蔣紅波，馮英財，劉世火，王進軍

（1西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶400715；2重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020）

柑橘全爪螨PcSOD3的異源表達及其重組酶的抗氧化活性

蔣紅波1，馮英財2，劉世火1，王進軍1

（1西南大學(xué)植物保護學(xué)院，重慶400715；2重慶出入境檢驗檢疫局，重慶400020）

【目的】筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨在極端溫度、殺螨劑、重金屬和紫外線脅迫下，其體內(nèi)PcSOD3表達顯著上調(diào)，暗示PcSOD3在柑橘全爪螨應(yīng)對不良環(huán)境脅迫的過程中起著至關(guān)重要的作用。為了進一步明確 PcSOD3的生理功能，本研究開展了該基因的異源表達及重組酶生化特性的分析工作。【方法】構(gòu)建pET28a-PcSOD3重組表達質(zhì)粒，并在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達。隨后利用鎳柱親和層析法分離純化PcSOD3重組酶，采用Western blot對純化蛋白進行驗證。使用WST-1法分析PcSOD3重組酶的抗氧化活性，測定不同反應(yīng)體系pH及不同前處理溫度下PcSOD3重組酶的活性。采用氯化鉻、叔丁基過氧化氫和過氧化氫異丙苯3種氧化性藥劑，誘導(dǎo)大腸桿菌細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并利用Kirby-Bauer紙片瓊脂糖擴散法測定上述3種藥劑對過表達PcSOD3大腸桿菌的抑制效果?！窘Y(jié)果】在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中成功表達PcSOD3，研究摸索出PcSOD3重組蛋白最適誘導(dǎo)表達條件：誘導(dǎo)表達溫度為18℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，當OD值達0.6時加入IPTG并使其終濃度為0.4 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間為18 h。Western blot驗證結(jié)果表明所純化重組蛋白即為PcSOD3重組酶，重組蛋白大小為25.3 kD。WST-1法測得PcSOD3重組酶活性在pH=7.0的反應(yīng)體系中最高，約為47.3 U/mg protein，而在前處理溫度為25℃時，PcSOD3重組酶活性最高為40.2 U/mg protein。利用K-B紙片瓊脂糖擴散法進行了藥敏試驗，結(jié)果顯示氯化鉻對過量表達PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈均顯著小于對空載體對照產(chǎn)生的抑菌圈，通過測量發(fā)現(xiàn)抑菌圈較對照縮小近20%；在150 mmol·L-1濃度下叔丁基過氧化氫對過量表達PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈與對照相比縮小約25%；而濃度為200 mmol·L-1的過氧化氫異丙苯對過量表達PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈與對照相比則縮小約15%。【結(jié)論】成功在大腸桿菌中實現(xiàn)了PcSOD3的功能性表達，并純化獲得了PcSOD3重組蛋白。明確了PcSOD3重組酶最適反應(yīng)pH及最適前處理溫度等生化特性，WST-1法證明PcSOD3重組蛋白在離體條件下具有顯著的抗氧化活性，而K-B紙片瓊脂糖擴散法則證明過表達PcSOD3的大腸桿菌抗氧化能力顯著增強，說明PcSOD3具有抗氧化功能。研究結(jié)果進一步揭示PcSOD3在柑橘全爪螨抗氧化損傷過程中具有重要作用。

