曾志燎，鄧清連，茹開卓

（1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

2014—2015年深圳野生鳥類禽流感流行病學(xué)監(jiān)測(cè)

曾志燎1，鄧清連2，茹開卓1

（1.深圳市野生動(dòng)物救護(hù)中心，廣東 深圳 440300；2.深圳市真和麗生態(tài)環(huán)境建設(shè)有限公司，廣東 深圳 440300）

為調(diào)查深圳野生鳥類的禽流感感染情況，于2014年1月～2015年4月采集了678只野鳥的569份糞便，62份肛門拭子，26份咽肛拭子和21份血樣。采用病原分離鑒定法、AIV-Ag（通用型）抗原速測(cè)卡膠體金法、熒光RT-PCR試驗(yàn)對(duì)樣品拭子進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。采用血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）對(duì)血清樣品進(jìn)行H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9等5種血清型AIV抗體檢測(cè)。結(jié)果顯示：26份咽肛拭子分離出1株H9N2亞型禽流感病毒，陽(yáng)性率為3.85%；糞便和拭子樣品的抗原檢測(cè)全部陰性；血清樣品中H5（Re-4）陽(yáng)性數(shù)1份，陽(yáng)性率為9.09%；H9陽(yáng)性數(shù)7份，陽(yáng)性率為63.64%；未檢出H5（Re-6）、H5（Re-7）及H7陽(yáng)性抗體。

野生鳥類；禽流感；流行病學(xué)

禽流行性感冒，簡(jiǎn)稱禽流感（Avian Influenza，AI），是由禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）引起的一種急性高度接觸性傳染病，其宿主范圍比較廣，包括豬，人，馬，貓科動(dòng)物，海洋哺乳動(dòng)物以及幾乎所有的家禽和野生鳥類等[1]。21世紀(jì)初，泰國(guó)和中國(guó)等多個(gè)亞洲國(guó)家的不同種野生鳥類都曾因?yàn)楦腥厩萘鞲卸笈克劳?，并且?jīng)過病原的分離與鑒定[2]，都為同一個(gè)亞型的高致病性禽流感（Highly pathogenic avain influenza，HPAI），而隨后歐洲的部分國(guó)家和地區(qū)也相繼爆發(fā)了同一亞型的高致病性禽流感[3]。目前有學(xué)者認(rèn)為野生鳥類有可能是禽流感跨地域傳播的病原攜帶者[4]，因此，進(jìn)一步了解野生鳥類的禽流感病毒流行情況，有利于禽流感的防控工作。

全球八條候鳥遷徙路線中有三條途徑我國(guó)，而深圳正處于“東亞/澳大利亞遷徙線”上。每年的候鳥遷徙之際，深圳地區(qū)將會(huì)有成千上萬只野生鳥途徑或者停留補(bǔ)充食材。迄今為止，記錄到的野生鳥類主要有鷺、鷗、雁等389種，分別占全國(guó)和全球鳥類的33.33%和3.33%。關(guān)于野生鳥類，我國(guó)依舊缺乏有效的免疫以及疫病監(jiān)測(cè)措施，本研究于2014年1月-2015年4月對(duì)深圳地區(qū)3個(gè)鳥類疫病監(jiān)測(cè)點(diǎn)（深圳灣公園、鐵崗水庫(kù)、海上田園）野鳥、救護(hù)基地的678只野鳥禽流感感染和帶毒情況進(jìn)行了檢測(cè)，旨在掌握深圳地區(qū)野生鳥類感染禽流感的情況，進(jìn)而對(duì)禽流感的預(yù)防和控制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、PCR儀、熒光PCR檢測(cè)儀、微量加樣器、96孔V型微量反應(yīng)板、組織勻漿器。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 75%乙醇；0.01 mol/L（pH 7.2）的PBS（磷酸鹽緩沖生理鹽水）；H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；阿氏（Alsevers）液；雞紅細(xì)胞懸液；AIV標(biāo)準(zhǔn)抗原購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 2014年1月至2015年4月從深圳灣公園、鐵崗水庫(kù)、海上田園、救護(hù)基地及緩沖區(qū)采集鳥糞569份、鳥肛拭子62份、鳥咽肛拭子26份、鳥血清21份（野鳥樣品詳細(xì)分類見表1）。

