］李莉，沈慧敏，宋麗雯，等.頂孢霉菌液體培養(yǎng)最適條件及殺蚜毒力的研究［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學學報，2007，42 （2）：67-70.

［5］樊美珍，郭超，燕新華.從青楊天牛分離的幾種致病真菌［J］.真菌學報，1987（2）：97-102.

［6］魏立強，謝慧琴，楊德松，等.旱芹粗提物對棉花枯萎病菌丙二醛含量電導率及保護酶活性的影響［J］.植物保護，2012，38（3）：28-31.

［7］陳衛(wèi)，杭鋒，趙建新，等.微波殺菌過程中大腸桿菌與金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的改變［J］.微生物學報，2007，47（4）：697-701.

［8］王興云，張新強，張鵬，等.玉米灰斑病菌毒素對離體玉米葉片電導率的影響［J］.中國農(nóng)學通報，2011，27（24）：258-261.

［9］金海友，呂淑霞，于冰，等.綠色木霉菌T23發(fā)酵液對番茄幾種防御酶活性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2007，35 （8）：2211-2212.

［10］劉淑宇，于新，陳發(fā)河，等.綠色木霉菌發(fā)酵液對杧果炭疽菌的生長抑制及細胞損傷作用［J］.果樹學報，2012，29（6）：1097-1102.

［11］張永峰，殷波.混合鹽堿脅迫對苗期紫花苜蓿抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響［J］.草業(yè)學報，2009，18（1）：46-50.

［12］宋志明，劉鑒毅，莊平，等.低溫脅迫對點籃子魚幼魚肝臟抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響［J］.海洋漁業(yè)，2015，37（2）：142-150.

［13］王瑞，馬鳳鳴，李彩鳳，等.低溫脅迫對玉米幼苗脯氨酸、丙二醛含量及電導率的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2008，39（5）：20-23.

［14］郭春蘭，于春生，張雨竹，等.枯草芽孢桿菌21抑菌物質(zhì)的穩(wěn)定性分析及初步分離［J］.黑龍江八一農(nóng)墾大學學報，2015，27（1）：69-72.

［15］王曉維，黃國勤，徐健程，等.銅脅迫和間作對玉米抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2014，33（10）：1890-1896.

［16］呂娜，高原.糞腸球菌致病因子的研究進展［J］.內(nèi)蒙古民族大學學報：自然科學版，2015（4）：323-326.

［17］楊曉娟，唐湘如，聞祥成，等.香稻不同生育時期葉片SOD、POD酶活性及MDA含量對播期的響應［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（19）：48-51.

［18］朱翠英，付喜玲，孫明岳，等.桃自然休眠期間抗氧化系統(tǒng)酶（CAT、POD、SOD）活性變化［J］.山東農(nóng)業(yè)大學學報，2015，46（6）：808-811.

［19］黃文書，白羽嘉，陶永霞，等.阿魏對阿魏菇菌絲體CAT 和SOD酶活力的影響［J］.食品科技，2011，36（8）：186-189.

［20］謝暉.大蒜生長過程中SOD酶活力變化研究［J］.青海師專學報：教育科學，2009，36（5）：220-222.

［21］Yun-bo Wang，Wen-xing Pang，Xiao-na Yv.The effects of fluctuating culture temperature on stress tolerance and antioxidase expression in Esteya vermicola［J］.Journal of Microbiology，2015，53（2）：122-126.

［22］聞靜，趙剛，李鳳蘭，等.大豆矮化突變體 IOD、POD、CAT、SOD酶活性的研究［J］.作物雜志，2012，34（3）：53-57.

［23］劉招龍.水楊酸對桃葉感染輪紋病菌后PDO和SOD酶活性的影響［J］.安徽農(nóng)學通報，2009，15（8）：32-33.

［24］Dong X Q，Zhang D M，Chen Y K.Effects of antimicrobial peptides（APs）on blood biochemical parameters，antioxidase activity，and immune function in the common carp（Cyprinus carpio）［J］.Fish and Shellfish Immunology，2015，47（1）：429-434.

Effects of Crude Protein Extracted from Acremonium percisinum Fermentation on the Activity of Antioxidan Enzymes and Content of Conductivity Ratio of Fusarium solanae

Zhang Yuzhu，Zhang Minghui，Liu Jinghui，Xiao Yajing，Zhang Xin，Sun Dongmei
（Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

In order to explore inhibiting mechanism of the crude protein extracted from Acremonium percisinum fermentation，the influences of the crude protein on the activity of antioxidan enzymes and content of conductivity ratio were discussed.The results showed：the activity of POD，CAT and SOD in mycelium all increased after treated with crude protein from 0 to 24 h.The three antioxidan enzymes all reached to the maximum value at 24 hours，which was 1.95，2.16 and 1.67 times than that of the control，respectively.As the time extended，the three antioxidan enzymes all decreased，and the minimal values occurred at 96 hours.The conductivity of the mycelium showed the tendency increased at first and then was stable.The change ratio of conductivity reached the highest after treated by crude protein for 24 h and the value was 2.1 times than that of the control.Above all，these results indicated the destroy of mycelium membrane system，the larger of membrane permeability and the leakage of electrolyte.So the balance of antioxidan enzymes system was destroyed，and then mycelium was dead.

Acremonium percisinum；crude protein；antioxidan enzymes；conductivity；Fusarium solanae

10.3969/j.issn.1002-2090.2016.05.014

S476.+9

A

1002-2090（2016）05-0073-04

2015-12-22

黑龍江省研究生創(chuàng)新項目（YJSCX2015-Y61）。

張雨竹（1990-），女，黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科學技術學院2013級碩士研究生。

孫冬梅，女，教授，E-mail：7981004@qq.com。