柑橘全爪螨；超氧化物歧化酶；生化特性；重組蛋白；藥敏試驗

0 引言

【研究意義】柑橘全爪螨（Panonychus citri）又名柑橘紅蜘蛛，是一種世界性分布的害螨[1]。由于柑橘全爪螨具有對環(huán)境適應(yīng)性強、寄主范圍廣及發(fā)生持續(xù)時間長等特點，曾一度為美國柑橘作物上最為嚴重的經(jīng)濟害螨之一[2-3]。另外，在歐洲、澳大利亞等熱帶及亞熱帶地區(qū)都有柑橘全爪螨發(fā)生危害。在中國，柑橘全爪螨危害柑橘長達50多年，在福建、重慶、江西、浙江等主要產(chǎn)業(yè)基地危害尤為嚴重[4]。盡管可以使用捕食螨等對其進行生物防治[4-5]，但目前對該螨最有效的控制方法仍是化學(xué)防治。許多研究指出，由于農(nóng)藥的大量長期和不合理使用，柑橘全爪螨對多種常用殺螨劑已產(chǎn)生了嚴重的抗藥性，對其防治工作提出了更高的要求[6-7]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶系，在節(jié)肢動物適應(yīng)各種不良環(huán)境，如重金屬脅迫[8]、溫度脅迫[9-10]、農(nóng)藥脅迫[11-12]以及紫外線脅迫[13]等過程中起著非常重要的作用。因此，對柑橘全爪螨SOD基因進行異源表達，研究其抗氧化功能，對揭示SOD在柑橘全爪螨環(huán)境適應(yīng)性增強、抗藥性發(fā)展中的作用具有重要意義。【前人研究進展】中華蜜蜂（Apis cerana cerana）幼蟲和蛹通過上調(diào)SOD3基因表達量以應(yīng)對氯化汞（HgCl2）脅迫[14]；意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）在生長發(fā)育過程中，食物中較高水平蛋白供給能夠顯著增強幼蟲的抗氧化活性[15]；德國小蠊（Blattella germanica）通過上調(diào) SOD基因能應(yīng)對高效氯氰菊酯脅迫[16]；橘小實蠅（Bactrocera dorsalis）多個SOD基因在阿維菌素、高效氯氰菊酯和馬拉硫磷等脅迫條件下均出現(xiàn)了不同程度的表達上調(diào)[17]；褐飛虱（Nilaparvata lugens）若蟲在受到高溫脅迫時，其SOD活性顯著升高，且活性隨著溫度的升高而上升[18]；在紫外線脅迫下，果蠅（Drosophila melanogaster）SOD2基因、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）SOD3基因的表達量顯著提高[13,19]。近年來，原核表達系統(tǒng)作為重要技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于SOD基因功能的研究。例如，在大腸桿菌中過量表達果蠅CuZnSOD可以顯著減少百草枯對大腸桿菌的氧化損傷[20]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柑橘全爪螨在極端溫度脅迫下SOD活性顯著增強[10]。最近，筆者課題組克隆獲得了3個柑橘全爪螨SOD基因cDNA全序列，解析了其轉(zhuǎn)錄子在極端溫度、殺螨劑、重金屬和紫外線脅迫下的表達模式，發(fā)現(xiàn)3個SOD基因均有不同程度的上調(diào)。其中 PcSOD3上調(diào)幅度最大，暗示 PcSOD3在柑橘全爪螨應(yīng)對不良環(huán)境脅迫的過程中可能起著至關(guān)重要的作用[21]。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建pET28a-PcSOD3重組表達質(zhì)粒，在大腸桿菌 BL21（DE3）菌株中實現(xiàn)異源表達，并分離純化 PcSOD3重組酶。經(jīng)Western blot驗證后，利用WST-1法測定PcSOD3重組酶的抗氧化活性，以期進一步明確PcSOD3的生理功能。

1 材料與方法

試驗于2015年8月至2016年4月在西南大學(xué)昆蟲分子生態(tài)實驗室完成。

1.1 供試螨源

供試柑橘全爪螨為室內(nèi)飼養(yǎng)品系，該品系于2008年采集自位于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑橘研究所苗圃，帶回后轉(zhuǎn)接到西南大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園網(wǎng)室中的枳殼苗上，供試前該品系未接觸任何化學(xué)藥劑。

1.2 主要試劑

高保真DNA聚合酶PrimerSTARTMMax Premix購自TaKaRa公司，限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III購自NEB公司，pET28a原核表達載體購自Novagen公司，T4 DNA連接酶購自Promega公司，原核表達用BL21（DE3）菌株購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，重組蛋白提取試劑盒 QIAexpress? Ni-NTA Fast Start購自Qiagen公司，轉(zhuǎn)膜試劑Trans-Blot?TurboTMRTA Mini PVDF Transfer Kit購自Bio-Rad公司，重組蛋白Western印跡試劑如6×組氨酸標簽鼠源一抗、HRP標記的兔抗鼠二抗以及化學(xué)發(fā)光檢測試劑BeyoECL star均購自江蘇碧云天生物技術(shù)公司，SOD活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。藥敏試驗中所用藥劑無水氯化鉻（chromic chloride，CdCl2）購自成都市科龍化工試劑廠，叔丁基過氧化氫（t-butylhydroperoxide）和過氧化氫異丙苯（cumene hydroperoxide）均購自Sigma公司。