1.2.2 樣品處理 采集的糞便樣品用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）浸泡，4 000 r/min離心15 min后取上清備用。棉拭樣品用含有抗菌素且pH為7.4～7.6的Hanks液浸泡，迅速送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，通過反復(fù)在管壁擠壓棉拭子將病毒液擠壓出，將擠壓后的棉拭子進(jìn)行無害化處理，為了打碎黏液，應(yīng)該用無菌的毛細(xì)吸管反復(fù)吹打擠壓后的溶液。將黏液置于4 ℃待其自然沉淀5～10 min后離心取上清液備用。鳥血樣用霍亂菌培養(yǎng)液等受體破壞酶（RDE）或高碘酸鈉法去除待檢血清中的非特異性凝集抑制因子，按照體積比為4：1加受體破壞酶和待檢血清，37 ℃恒溫水浴16～18 h，然后56 ℃水浴50 min（破壞殘余RDE的活性），4 000 r/min離心后取上清，再加入終濃度為100 mL/L的測(cè)定用雞紅細(xì)胞懸液，搖勻，4 ℃過夜，1 000 r/min離心5 min，取上清置于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 野鳥樣品詳細(xì)分類

1.2.3 病毒的分離培養(yǎng) 采集的咽肛拭子先浸在滅菌生理鹽水中，將咽肛拭子在管壁反復(fù)擠壓后取出，充分振蕩管中液體，加入適量抗生素，室溫靜置作用30 min，4 000 rpm離心5 min，取上清液，經(jīng)尿囊腔接種9～11 d SPF雞胚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育，每天照蛋2次，連續(xù)觀察6 d，棄去24 h污染死胚。將死亡或?yàn)l死雞胚置4 ℃ 4 h以上，剖檢，觀察胚胎病變并收獲尿囊液，用RNA提取試劑盒提取病毒RNA（步驟參照RNA提取試劑盒進(jìn)行），所有剩余樣品-70 ℃保存。

1.2.4 AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測(cè)卡膠體金法

將采集好的肛拭子樣品插入裝有試驗(yàn)稀釋液的采樣管中，不斷攪拌拭子直至樣品溶解到試驗(yàn)稀釋液中；用試劑盒配的一次性滴管吸取采樣管中的上清液；加4～5滴到速測(cè)卡上的樣品孔中；20～30 min后讀取檢測(cè)結(jié)果。

1.2.5 H 5、H 7和H 9亞型禽流感病毒熒光R T-P C R和R T-P C R檢測(cè)方法 將采集的5 6 9份糞便處理后樣品參照G B/T 1 9 4 3 8.2-2004《H5亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》、GB/ T19438.3-2004《H7亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》和GB/T19438.4-2004《H9亞型禽流感病毒RT-PCR檢測(cè)方法》進(jìn)行RT-PCR和熒光RT-PCR檢測(cè)。

1.2.6 血凝抑制試驗(yàn) HI試驗(yàn)參照GB/T 18936—2003《高致病性禽流感診斷技術(shù)》進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離培養(yǎng)結(jié)果

通過對(duì)采集的26份咽肛拭子進(jìn)行SPF雞胚傳代培養(yǎng)病毒分離試驗(yàn)分離病毒，結(jié)果分離出1株禽流感病毒，經(jīng)HI及測(cè)序分析鑒定為H9N2亞型禽流感病毒。

2.2 AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測(cè)卡膠體金法檢測(cè)結(jié)果

采集的野鳥肛拭子62份通過AIV-Ag禽流感（通用型）抗原速測(cè)卡快速檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

2.3 H5、H7和H9亞型禽流感病毒熒光RT-PCR和RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

569份糞便處理后的樣品進(jìn)行熒光RT-PCR檢測(cè)H5和H7亞型病毒核酸，結(jié)果均為陰性；通過RTPCR檢測(cè)H9亞型病毒核酸，結(jié)果均為陰性。

