楊蕾 盧錦標(biāo) 都偉欣 王國治 陳保文

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·專論·

結(jié)核病診斷中酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測試劑臨床應(yīng)用的風(fēng)險評估與控制

楊蕾 盧錦標(biāo) 都偉欣 王國治 陳保文

通過對可能影響γ干擾素釋放試驗(IGRA)的酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)檢測結(jié)果的受試者、檢測方法、環(huán)境設(shè)施和儀器等因素的風(fēng)險識別與分析，提示ELISPOT檢測試劑在臨床結(jié)核病診斷應(yīng)用中可能產(chǎn)生的風(fēng)險，并提出相應(yīng)的風(fēng)險控制措施，以降低該類試劑的檢測風(fēng)險。

結(jié)核； 干擾素γ； 酶聯(lián)免疫斑點檢測； 危險性評估； 質(zhì)量控制

結(jié)核分枝桿菌感染人體后激發(fā)的免疫反應(yīng)以誘導(dǎo)分泌γ干擾素的輔助T淋巴細(xì)胞(TH)1型免疫為主。γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)的酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)試劑以特異性抗原做為刺激源，體外激發(fā)特異性T細(xì)胞分泌γ干擾素，再利用固相ELISPOT 檢測分泌γ干擾素細(xì)胞的數(shù)量，以此來判斷是否感染了結(jié)核分枝桿菌。目前，已有大量研究顯示該試劑檢測活動性結(jié)核病有較高的診斷敏感度和特異度[1-3]。與結(jié)核菌素純蛋白衍生物試驗(purified protein derivative test，PPD試驗)皮內(nèi)診斷試劑相比，ELISPOT檢測結(jié)核感染不受卡介苗接種的影響[4-5]，具有較高的敏感度和特異度，但診斷結(jié)核病的穩(wěn)定性存疑[6]。

筆者對可能影響臨床檢測結(jié)果的受試者、檢測方法、環(huán)境設(shè)施及檢測儀器等因素進(jìn)行了風(fēng)險識別與分析，提示ELISPOT檢測試劑臨床研究與臨床檢測時可能產(chǎn)生的風(fēng)險，并提出了相應(yīng)的風(fēng)險控制措施，為ELISPOT檢測試劑的臨床應(yīng)用、臨床研究方案的制定、臨床研究過程的監(jiān)督評估以及臨床研究結(jié)束后研究結(jié)果的分析提供參考。

一、受試者影響因素風(fēng)險管理

(一)抗結(jié)核藥物治療及治療時間對ELISPOT檢測結(jié)果的影響與控制

大量文獻(xiàn)報道，結(jié)核病患者經(jīng)抗結(jié)核藥物治療后特異性斑點數(shù)減少，有些試驗結(jié)果顯示檢測陽性率降低。劉紅等[7]報道：結(jié)核病患者在應(yīng)用抗結(jié)核藥物治療前與治療后[2～4周]分別進(jìn)行結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗(T-SPOT.TB)檢測，治療前抗原A(早期分泌靶抗原6，ESAT-6)和抗原B(培養(yǎng)濾液蛋白10，CFP-10)的特異性斑點平均數(shù)分別為99個和49個，治療后平均數(shù)分別為47個和18個，治療后斑點數(shù)明顯少于治療前斑點數(shù)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.211，3.383；P值均<0.01)。Park和Tae[8]在韓國的一項研究顯示，活動性結(jié)核病患者經(jīng)一線抗結(jié)核藥物治療前與治療后第1個周末，以及完成療程后分別進(jìn)行T-SPOT. TB檢測，結(jié)果表明：33例患者治療前及治療后第1個周末檢測有31例呈陽性，2例呈陰性；完成療程后，31例檢測陽性患者中有28例呈陽性，其中3例陰轉(zhuǎn)，但2例檢測陰性患者全部轉(zhuǎn)陽；另一方面，治療后抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)的特異性斑點平均數(shù)較治療前下降明顯(下降數(shù)量分別為27個和24個)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Yan等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，正在接受抗結(jié)核藥物治療的活動性結(jié)核病患者的T-SPOT.TB檢測陽性率(65.17%，58/89)明顯低于未接受治療的患者(80.62%，208/258)(P=0.003)；并且，治療的時間越長，檢測陽性率也越低(P=0.010)。Li等[10]對兒童結(jié)核病的研究也有類似的結(jié)果，檢測抗結(jié)核藥物治療1周以上的患者假陰性率(57.31%)高于治療1周及1周以內(nèi)或未治療組的患者(18.3%)(P=0.035)。這些結(jié)果提示抗結(jié)核藥物治療1周以上會降低酶聯(lián)反應(yīng)斑點數(shù)，進(jìn)而影響檢測結(jié)果。