1.3 表達載體構(gòu)建

根據(jù)筆者課題組前期測序獲得的柑橘全爪螨PcSOD3的 cDNA 序列（GenBank登錄號為KJ700411）[21]，采用在線軟件SignalP4.1預(yù)測其編碼氨基酸序列的信號肽，并設(shè)計PCR引物擴增編碼成熟肽的 cDNA片段。其中，上下游引物 5′端分別加入BamH I與Hind III酶切位點（下劃線部分）。上游引物為5′-CGGGATCC GCTCACAAATTACCCGATTTAC-3′，下游引物為5′-CCAAGCTT TTAAGATTTTGATCTAG CTAATCGATC-3′。以柑橘全爪螨第一鏈cDNA為模板，利用高保真酶PrimerSTARTMMax Premix進行目的片段擴增，反應(yīng)體系與條件均按照試劑盒說明書進行。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認片段大小后，采用TaKaRa核酸純化試劑盒進行純化備用。隨后，直接利用BamH I與Hind III對純化后的PCR產(chǎn)物和pET28a載體分別進行雙酶切，其中BamH I與Hind III對 PcSOD3雙酶切進行 20 h以保證酶切效率，而pET28a載體酶切時間為4 h。利用核酸純化試劑盒及膠回收試劑盒對酶切后的PcSOD3和pET28a載體分別進行純化，并使用T4 DNA連接酶進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入Trans 5α菌株，接種到含有30 μg·mL-1卡那霉素（Kanamycin）的培養(yǎng)基，在平板上挑取單菌落，PCR篩選陽性克隆后送公司測序確保獲得正確的pET28a-PcSOD3重組表達質(zhì)粒。

1.4 柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白誘導(dǎo)表達

將1.3中經(jīng)測序驗證的pET28a-PcSOD3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）菌株中用于誘導(dǎo)PcSOD3重組蛋白表達。首先將陽性克隆菌株涂布于含30 μg·mL-1卡那霉素的LB平板中，于37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落至含有250 mL培養(yǎng)基的1 L錐形瓶中擴大培養(yǎng)，當OD600達0.6時，加入100 mmol·L-1IPTG至終濃度為0.4 mmol·L-1，搖床參數(shù)設(shè)置為18℃，160 r/min，培養(yǎng)18 h，然后在4℃以4 000×g離心20 min收集菌體沉淀保存于-20℃冰箱備用。以pET28a空載體為對照，即pET28a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）表達菌株，并以相同條件誘導(dǎo)。

1.5 重組蛋白純化及驗證

1.5.1 重組蛋白純化 將 1.4中收集獲得的菌體沉淀，參照QIAexpress?Ni-NTA Fast Start重組蛋白純化試劑盒操作說明，獲得PcSOD3重組蛋白。簡言之，菌體沉淀于冰上融解后加入10 mL裂解液重懸，于冰上放置30 min使其充分裂解，隨后在4℃，14 000 ×g離心30 min分離破碎菌體沉淀，保留上清液，取5 μL上清液（標記為CL）用于SDS-PAGE以觀察目的蛋白的表達情況。剩余上清液全部倒入 Fast Start Column中，收集過柱液并取5 μL（標記為FT）用于SDS-PAGE以觀察蛋白過柱后的損失情況。隨后用2 mL Native Wash Buffer洗脫柱子，重復(fù)1次。收集2次的洗脫液各5 μL，分別加入5 μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，標記為 W1和 W2，-20℃保存用于SDS-PAGE分析。最后，使用 1 mL Native Elution Buffer洗脫收集重組蛋白，標記為E1，重復(fù)1次，標記為E2。同樣各取5 μL用于SDS-PAGE分析。將收集的空載體（P）、CL、FT、W1、W2、E1和E2電泳樣品放置水浴鍋中，煮沸3—5 min。待樣品冷卻后進行SDS-凝膠電泳，電壓為300 V，20—30 min。然后用考馬斯亮藍溶液對凝膠進行染色，完成后用脫色液脫色，直到凝膠的背景顏色由藍轉(zhuǎn)為透明為止，利用Bio-Rad凝膠成像儀拍照。