2.4 野鳥血清中AIV抗體HI試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

2014年1月～2015年4月采集野鳥血清21份，經(jīng)HI試驗(yàn)對(duì)不同亞型AIV抗體H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9的檢測(cè)，在受檢的8種鳥類的21份血清中共檢出兩種不同亞型AIV陽(yáng)性抗體共8份，陽(yáng)性率為38.10%。其中，H5（Re-4）陽(yáng)性數(shù)1份，陽(yáng)性率為4.76%；H9陽(yáng)性數(shù)7份，陽(yáng)性率為33.33%；H5（Re-6）、H5（Re-7）、H7陽(yáng)性數(shù)均為0。

3 討論

一是禽流感的病原是A型流感病毒，其宿主范圍特別廣，幾乎所有的家禽和野鳥都能感染，據(jù)報(bào)道，禽流感的血凝素亞型（H1-H16）和神經(jīng)氨酸酶亞型（N1-N9）都可以在野生鳥類檢測(cè)到[5]，且大多數(shù)的HA/NA組合也都能在野生鳥類檢測(cè)到。鳥類包括野生鳥類具有遷徙的習(xí)性，在遷徙的過程中，都有可能把自身攜帶的禽流感病毒帶至遷徙途徑之地，或者在遷徙逗留的地方攜帶上禽流感病毒，稱為病毒攜帶者，在來年返程的過程中將禽流感病毒帶回，這樣循環(huán)往復(fù)的遷徙習(xí)性就導(dǎo)致了禽流感病毒的跨地域傳播。而禽流感宿主范圍廣的原因?qū)е铝巳魏蔚囊吧B類都可以成為病原攜帶者，所以，野生鳥類在禽流感的傳播方面有著不可忽視的作用。特別是深圳，深圳處于世界8大鳥類遷徙主要路線的第5條“東亞/澳大利亞遷徙線”上[6]，每年都會(huì)有大量的野生鳥類途徑深圳或停留深圳，給深圳地區(qū)的禽流感疫情帶來了潛在的威脅。禽流感病毒的毒型較多，變異也比較迅速、頻繁，低致病性的毒株可以變異為高致病性的毒株[7]，每年給世界養(yǎng)禽業(yè)都會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和精神折磨。

二是此調(diào)查研究對(duì)深圳地區(qū)的野鳥進(jìn)行了禽流感疫情的監(jiān)測(cè)，通過病毒分離法分離出了一株H9N2亞型的禽流感，說明野鳥中確實(shí)存在禽流感病毒。每年的遷徙季節(jié)，都有許多野生鳥類停留在深圳的湖泊，濕地，公園等地方，與湖泊和濕地上的水源以及公園的人群接觸，極有可能成為病毒的傳播者或者攜帶者。在對(duì)其進(jìn)行病原檢測(cè)時(shí)，檢出率并不高，一方面或許是因?yàn)樗{(diào)查的深圳地區(qū)的野生鳥類中確實(shí)還未存在禽流感病毒攜帶者；另一方面或許是因?yàn)檫@些野生鳥類雖然攜帶有禽流感病毒，但是其處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，還未向外界排毒，所以絕大多數(shù)野生鳥類還檢測(cè)不出禽流感病毒，只有個(gè)別的野生鳥可以檢測(cè)到，但是，即便如此，也不能放松警惕，要時(shí)刻做好對(duì)野生鳥類禽流感病毒的監(jiān)測(cè)，建立一個(gè)更加完善的監(jiān)測(cè)體系勢(shì)在必行。

