李天菲，韓 靜，林 田，夏 輝，周 麗，劉國蘭，王加紅，羅利軍

（上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海 201106）

建立高效節(jié)水抗旱稻花藥培養(yǎng)體系的研究

李天菲，韓 靜，林 田，夏 輝，周 麗，劉國蘭，王加紅，羅利軍*

（上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海 201106）

以14個(gè)節(jié)水抗旱稻主要育種親本/組合為材料，對不同花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基、低溫預(yù)處理時(shí)間、熱激處理時(shí)間等影響花藥培養(yǎng)力的條件進(jìn)行單因素研究。結(jié)果表明：花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基M84（M8為基本培養(yǎng)基，附加2，4-D 2 mg/L、NAA 3 mg/L、KT 1 mg/L、脯氨酸300 mg/L、谷氨酰胺500 mg/L、水解酪蛋白300 mg/L、55 g/L麥芽糖和植物凝膠4 g/L）的愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力最高，且與其他4個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基存在顯著差異；花藥接種前低溫預(yù)處理能普遍提高花藥愈傷誘導(dǎo)率，8—10℃預(yù)處理7 d，花藥培養(yǎng)力最高，且與對照差異顯著；花藥接種后熱激處理24 h的愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力最高，且與其他處理及對照存在顯著差異。

節(jié)水抗旱稻；花藥培養(yǎng)；高效培養(yǎng)體系

花藥培養(yǎng)是指把發(fā)育到一定階段的花藥，通過無菌操作技術(shù)接種到人工配置的培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)其花粉（小孢子）形成愈傷組織，進(jìn)而分化成完整植株的過程［1］?；ㄋ幣囵B(yǎng)（簡稱“花培”）過程中，單倍體植株經(jīng)染色體自然加倍或人工加倍能夠得到純合二倍體，這種由染色體加倍獲得的純合二倍體在遺傳上非常穩(wěn)定，其后代不發(fā)生性狀分離，因而在植物育種中的作用很大。例如能夠極早穩(wěn)定分離后代，快速獲得純系，縮短育種年限，提高選擇效率等。自1968年日本科學(xué)家新關(guān)和大野首次獲得水稻花培植株后［2］，水稻花培育種得到快速發(fā)展，花培作為一種實(shí)用有效的技術(shù)手段，在創(chuàng)造原始材料，選育新品種、新不育系、新恢復(fù)系，提純不育系和恢復(fù)系等方面都起到了作用，并取得了一定的成效。

節(jié)水抗旱稻（Water-saving and drought-resistance rice，WDR）是指既具有水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)特性，又具有旱稻節(jié)水抗旱特性的一種新的栽培稻品種類型。它是在水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，引進(jìn)旱稻的節(jié)水抗旱特性而育成的新品種［3］。在糧食安全備受關(guān)注，水資源匱乏與干旱普遍發(fā)生的的大環(huán)境下，水資源已成為我國水稻生產(chǎn)發(fā)展的瓶頸，節(jié)約水稻用水必然成為農(nóng)業(yè)節(jié)水的一條主要途徑與措施。因此，培育和推廣集高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲害、肥料高效吸收利用、抗逆等優(yōu)良性狀于一體的節(jié)水抗旱稻新品種，穩(wěn)定和提高中低產(chǎn)田的產(chǎn)量水平，是育種家一項(xiàng)新的任務(wù)和挑戰(zhàn)，對于建設(shè)我國新型節(jié)水環(huán)保農(nóng)業(yè)具有重大的意義。

為了加快節(jié)水抗旱稻改良育種的步伐，將常規(guī)育種與花培育種的技術(shù)相結(jié)合，可解決生產(chǎn)中的實(shí)際問題，為種質(zhì)創(chuàng)新及新品種的選育提供技術(shù)支撐，也可實(shí)現(xiàn)育種程序的新突破。本研究以主要節(jié)水抗旱稻親本及雜交后代為材料，從花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)化篩選、低溫預(yù)處理時(shí)間、熱激處理等方面進(jìn)行試驗(yàn)評價(jià)，以期建立一套廣泛適用于不同節(jié)水抗旱稻基因型的花培技術(shù)體系。