在我國，ELISPOT試劑已被批準(zhǔn)用于結(jié)核病輔助診斷[11]，而鑒于結(jié)核病患者經(jīng)治療后檢測斑點數(shù)可能降低，進(jìn)而影響診斷結(jié)果，因此，臨床使用可能僅作為結(jié)核病療效觀察和診斷性治療觀察的指標(biāo)之一[8-9]。但是，在試劑的臨床試驗中，若將不同治療時間的患者均入組為結(jié)核病患者組，極有可能導(dǎo)致檢測陽性率比實際結(jié)果偏低。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)建議在臨床試驗時，選擇初治且還未治療的患者、初治且治療1周內(nèi)的患者(可能不會干擾診斷結(jié)果，但可能使臨床結(jié)果偏離)、1個月內(nèi)病原學(xué)檢查陽性的患者入組。(2)臨床研究的結(jié)果分析可按不同實驗對象分級評價試劑敏感度，分別進(jìn)行菌陽患者、菌陰患者和結(jié)核病患者(菌陽與菌陰)的陽性率分析。

(二)菌陽、菌陰結(jié)核病患者的比例對研究結(jié)果的影響與控制

1.ELISPOT試劑對菌陽患者的檢測效能：本試劑主要用于結(jié)核病輔助診斷，患者中應(yīng)包括菌陽與菌陰患者，但ELISPOT試劑對二者的檢測敏感度有可能不同。Yan等[9]采用T-SPOT. TB試劑對涂陽、涂陰、培陽、培陰患者的檢測陽性率分別為85.71%(84/98)、14.29%(14/98)、73.66%(73/107)、26.34%(34/107)。吳妍等[12]使用T-SPOT.TB試劑檢測了346例老年肺結(jié)核患者，菌陽、菌陰患者檢測陽性率分別為90.32%、72.09%。王新寧等[13]使用T-SPOT.TB試劑和分枝桿菌改良羅氏固體培養(yǎng)法檢測了214例結(jié)核病患者，其中菌陽患者109例、菌陰患者105例，檢測結(jié)果顯示： ELISPOT檢測菌陽和菌陰患者的陽性率分別為89.0%(97/109)、18.1%(19/105)。以上結(jié)果均提示 ELISPOT試劑對菌陽患者的檢測敏感度較高。

2. ELISPOT試劑的其他臨床應(yīng)用：ELISPOT試劑臨床試驗招募的人群理論上應(yīng)盡可能與試劑未來使用人群相似，但不同級別的醫(yī)院患者的來源與背景不同，菌陰菌陽患者的比例也不一樣。一般來說，基層醫(yī)院就診的大多數(shù)為初診患者，菌陽患者比例較低；大型?？漆t(yī)院經(jīng)基層醫(yī)院診斷后再就診的患者較多，菌陽患者比例較高；而綜合性醫(yī)院非典型癥狀的結(jié)核病患者和其他疾病需要排除結(jié)核病的患者較多。另外，由于ELISPOT試劑對不明原因發(fā)熱的患者檢測陽性率較低[14]，對惡性腫瘤患者檢測的特異性也較低[5,15]，需特別注意。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)考慮到 ELISPOT試劑對菌陽與菌陰患者的檢測敏感度有可能不同，且病原學(xué)檢測呈陰性并不能排除結(jié)核分枝桿菌感染，故建議在進(jìn)行臨床總結(jié)分析時，應(yīng)參考體外診斷制劑的敏感度分析方式，分別計算菌陽患者和菌陰患者的陽性率，以及所有結(jié)核病患者的總陽性檢出率，分析其在不同人群中的敏感度。(2)不同醫(yī)院結(jié)核病患者菌陽與菌陰患者比例不同，各醫(yī)院不宜制定統(tǒng)一比例，建議參考《結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則》[16]中“涂片陰性的肺結(jié)核患者占所有肺結(jié)核患者的比例應(yīng)不小于50%”的基本要求，在總的研究結(jié)果中應(yīng)有一定比例的菌陰結(jié)核病患者數(shù)量，范圍控制在(45±10) %為宜。