三是本研究對(duì)所采集的21份血樣利用HI試驗(yàn)對(duì)不同亞型AIV抗體{H5N1（Re-4）、H5N1（Re-6）、H5N1（Re-7）、H7、H9}進(jìn)行檢測(cè)。其中有1份為H5N1（Re-4）亞型AIV抗體陽(yáng)性，其宿主是紅綠金剛鸚鵡；1份為H9亞型AIV抗體陽(yáng)性，宿主為雄性環(huán)頸雉；有6份雞血清H9亞型AIV抗體檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。利用RTPCR方法檢測(cè)相同個(gè)體紅綠金剛鸚鵡肛拭子、雄性環(huán)頸雉咽肛拭子及雞咽肛拭子H5、H7、和H9亞型禽流感病毒，結(jié)果均為陰性。分析這些血清中檢測(cè)出AIV陽(yáng)性抗體的原因，經(jīng)查實(shí)，這些鳥類并不是完全意義上的野生鳥類，有些是深圳海關(guān)查獲的非法入境的野生動(dòng)物，有些事在國(guó)外經(jīng)人工光飼養(yǎng)出來的，隨著大群的野生鳥類而遷徙，因此，有可能是這些人工飼養(yǎng)的鳥類接種了禽流感疫苗。而禽流感病毒血清抗體檢出率高于病毒檢出率的原因，有可能是因?yàn)橄啾容^而言抗體在體內(nèi)存留的時(shí)間比病毒存留時(shí)間長(zhǎng)，所以在血清中檢出禽流感抗體的幾率比在咽肛拭子、糞便中檢出病毒的幾率大。

四是分離出禽流感病毒拭子樣品，用RT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果是陰性，用雞胚傳代培養(yǎng)病毒分離方法檢測(cè)陽(yáng)性，說明在樣品病毒含量較低的情況下，病毒分離傳統(tǒng)法比RT-PCR方法更靈敏，缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)。RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)間短，可批量檢測(cè)樣品，適合應(yīng)用于禽流感樣品日常監(jiān)測(cè)。

五是盡管近幾年來從野生鳥類中可分離到高致病力的禽流感病毒，但畢竟甚少，絕大多數(shù)野生鳥類源的流感病毒分離株為無致病力或低致病力病毒亞型，多呈無癥狀隱性感染，長(zhǎng)期以來野生鳥類與禽流感病毒形成了相對(duì)穩(wěn)定的寄生關(guān)系，因此野生鳥類成為禽流感病毒持續(xù)感染、持續(xù)存在的主要儲(chǔ)存宿主。同國(guó)外一些國(guó)家相比，國(guó)內(nèi)關(guān)于野鳥的禽流感的監(jiān)測(cè)與檢測(cè)工作起步較晚，野鳥的疫病監(jiān)測(cè)體系不夠完善，我國(guó)目前迫切需要建立一個(gè)完整野鳥禽流感預(yù)警預(yù)報(bào)監(jiān)測(cè)體系。

[1]成進(jìn)，沙依蘭古麗，夏俊，等.2009年～2011年新疆雁形目野生鳥類禽流感血清流行病學(xué)調(diào)查與分析[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，（12）：3-6.

[2]何維明，高玉鵬，姜艷芬，等.禽流感流行病學(xué)調(diào)查及病原分離鑒定初報(bào)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，（3）：16-19.

[3]孫泉云，王天厚，劉佩紅，等.上海地區(qū)野鳥中禽流感的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2007，（6）：19-23.

[4]Chen H，Smith G J，Zhang S Y，et al.Avian flu：H5N1 virus outbreak in migratory waterfowl[J].Nature.2005，436（7048）：191-192.

[5]Fouchier R A，Olsen B，Bestebroer T M，et al.Influenza A virus surveillance in wild birds in Northern Europe in 1999 and 2000[J].Avian Dis.2003，47（3 Suppl）：857-860.

[6]Tollis M，Di Trani L.Recent developments in avian influenza research：epidemiology and immunoprophylaxis[J].Vet J.2002，164（3）：202-215.

[7]Wang X，Basler C F，Williams B R，et al.Functional replacement of the carboxy-terminal two-thirds of the influenza A virus NS1 protein with short heterologous dimerization domains[J].J Virol.2002，76（24）：12951-12962.

（編輯：李善祥）

S858.9

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1006-799X(2016)20-0087-03

曾志燎（1985-），男，廣東河源人，獸醫(yī)師，主要從事野生動(dòng)物救護(hù)及野生動(dòng)物疫源疫病監(jiān)測(cè)工作。