1 材料與方法

1．1 試驗(yàn)材料

節(jié)水抗旱稻改良材料及雜交后代，包括節(jié)水抗旱稻改良育種中使用的親本品種及雜交后代材料。具體材料編號及來源見表1。

表1 供試節(jié)水抗旱稻及其親本材料Table 1 Test materials of water-saving drought-resistant rice and their parents

1．2 外植體的取材及低溫預(yù)處理

晴天早晨露水未干時(shí)或傍晚田間取穗，穗子位于苞內(nèi)約2/3處，不破口；穗子中段穎殼為淡綠色；花藥淡黃色。田間取穗后立即放入裝有清水的桶中，以避免穗子失水。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用70%酒精棉球簡單擦拭葉片和葉鞘（不要太濕），保留前1—2張葉片，然后用潮濕的紗布和塑料薄膜依次包好，放在8—10℃冰箱中低溫處理3—14 d。

1．3 花藥的滅菌及接種

將低溫處理后的穗子剝?nèi)ト~鞘，挑揀出小穗花藥處于單核靠邊期的枝梗進(jìn)行滅菌。具體滅菌方法為：先用70%酒精浸泡30—60 s進(jìn)行表面消毒，再依次用新鮮配制的1%次氯酸鈉和3%雙氧水分別浸泡振蕩20 min和10 min，最后用無菌水沖洗4—5次。穗子滅菌后，在超凈臺內(nèi)吹15 min左右，至穎殼表面較干爽，采用剪穎抖花藥法將花藥接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1．4 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)及熱激處理

采用對秈稻基因型適應(yīng)性較好的M8培養(yǎng)基［4］作為基本培養(yǎng)基，并針對節(jié)水抗旱稻材料，調(diào)整激素和附加營養(yǎng)元素的配比，具體愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基見表2。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為25℃黑暗培養(yǎng)。

表2 五種花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比Table 2 Hormore combination in 5 anther callus induction mediamg·L－1

熱激處理方法：將接種好的花藥放入30—32℃暗培養(yǎng)箱，熱激處理12—48 h。熱激結(jié)束后，將花藥放置于25℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)20—30 d，直至長出愈傷。

1．5 花藥愈傷的分化培養(yǎng)

將生長至2 mm左右的花藥愈傷轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為5 000—6 000 lx，光照周期為14 h/d，培養(yǎng)溫度為25℃。水稻愈傷分化培養(yǎng)基配方為MS基本培養(yǎng)基+6-BA 2.0 mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L，水解酪蛋白1.0 g/L，麥芽糖30 g/L，植物凝膠phytagel 3.8 g/L，pH為6.0。

1．6 花培苗的生根壯苗及移栽

將長至約5—8 cm的小苗轉(zhuǎn)入生根壯苗培養(yǎng)基，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.1 mg/L，蔗糖20 g/L，植物凝膠phytagel 3.8 g/L，pH為6.0。生根培養(yǎng)條件為光照強(qiáng)度5 000—6 000 lx，光照周期14 h/d，培養(yǎng)溫度25℃。

花培苗長至13 cm左右，3片真葉以上，根系新鮮發(fā)達(dá)時(shí)，可將幼苗移出試管。將根部的培養(yǎng)基完全洗凈，剪去老根和過長的葉片，僅保留3 mm左右的根，放置于清水中養(yǎng)根煉苗3—5 d，再移栽土中，移栽后注意遮陰，淺水養(yǎng)苗生根，至葉尖吐水完全成活。

1．7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

愈傷誘導(dǎo)率＝長出的愈傷組織塊數(shù)/接種花藥枚數(shù)×100%

綠苗分化率＝長出的綠苗叢數(shù)/分化的愈傷組織塊×100%

花藥培養(yǎng)力＝愈傷誘導(dǎo)率×綠苗分化率

為符合正態(tài)分布、方差齊性等基本的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)假設(shè)，將每個(gè)材料每組處理中數(shù)值最高的數(shù)據(jù)定為1，同樣處理?xiàng)l件下的其他數(shù)據(jù)與之相比得到相應(yīng)比值。轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)利用Excel 2003和SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選與優(yōu)化