(三)菌陰肺結(jié)核患者對研究結(jié)果的影響與控制

多數(shù)研究報告的結(jié)果顯示，ELISPOT試劑對菌陽患者的檢出率高于菌陰患者[2-3,17]；但也存在不同的研究報告。依據(jù)劉紅等[7]的報道，該院T-SPOT.TB檢測確診結(jié)核病患者、菌陰患者的陽性率分別為77.8%和87.6%，后者陽性率明顯高于前者。李晉等[18]采用酶聯(lián)免疫斑點法檢測無痰或痰涂片陰性的結(jié)核病患者密切接觸者，陽性率為41.9%(18/43)；檢測痰涂片為“+++”的結(jié)核病患者密切接觸者，陽性率為31.5%(23/73)。這兩項研究中ELISPOT檢測陽性率均高于金標(biāo)準(zhǔn)，提示臨床醫(yī)師采用ELISPOT試劑輔助診斷菌陰結(jié)核病時，有將結(jié)核感染者誤診為結(jié)核病患者的可能。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：由于在臨床試驗總結(jié)中，常以某種診斷性試劑作為陽性對照，使得陽性對照試劑計算所得的陽性檢出率一般會高于其他試劑。并且，我國目前僅批準(zhǔn)ELISPOT試劑用于結(jié)核病輔助診斷。所以，在臨床評價時，不應(yīng)單純以同類試劑作對照，建議增加其他檢測方法作為評價參考；應(yīng)避免在確診前進(jìn)行試劑盒的評價分析，尤其是菌陰結(jié)核病患者。并建議在檢測標(biāo)準(zhǔn)程序操作(SOP)中，規(guī)定各項檢測的報告時間與報告方式，以避免檢測結(jié)果干擾臨床醫(yī)師的判斷，造成誤診和評價不準(zhǔn)確。

(四) 免疫抑制劑使用患者對檢測結(jié)果的可能影響與控制

研究表明，在IGRA檢測免疫抑制劑使用患者時，ELISPOT法受免疫抑制狀態(tài)的影響較小，其檢測敏感度明顯高于ELISA法，以下研究均可證實ELISPOT檢測在免疫抑制劑使用患者的結(jié)核病診斷中有較高的價值[1，11，19-21]；但在患者機(jī)體處于嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)時，如人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者、慢性免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病患者、免疫系統(tǒng)未發(fā)育完全的兒童和器官移植患者等，T細(xì)胞反應(yīng)被嚴(yán)重抑制，ELISPOT檢測可能會出現(xiàn)假陰性[2，19-21]。一項Meta分析表明[22]，在中低收入國家，T-SPOT.TB檢測嚴(yán)重免疫抑制狀態(tài)的HIV感染者時陽性率明顯降低。祁燕偉等[23]的研究表明，CD4+T淋巴細(xì)胞水平對T-SPOT.TB陽性率有一定影響，在CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)≤50個/μl的HIV感染者中敏感度降低，且患者在IGRA檢測前經(jīng)免疫抑制劑治療很可能會降低其檢測敏感度[19]。Edwards等[24]的研究發(fā)現(xiàn)，皮質(zhì)類固醇和抗TNF-α治療使得30%的患者檢測結(jié)果由陽轉(zhuǎn)陰，測得的IFN-γ濃度明顯降低。另一項Meta分析結(jié)果表明[25]，對免疫抑制劑治療的患者(如類固醇、口服免疫抑制劑和生物治療等)的檢測，對ELISPOT結(jié)果有負(fù)面效果。這些研究發(fā)現(xiàn)，免疫抑制劑的存在降低了ELISPOT的陽性檢出率，提示ELISPOT在檢測這類患者時可能存在風(fēng)險。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療可以使HIV感染者的免疫功能得以恢復(fù)，建議HIV感染者ELISPOT檢測結(jié)果呈陰性時，可以在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療后且CD4+T淋巴細(xì)胞計數(shù)超過200個/μl時復(fù)查 ELISPOT[21]。(2)對于擬進(jìn)行器官移植和慢性免疫介導(dǎo)的炎性疾病患者，應(yīng)在免疫抑制劑治療前進(jìn)行ELISPOT檢測[1,21]。(3)臨床研究時對免疫抑制劑使用患者，尤其是5歲以下兒童，可同時使用皮內(nèi)診斷試劑檢測[1,11,21]。該建議考慮了兩點：其一是美國FDA的指南和美國兒科學(xué)會均推薦在5歲以下的兒童中優(yōu)先使用TST檢測，說明該試劑檢測有一定的意義。其二是在臨床總結(jié)中將TST檢測作為同型對照實驗，能更直觀的反映ELISPOT的敏感度和特異度，有利于對檢測結(jié)果作進(jìn)一步的解釋；并在研究結(jié)果中增加對免疫抑制劑使用患者的敏感度和特異度的分析，再結(jié)合同型對照試劑的檢測結(jié)果和臨床確診結(jié)果進(jìn)行評價。