1.5.2 重組蛋白的Western印跡 取1.5.1中得到的重組蛋白液（E1）10 μL，采用 TGX Stain-Free polyacrylamide gels試劑盒制作免染凝膠和自發(fā)熒光Unstained Standards Marker進行電泳，結(jié)束后，可直接在電泳成像儀中觀察分析結(jié)果。按照轉(zhuǎn)膜試劑Trans-Blot?TurboTMRTA Mini PVDF Transfer Kit說明書對 SDS-PAGE電泳膠上的目的蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后可在凝膠成像儀中檢查轉(zhuǎn)膜情況。轉(zhuǎn)膜成功后，用Western洗滌液將PVDF膜漂洗2 min，以去除轉(zhuǎn)膜液。隨后，吸盡洗滌液并加入Western封閉液，4℃封閉過夜。用洗滌液多次洗滌 PVDF膜，吸盡洗滌液，然后加入由 Western一抗稀釋液稀釋1 000倍后的鼠抗6×組氨酸抗體，于室溫下在搖床上緩慢搖動孵育2 h。隨后，加入由Western二抗稀釋液稀釋1 000倍的HRP標記兔抗鼠二抗，于室溫下在搖床上緩慢搖動孵育2 h。最后，利用Western洗滌液清洗PVDF膜3次，每次5 min。洗滌完成后，將PVDF膜放置于干凈的透明保鮮膜上（盡量減少褶皺），用移液器滴加BeyoECL star化學(xué)發(fā)光顯色液，立刻將保鮮膜整體置于凝膠成像儀下拍照。

1.6 重組蛋白的生化特性測定

1.6.1 BSA蛋白濃度標準曲線制作 采用BCA法制作重組蛋白濃度測定的標準曲線，并利用此曲線對重組蛋白的濃度進行計算。在總體積為220 μL的測定體系中加入200 μL的BCA工作液中，再加入不同體積的濃度為 1 mg·mL-1的蛋白標準品（牛血清蛋白，BSA），剩余體積由濃度為0.1 mol·L-1、pH 7.4的PBS緩沖液補齊，將反應(yīng)液于37℃放置25 min，最終利用微量滴度酶標儀在562 nm處測定OD值，根據(jù)OD值在Excel中繪制標準曲線，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。測定重組蛋白濃度時，在200 μL的BCA工作液中加入5 μL重組蛋白液E1，5 μL PBS緩沖液（0.1 mol·L-1、pH 7.4），37℃孵育25 min，在562 nm下測定OD值，設(shè)置3次重復(fù)。最后，根據(jù)標準曲線求出PcSOD3蛋白濃度。

1.6.2 柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白酶活性測定 采用WST-1法測定PcSOD3的活性，試劑盒購自南京建成生物工程研究所，操作按照試劑盒說明書進行。于室溫下（25℃），向96孔微量酶標板中，分別加入下列試劑（表1）。根據(jù)測得的OD值，首先公式（1）計算SOD抑制率。在此反應(yīng)體系中，將SOD抑制率達50%時所對應(yīng)的酶量為定義為1個SOD活性單位（Unit，U），由此得到公式（2）計算SOD活性。

SOD抑制率（%）=

SOD活性（U·mg-1）= SOD抑制率÷50%×稀釋倍數(shù)

表1 柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白酶活性測定體系Table 1 The reaction system for the measurement of the activity of recombinant PcSOD3 of P. citri

1.6.3 溫度、pH對柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白酶活性的影響 為了探究溫度對柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白酶活性的影響，將純化的重組蛋白酶液與 PBS（pH 7.4）按照1∶9的體積比稀釋并混合均勻，分別置于15、25、35、45、55、65、75和85℃中水浴保溫1 h。然后將不同溫度處理后的重組蛋白酶液置于冰上，按照1.6.2中描述的方法測定酶活性。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

此外，為了明確不同pH對柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白酶活性的影響，使用不同pH的PBS溶液（pH設(shè)定為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0）稀釋10倍，于37℃水浴1 h，按照1.6.2中描述的方法測定酶活性。同樣，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。