從表3可以看出，以M8為基本培養(yǎng)基的5個(gè)花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，T1-1、T1-2兩個(gè)粳稻組合的愈傷誘導(dǎo)率大多在20%以上，最高可達(dá)46.92%，顯著高于T1-3、T1-4、T1-5和T1-6四個(gè)秈稻品種/組合。秈稻來源的品種花藥愈傷誘導(dǎo)率大多在10%以下。綠苗分化率在粳稻材料和秈稻材料中差異不大，其中T1-4的綠苗得率最高。5種誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下，T1-4的綠苗分化率均在30%以上，其中M85誘導(dǎo)的愈傷綠苗分化率高達(dá)50.75%。

表3 節(jié)水抗旱稻材料在5種不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的花藥愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力Table 3 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice in 5 different callus induction media

從圖1可以看出，5種花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，M84的愈傷誘導(dǎo)率最高，與其他4個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基存在顯著差異。M85誘導(dǎo)的愈傷分化時(shí)綠苗分化率最高，M83綠苗分化率最低，其他3個(gè)誘導(dǎo)培養(yǎng)基的愈傷綠苗分化率水平居中，且無顯著差異。在花藥培養(yǎng)力方面，M84最高，與其他4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基存在顯著差異。因此，在以上試驗(yàn)材料的花藥培養(yǎng)過程中，M84培養(yǎng)基是最合適的花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖1 不同花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下平均愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力比較Fig．1 Comparison of average callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different callus induction media

2．2 低溫預(yù)處理時(shí)間對節(jié)水抗旱稻花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響

為了比較低溫處理效果及篩選合適的低溫處理時(shí)間，將田間取回的穗子立即放入8—10℃冰箱中低溫處理3—14 d，并與對照（不進(jìn)行低溫處理）比較，通過比較誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力的差異，來確定最佳的低溫預(yù)處理時(shí)間。

從表4可以看出，花藥接種前進(jìn)行低溫預(yù)處理，相比對照能普遍提高花藥愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力，但低溫處理最適時(shí)長因試驗(yàn)材料不同而有所不同。T2-2、T2-3、T2-4、T2-5低溫處理3 d后，愈傷誘導(dǎo)率比對照提高，處理7 d后愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到最高，隨后繼續(xù)處理至14 d時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率又表現(xiàn)出降低的趨勢。T2-6的愈傷誘導(dǎo)率隨著低溫處理天數(shù)的增加而逐漸提高，處理14 d愈傷誘導(dǎo)率最高。T2-1低溫處理3 d誘導(dǎo)率比對照提高，但處理7 d和14 d后誘導(dǎo)率都比對照低。

表4 不同低溫預(yù)處理時(shí)間下節(jié)水抗旱稻材料花藥愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力Table 4 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice of different low temperature pre-treatment

通過表4與圖2可以看出，8—10℃低溫處理3 d后愈傷誘導(dǎo)率與對照無顯著差異，處理7 d和14 d的愈傷誘導(dǎo)率無顯著差異，但比對照有顯著提高，其中處理7 d條件下花藥愈傷誘導(dǎo)率最高。低溫處理時(shí)間7 d時(shí)綠苗分化率最高，但不同處理間差異并不顯著。低溫處理7 d的花藥培養(yǎng)力最高，且與對照差異顯著。

2．3 不同熱激時(shí)間對節(jié)水抗旱稻花藥愈傷誘導(dǎo)率的影響

從表5可以看出，熱激處理24 h和36 h條件下，5個(gè)節(jié)水抗旱稻組合的愈傷誘導(dǎo)率均比對照（未處理）有所提高；熱激48 h，僅T3-5的愈傷誘導(dǎo)率比對照降低，其他材料都比對照高。說明熱激處理對提高花藥愈傷誘導(dǎo)率的作用比較明顯。在試驗(yàn)中還觀察到，熱激后花藥出愈時(shí)間明顯比對照有所提前，一般可提前3 d左右。但不同熱激時(shí)間下，出愈時(shí)間比對照提前的時(shí)間長短差異不顯著（數(shù)據(jù)未列出）。