二、實驗方法影響因素的風(fēng)險管理

1. 細(xì)胞計數(shù)方式(人工、儀器)的影響：ELISPOT檢測細(xì)胞計數(shù)可在細(xì)胞染色后人工計數(shù)或儀器計數(shù)。人工計數(shù)時，由于顯微鏡觀察的視野為平面而細(xì)胞是立體的，有時難以確定細(xì)胞狀態(tài)導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果不準(zhǔn)確；當(dāng)細(xì)胞分離狀態(tài)不好有碎片時，也可能會影響計數(shù)的準(zhǔn)確性；若加樣前未充分混勻，細(xì)胞沉積會導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果偏低，影響檢測效果。儀器計數(shù)較人工計數(shù)相對準(zhǔn)確，但若細(xì)胞濃度過高或過低時，計數(shù)結(jié)果準(zhǔn)確性也會降低；當(dāng)樣本檢測結(jié)果位于灰區(qū)(細(xì)胞濃度過高)時，可能會導(dǎo)致假陽性，而細(xì)胞濃度過低時，也可能會導(dǎo)致假陰性。

2.斑點判讀方式的影響：ELISPOT檢測斑點數(shù)的判讀方式可分為人工和儀器兩種。人工判讀是使用放大鏡放大圖像，肉眼觀察斑點進(jìn)行判讀。儀器判讀是掃描斑點圖后根據(jù)設(shè)置自動判讀，再人工復(fù)核。由于儀器判讀時放大倍數(shù)較大，斑點圖像更清晰，判讀更準(zhǔn)確，尤其是灰區(qū)樣本，人工判讀和儀器判讀結(jié)果可能會有偏差。

3.加樣后混勻方式的影響：ELISPOT檢測加樣操作分別為加入刺激物和淋巴細(xì)胞并將之混合均勻，有幾種操作方式：(1)應(yīng)輕拍或輕晃加樣板，但也有樣本污染的風(fēng)險，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致相鄰的樣本混合：(2)用移液槍尖吸打，但槍尖尖銳，反復(fù)吸打可能造成細(xì)胞損傷，降低細(xì)胞活力，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡；(3)使用96孔板恒溫震蕩儀混勻樣液時需注意轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速過高可能會造成細(xì)胞損傷。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)建議在檢測開展前，尤其是大規(guī)模的臨床研究，應(yīng)提前進(jìn)行實驗條件的優(yōu)化，在SOP中需限定采用同品牌同型號儀器，并設(shè)定同一參數(shù)檢測。(2)若無細(xì)胞計數(shù)或斑點計數(shù)儀器，可采用雙人獨立完成再對比復(fù)核的方式計數(shù)。