1.7 紙片瓊脂糖擴散法藥敏試驗

為了明確PcSOD3重組蛋白酶在大腸桿菌中的過表達是否可以有效提高大腸桿菌的抗氧化能力，參考Kirby-Bauer法即 K-B紙片瓊脂糖擴散法測定了過表達PcSOD3的大腸桿菌對3種可造成氧化損傷的化學(xué)物的耐受能力。首先將 BL21（DE3）菌株中含有PcSOD3重組質(zhì)粒的陽性克隆在 1.4節(jié)條件下誘導(dǎo)重組蛋白表達4 h，取100 μL誘導(dǎo)表達后的菌液，均勻涂布在培養(yǎng)基平板（卡那霉素濃度為30 μg·mL-1），于37℃恒溫箱中倒置孵育1 h。將直徑6 mm的圓形濾紙片在培養(yǎng)基平板上在4個方向上均勻放置，然后將10 μL不同濃度（表2）的3種氧化藥劑按濃度梯度從高到低（氯化鉻：400、200、100和50 mmol·L-1；叔丁基過氧化氫：150、100、50和25 mmol·L-1；過氧化氫異丙苯：200、100、50和25 mmol·L-1），順時針方向分別滴在4張紙片，藥劑通過紙片不斷向其周圍區(qū)域擴散形成遞減的濃度梯度，因此在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)形成透明的抑菌圈。使用游標卡尺以十字交叉法測量抑菌圈直徑，抑菌圈直徑大小反映大腸桿菌對氧化藥劑的敏感程度。利用SPSS 16.0軟件中的t測驗方法對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（P＜0.05）。

表2 3種氧化性藥劑的濃度信息Table 2 The concentrations of three oxidizing reagents

2 結(jié)果

2.1 pET28a-PcSOD3重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用添加BamH I和Hind Ⅲ酶切位點的引物，以柑橘全爪螨cDNA為模板擴增PcSOD3的開放閱讀框（去除信號肽部分）。將pET28a載體（圖1-A）和由高保真DNA聚合酶擴增得到的PcSOD3目的片段（圖1-B）分別進行BamH I和Hind Ⅲ雙酶切。結(jié)果如圖1所示，其中PcSOD3目的片段約為750 bp，而經(jīng)過雙酶切的pET28a載體長度約為5.0 kb。酶切產(chǎn)物經(jīng)純化回收后，在T4 DNA連接酶作用下進行重組，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進入Trans 5α感受態(tài)細胞并接種到培養(yǎng)基平板（含30 μg·mL-1卡那霉素），然后對陽性克隆進行菌液PCR檢測（圖1-C），并抽提質(zhì)粒進行測序驗證。測序結(jié)果表明，PcSOD3正確插入pET28a中，且不含信號肽部分，據(jù)此成功構(gòu)建了pET28a-PcSOD3重組質(zhì)粒。

圖1 柑橘全爪螨pET28a-PcSOD3重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 1 Construction of the recombinant plasmid of pET28a-PcSOD3

2.2 PcSOD3重組蛋白的誘導(dǎo)表達和分離純化

根據(jù)分子量大小預(yù)測結(jié)果，原PcSOD3蛋白大小為24.8 kD，去掉線粒體轉(zhuǎn)運信號肽（3 kD），加上載體自帶的6×組氨酸標簽序列（3.5 kD），最后PcSOD3重組蛋白大小應(yīng)為25.3 kD。結(jié)果如圖2所示，在泳道CL、E1和E2中均檢測到大量重組蛋白，分子量約為25 kD，這與預(yù)期分子量大小基本一致。然而，pET28a空載體轉(zhuǎn)化的BL21（DE3）大腸桿菌中并未表達目的蛋白。此外，由于使用菌體裂解后的上清液進行重組蛋白的分離純化，表明重組蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達。

圖2 柑橘全爪螨PcSOD3重組蛋白的分離純化Fig. 2 Expression and purification of the recombinant protein of PcSOD3

2.3 PcSOD3重組蛋白的Western blot鑒定

重組蛋白液經(jīng)SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)到PVDF膜上，隨后利用6×組氨酸抗體對重組蛋白進行Western blot驗證。由圖3可見，在分子量約為25 kD附近出現(xiàn)了特異性的免疫印跡條帶，與PcSOD3重組蛋白預(yù)測分子量大小一致，說明該蛋白條帶即為PcSOD3重組蛋白。