圖2 不同低溫處理時(shí)間下平均愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力的比較Fig．2 Comparison of callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different low temperature pre-treatments

表5 不同熱激處理對節(jié)水抗旱稻愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力的影響Table 5 Anther callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability of water-saving drought-resistant rice of different heat shock time

從圖3可以看出，花藥接種后熱激處理24 h的愈傷誘導(dǎo)率最高，且與熱激36 h、熱激48 h及對照的愈傷誘導(dǎo)率差異顯著。所有熱激處理和對照條件下愈傷的綠苗分化率無顯著差異。熱激24 h處理?xiàng)l件下的花藥培養(yǎng)力最高，且與其他處理及對照有顯著差異。從圖3還可以看出，花藥接種后進(jìn)行30℃熱激處理至48 h，隨著處理時(shí)間的延長，愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，其中處理24 h達(dá)到最高值，繼續(xù)熱激至36 h，愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力有所下降，處理至48 h后與對照相當(dāng)。

圖3 不同熱激處理時(shí)間下平均愈傷誘導(dǎo)率、綠苗分化率和花藥培養(yǎng)力的比較Fig．3 Comparison of callus induction rate，green seedling differentiation rate and anther culture ability among different heat shock time

3 結(jié)論與討論

水稻花藥培養(yǎng)中，愈傷誘導(dǎo)率是花藥培養(yǎng)力的一個(gè)主要限制因子。特別是秈稻品種花藥培養(yǎng)能力低，愈傷誘導(dǎo)率一般不到1%，平均培養(yǎng)力只有0.5%左右［5］。雖然不同基因型的秈稻品種愈傷誘導(dǎo)率及成苗率有差異，但總體花培效果仍遠(yuǎn)不及粳稻。本試驗(yàn)針對如何提高愈傷誘導(dǎo)率，優(yōu)化了激素及營養(yǎng)元素配比，得到改良的水稻花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基M84。目前已成功誘導(dǎo)300余份節(jié)水抗旱稻品種/組合的花藥愈傷，其中秈型節(jié)水抗旱稻的花藥愈傷誘導(dǎo)率平均為5%—8%，最高可達(dá)20%，秈粳雜交型節(jié)水抗旱稻的花藥愈傷誘導(dǎo)率在10%以上，粳型節(jié)水抗旱稻的花藥愈傷誘導(dǎo)率平均可達(dá)20%—30%。

在小孢子發(fā)育的單核靠邊期進(jìn)行低溫預(yù)處理是有效提高花培效率的手段。GENOVESI等［6］認(rèn)為低溫預(yù)處理能顯著提高花藥的誘導(dǎo)率。姚炎等［7］研究也表明，水稻花藥培養(yǎng)過程中，藥壁組織容易發(fā)生褐變，影響花藥愈傷組織的形成。在花藥培養(yǎng)前期低溫預(yù)處理可有效緩解藥室內(nèi)壁結(jié)構(gòu)的降解速度，減緩褐變發(fā)生，有利于花粉脫分化。季彪俊等［8］認(rèn)為秈稻原產(chǎn)熱帶對低溫較敏感，處理時(shí)間不宜過長，在8—10℃下處理7—10 d為宜。本研究也印證了此觀點(diǎn)，秈型節(jié)水抗旱的花藥培養(yǎng)，8—10℃低溫預(yù)處理7 d愈傷誘導(dǎo)率最高。