三、環(huán)境設(shè)施和儀器等影響因素的風(fēng)險管理

1.ELISPOT試劑的儲存與運輸：ELISPOT試劑需要低溫存放。若試劑在儲存和運輸過程中，冰箱或冷鏈車輛的制冷裝置出現(xiàn)故障，環(huán)境溫度過高可造成試劑長時間暴露在高溫中，或溫度過低導(dǎo)致試劑凍結(jié)，或試劑取出后放置室溫時間過長等，這些非正常因素均可能影響試劑的檢測結(jié)果。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)試劑儲放冰箱和冷鏈車輛宜有自動記錄與自動報警裝置，運輸時應(yīng)備有應(yīng)急車輛；(2)應(yīng)制定儀器或裝置的故障應(yīng)急程序，該程序應(yīng)明確在何種情況下試劑不再使用或經(jīng)何種驗證后方可恢復(fù)使用；(3)操作SOP時，應(yīng)明確試劑取出后在室溫下操作的時長，在實驗原始記錄中應(yīng)能體現(xiàn)，以便在結(jié)果異常時可溯源分析。

2.其他因素的風(fēng)險管理：(1)ELISPOT檢測外周血單個核細(xì)胞的提取和培養(yǎng)均需潔凈環(huán)境，若超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱或潔凈室清潔度不夠，可能導(dǎo)致污染的發(fā)生，影響檢測結(jié)果。(2)若在細(xì)胞培養(yǎng)時，CO2培養(yǎng)箱發(fā)生故障致溫度異常，或CO2氣體耗盡但又無法補充，均可能導(dǎo)致細(xì)胞生長異常，影響檢測結(jié)果。(3)ELISPOT試劑檢測時還需試驗人員自備淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)。它是分離外周血淋巴細(xì)胞的關(guān)鍵試劑，若質(zhì)量好則細(xì)胞回收率高，質(zhì)量不好則細(xì)胞回收率低，可能會影響檢測結(jié)果的可靠性[5]。

可以應(yīng)對的風(fēng)險控制措施：(1)承擔(dān)臨床試驗和臨床檢測的操作人員應(yīng)進(jìn)行專門的實驗和儀器操作規(guī)范培訓(xùn)；實驗操作、儀器維護(hù)和人員進(jìn)出均嚴(yán)格按照細(xì)胞實驗室操作規(guī)范進(jìn)行。(2)在開展臨床試驗前應(yīng)對潔凈室和儀器進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)和清潔處理，確認(rèn)潔凈室和儀器處于正常狀態(tài)。(3)試劑采購前經(jīng)預(yù)實驗確認(rèn)性能應(yīng)符合規(guī)定，采購后均按規(guī)定放置，且需注意有效期。(4)CO2培養(yǎng)箱宜有自動記錄與自動報警裝置，在資金允許的情況下最好購置備用儀器以應(yīng)對緊急情況。

四、小結(jié)

受試者的病原學(xué)狀態(tài)，抗結(jié)核藥物治療進(jìn)程和是否使用免疫抑制劑等是ELISPOT試劑使用的關(guān)鍵性風(fēng)險點。環(huán)境設(shè)施、儀器耗材和檢測方法涉及到試劑的儲存運輸、實驗操作和質(zhì)量控制，也可能影響到ELISPOT試劑的檢測結(jié)果。臨床檢測和臨床研究時，應(yīng)針對這些風(fēng)險點，采取相應(yīng)的風(fēng)險控制措施，保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。

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(本文編輯：孟莉 薛愛華)

Risk assessment and control of interferon-γ release enzyme-linked immunospot assay in its clinical applications for TB detection

YANGLei,LUJin-biao,DUWei-xin,WANGGuo-zhi,CHENBao-wen.

DivisionofTnberculosisVaccins,NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050,China

CHENBao-wen,Email:bwchen@126.com

In order to reduce the risk of the interferon-γ enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay when it is used for detection of patients with tuberculosis (TB) in clinical trial or clinical diagnosis, we did a risk assessment through risk identification and analysis to the factors that may affect the test results, such as the subjects who received ELISPOT test, the test methods, environmental facilities and instruments, etc. and then we put forward the corresponding risk control measures.

Tuberculosis; Interferon-gamma; Enzyme-linked immunospot assay; Risk assessment; Quality control

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.020

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室

陳保文，Email：bwchen@126.com

2017-03-03)