圖3 PcSOD3重組蛋白的Western blot檢測Fig. 3 Confirmation of the PcSOD3 recombinant protein by Western blot

2.4 PcSOD3重組蛋白酶生化特性

根據(jù) Bradford法制作蛋白濃度標準曲線為y=1.03x+0.08（R2=0.999），其中y為562 nm下的吸光度，x為蛋白質(zhì)量。通過此標準曲線計算得到純化后的 PcSOD3重組蛋白濃度為 0.332 mg·mL-1。利用WST-1法測定了不同溫度處理1 h后，PcSOD3重組酶的活性。當處理溫度為25℃時，PcSOD3重組酶活性最高為40.2 U/mg protein。當處理溫度為15℃時，酶活性無顯著變化，但隨著處理溫度逐漸升高至45℃時，酶活性劇烈下降至25.0 U/mg protein。不過，處理溫度從45℃升至75℃的過程中，PcSOD3重組酶活性卻無顯著降低，處理溫度為85℃時，活性降至最低為20 U/mg protein（圖4-A）。PcSOD3重組酶活性在不同pH反應(yīng)體系中的變化呈拋物線趨勢，最高活性出現(xiàn)在pH 7.0的反應(yīng)體系中，約為47.3 U/mg protein。當反應(yīng)體系pH＜7.0時，PcSOD3重組酶活性隨反應(yīng)體系pH增加而逐漸增強；當反應(yīng)體系pH＞7.0時，PcSOD3重組酶活性隨反應(yīng)體系 pH增加而迅速下降（圖4-B）。上述結(jié)果表明PcSOD3重組酶的最適前處理溫度為25℃，最適反應(yīng)pH為7.0。

2.5 藥敏試驗

氯化鉻藥敏試驗結(jié)果表明（圖 5-A、5-A’），抑菌圈的大小隨著氯化鉻濃度的降低而減小。在所有氯化鉻測試濃度下，對過量表達PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈均顯著小于對空載體對照產(chǎn)生的抑菌圈（P＜0.05），平均較對照縮小近20%。叔丁基過氧化氫藥敏試驗結(jié)果與氯化鉻藥敏試驗非常相似，在150 mmol·L-1濃度下叔丁基過氧化氫對過量表達PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈與對照相比縮小約25%（圖5-B、5-B’）。同樣，過氧化氫異丙苯測試結(jié)果與前兩者結(jié)果類似，在測試的4個濃度中，濃度為200 mmol·L-1的過氧化氫異丙苯對過量表達 PcSOD3大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈與對照相比縮小約 15%（圖5-C、5-C’）。

3 討論

圖4 不同溫度及pH對PcSOD3重組蛋白活性的影響Fig. 4 The effects of various temperatures and pH values on the activities of the PcSOD3 recombinant protein

圖5 三種氧化藥劑K-B紙片擴散法藥敏試驗Fig. 5 Kirby-Bauer disc diffusion assays of three oxidative reagents

為了進一步驗證SOD基因的抗氧化功能，原核表達技術(shù)的運用在昆蟲的研究中非常普遍，例如在中華蜜蜂和煙粉虱（Bemisia tabaci）的研究中，通過獲得有活性的重組超氧化物歧化酶蛋白，發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的SOD基因具有抗氧化功能[14,22]。在家蠅（Musca domestica）的研究中，也通過原核表達獲得了具有活性的MnSOD重組蛋白，證明MnSOD在家蠅抗氧化脅迫過程中發(fā)揮了重要的功能[23]。另外，在大腸桿菌中過量表達果蠅的SOD基因，可以顯著提高重組菌株對百草枯的耐藥性，降低由氧化性藥劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化損傷[20]。中華蜜蜂SOD3基因在大腸桿菌中過量表達，可以顯著提高大腸桿菌細胞在過氧化氫異丙苯、氯化汞和氯化鉻脅迫過程中抗氧化應(yīng)激能力[14]。柑橘全爪螨對各種逆境表現(xiàn)出較強的適應(yīng)性，SOD基因在該過程中可能發(fā)揮重要的保護功能，利用基因過表達的研究方式，可以進一步闡釋基因的生物功能，但目前該技術(shù)在螨類的研究中應(yīng)用較少。本研究利用原核表達技術(shù)，開展了螨類SOD基因離體功能研究，結(jié)果對螨類SOD基因功能的探索具有重要參考價值。