花藥接種后進(jìn)行熱激處理的主要作用是加快啟動(dòng)小孢子分裂，加快愈傷形成，提高愈傷誘導(dǎo)率［9］。本試驗(yàn)將花藥接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基后進(jìn)行24 h、36 h和48 h的熱激處理（30℃），熱激24 h的愈傷誘導(dǎo)率和花藥培養(yǎng)力最高，并與其他處理有顯著差異。而且熱激處理能明顯提早愈傷形成，但熱激過長（48 h）會(huì)影響愈傷的質(zhì)量，降低綠苗分化率，從而使得花藥培養(yǎng)力下降。

本研究建立的高效花藥培養(yǎng)體系，對節(jié)水抗旱稻特別是秈型節(jié)水抗旱稻有廣泛的適應(yīng)性，在節(jié)水抗旱稻育種中已發(fā)揮了一定作用，但仍然存在花培受體特異性的問題。例如試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，含有秈稻‘滬旱3號’系列的組合普遍易誘導(dǎo)，花藥培養(yǎng)力比較高，而含有秈稻‘滬旱1B’血緣的材料都較難誘導(dǎo)。同時(shí)也觀察到恢復(fù)系材料比保持系材料花藥培養(yǎng)力高的現(xiàn)象。這個(gè)現(xiàn)象是否具有普遍性，其中的生物學(xué)機(jī)理又是怎樣，還需要進(jìn)一步研究。而且高效的花藥培養(yǎng)體系不僅僅依賴于培養(yǎng)基的改良，或低溫、熱激等處理手段，還應(yīng)從包括取材、滅菌、前處理、接種和煉苗移栽等各方面進(jìn)行重視和規(guī)范。今后花藥培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展必須同分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)等學(xué)科更緊密結(jié)合，從分子機(jī)制上深入了解小孢子發(fā)育基因調(diào)控，才有可能真正克服諸如受體特異性、白化苗等問題，使這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用到更廣泛的植物品種中，并在育種發(fā)揮更重要的作用。

［1］羅瓊，曾千春，周開達(dá)，等.水稻花藥培養(yǎng)及其在育種中的應(yīng)用［J］.雜交水稻，2000，15（3）：1-2.

［2］姜健，金成海，候春香，等.水稻花藥培養(yǎng)研究與應(yīng)用進(jìn)展［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2001，17（4）：49-52.

［3］羅利軍，梅捍衛(wèi)，余新橋，等.節(jié)水抗旱稻及其發(fā)展策略［J］.科學(xué)畫報(bào)，2011，56（11）：804-811.

［4］梅傳生，張金渝，吳光南.秈稻花培綠苗率的提高［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1988，4（2）：45-48.

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［8］季彪俊，陳啟鋒，黃群策，等.水稻花藥培養(yǎng)技術(shù)的總結(jié)與探討［J］.福建農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，30（1）：22-28.

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（責(zé)任編輯：閆其濤）

Establishment of efficient anther culture system for water-saving and drought-resistance rice

LI Tian-fei，HAN Jing，LIN Tian，XIA Hui，ZHOU Li，LIU Guo-lan，WANG Jia-hong，LUO Li-jun*
（Shanghai Agrobiological Gene Center，Shanghai 201106，China）

Effects of different callus induction media，low temperature pretreatment and heat shock treatment on anther culture ability were studied taking 14 breeding parents and hybridized combination of water-saving and drought-resistance rice（WDR）as materials.The results indicated that the callus induction rate and anther culture ability of anther callus induction medium M84 were the highest，and there were significant differences between the other 4 induction medium treatments.The induction rate of anther callus could be improved by low temperature pretreatment before anther inoculation，the anther culture ability was the highest with 8—10℃low temperature pre-treatment for 7 d，and there was significant difference between CK.The callus induction rate and anther culture ability of heat shock treatment 24 h after anther inoculation were the highest，and there were significant differences between the other treatments and CK.

Water-saving drought-resistant rice；Anther culture；Efficient culture system

S511.035

A

1000-3924（2016）06-037-06

2015-07-13

科技部國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2014AA10A603）；國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2014ZX08001003-004）

李天菲（1976—），女，碩士，副研究員，主要從事水稻遺傳改良研究

*通信作者，E-mail：lijun＠sagc.org.cn