大量研究表明在真核生物細胞中，蛋白質(zhì)在翻譯時，其 N-末端的轉(zhuǎn)運肽或信號肽結(jié)構(gòu)會引導(dǎo)新生的多肽進入到不同亞細胞器中或胞外，而信號肽隨即被相應(yīng)的酶水解，該結(jié)構(gòu)并不承擔蛋白本身的功能行使[24-25]。本研究采用BL21（DE3）大腸桿菌誘導(dǎo)表達PcSOD3重組蛋白，為了避免線粒體轉(zhuǎn)運信號肽對蛋白質(zhì)功能的影響，在構(gòu)建柑橘全爪螨PcSOD3原核表達載體時，筆者去除了其前體蛋白的分泌信號肽，成功構(gòu)建了pET28a-PcSOD3重組質(zhì)粒。

通過原核表達方式了解蛋白質(zhì)的功能，必須要解決的前提條件是獲得可溶性的重組蛋白。由于PcSOD3作為大腸桿菌的異源基因，表達量過高時，會出現(xiàn)二硫鍵不能正確配對，真核糖蛋白無法糖基化等原因，合成時易出現(xiàn)折疊錯誤，主要形成非可溶性的包涵體，包涵體并不具備蛋白質(zhì)的正常功能[26-28]。所以，要降低表達速率，通過降低溫度減小 IPTG濃度，增加培養(yǎng)液的含氧量，同時延長誘導(dǎo)時間，以獲得足量的且具有生物活性的可溶性重組蛋白[24]。不同蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上差異較大，要形成可溶性重組蛋白，誘導(dǎo)條件也相差甚遠，因此，原核表達前應(yīng)對最適誘導(dǎo)表達條件進行探索。本研究中，經(jīng)過前期大量摸索得到了適合PcSOD3表達的誘導(dǎo)條件，實踐證明該條件下PcSOD3能夠以可溶性蛋白的形式大量表達。

研究中獲得的重組蛋白，經(jīng)Western blot檢測，確定為PcSOD3重組蛋白。SOD酶活性測定試劑盒的原理是試劑本身反應(yīng)會產(chǎn)生自由基（O2-），SOD通過歧化該自由基生成O2和H2O2，從而發(fā)生顯色反應(yīng)。經(jīng)過不同 pH反應(yīng)體系和不同前處理溫度的測試，明確了PcSOD3重組酶的基礎(chǔ)生化特性，該重組蛋白在中性反應(yīng)體系中活性最高，最適前處理溫度為25℃。值得注意的是，在不同pH反應(yīng)體系中PcSOD3重組酶活性最高測得為47.3 U/mg protein，而在不同前處理溫度實驗中測得最高活性為 40.2 U/mg protein，二者之間活性相差近18%，究其原因可能是因為不同前處理溫度試驗中反應(yīng)體系的pH為7.4而并非7.0。

過氧化氫異丙苯、叔丁基過氧化氫和百草枯等氧化性藥劑也能引起細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化損傷，所以，這些藥劑被廣泛應(yīng)用于紙片藥敏試驗中，用于驗證SOD等的抗氧化活性[17,27]。本研究采用氯化鉻、叔丁基過氧化氫和過氧化氫異丙苯3種氧化性藥劑，誘導(dǎo)大腸桿菌細胞內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，并采用K-B紙片瓊脂糖擴散法測定了上述3種藥劑對過表達PcSOD3大腸桿菌抑制效果，結(jié)果表明過表達PcSOD3的大腸桿菌對3種藥劑的耐受能力顯著增強，說明PcSOD3具有抗氧化功能。

4 結(jié)論

在大腸桿菌中成功表達了柑橘全爪螨 PcSOD3，該蛋白主要以可溶性蛋白的形式表達，利用鎳柱親和層析法純化得到了PcSOD3重組蛋白，經(jīng)Western blot驗證該重組蛋白即為PcSOD3重組蛋白。WST-1法測定了PcSOD3重組酶的活性，并證明該重組蛋白具有抗氧化活性，同時明確了該重組酶最適反應(yīng)pH以及前處理溫度等生化性質(zhì)。K-B紙片瓊脂糖擴散法測定了氯化鉻、叔丁基過氧化氫和過氧化氫異丙苯3種氧化性藥劑對過表達PcSOD3大腸桿菌抑制效果，結(jié)果表明過表達PcSOD3的大腸桿菌對3種藥劑的耐受能力顯著增強，說明PcSOD3具有抗氧化功能。研究結(jié)果為進一步闡釋PcSOD3在柑橘全爪螨抗氧化損傷過程中的重要功能提供了新的證據(jù)。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Heterologous Expression of PcSOD3 from Panonychus citri and the Anti-Oxidant Activity of Its Recombinant Enzyme

JIANG Hong-bo1, FENG Ying-cai2, LIU Shi-huo1, WANG Jin-jun1
(1College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715;2Chongqing Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chongqing 400020)

【Objective】In the author’s previous studies, it was found that PcSOD3 is up-regulated after exposure to thermal stress, acaricide abamectin, heavy metal and UV-B ultraviolet irradiation, which suggested that PcSOD3 played an important role in the response of P. citri to various adverse environmental stress. In order to further elucidate the physiological functions of PcSOD3, the biochemical characteristics of its recombinant protein expressed in Escherichia coli was investigated. 【Method】ThepET28a-PcSOD3 expression plasmid for the heterologous expression in E. coli was constructed. The recombinant protein was purified by using a Ni+affinity chromatography column, and confirmed by the Western blot analysis. The enzymatic activity was measured using a SOD total activity assay kit. Moreover, the effects of various pH values of the reaction system and different temperatures for preincubation on the recombinant enzyme were tested using the same kit. Using the Kirby-Bauer disc diffusion assay method, the diameters of inhibition zones of the E. coli overexpressing PcSOD3 were measured by exposing to chromic chloride, t-butylhydroperoxide and cumene hydroperoxide. 【Result】 PcSOD3 was successfully expressed in the BL21 (DE3) strain of E. coli. The best condition for the induction and expression of the recombinant protein was obtained, under which cells were cultured at 18 ℃ and 160 r/min, IPTG was added to a final concentration of 0.4 mmol·L-1, the inducing time continued for 18 h. The resulted PcSOD3 recombinant protein was further confirmed by the Western blot analysis, with the molecular weight of 25.3 kD. Moreover, the PcSOD3 recombinant protein was active in the WST-1 activity assay system. Based on the assay system, it was found that PcSOD3 recombinant protein was mostly active (activity was about 47.3 U/mg protein) when the pH of the reaction system was 7.0, while it was mostly active (activity was about 40.2 U/mg protein) when the preincubation temperature was 25℃. As indicated by the Kirby-Bauer test, the diameters of inhibition zones of the E. coli overexpressing PcSOD3 which were exposed to chromic chloride (CdCl2), were about 20% smaller than the control. Similarly, overexpression of PcSOD3 in E. coli had significantly reduced the inhibition zone (around 25%) caused by exposure to t-butylhydroperoxide at the concentration of 150 mmol·L-1, compared to the control. Meanwhile, E. coli expressing PcSOD3 showed 15% reduced inhibition when exposed to cumene hydroperoxide.【Conclusion】PcSOD3 was functionally expressed in E. coli. Purified PcSOD3 recombinant protein was obtained. Furthermore, the biochemical characteristics of the recombinant enzyme such as the optimal pH and preincubation temperature was determined. The recombinant enzyme showed a significant antioxidation activity in vitro by WST-1 assay method. The results of Kirby-Bauer disc diffusion assays showed that the E. coli overexpressing PcSOD3 had a significantly elevated tolerance to the oxidative stress, which has proven that PcSOD3 has the antioxidant function. Results of the experiment further revealed that PcSOD3 played a crucial role in the tolerance of P. citri to oxidative stress.

Panonychus citri; superoxide dismutase (SOD); biochemical characteristics; recombinant protein; Kirby-Bauer test

2016-09-13；接受日期：2016-10-21

國家自然科學(xué)基金面上項目（31572016）、重慶市科委社會民生項目（cstc2015shmszx80008）、西南大學(xué)博士基金（SWU115017）

聯(lián)系方式：蔣紅波，E-mail：jhb8342@swu.edu.cn。通信作者王進軍，E-mail：wangjinjun@swu.edu.cn