袁保輝,劉桂芹,劉 敏,李大成,韓 軍,王正平

(聊城大學(xué)臨床營(yíng)養(yǎng)研究中心,山東聊城 252000)

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復(fù)方D-核糖對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究

袁保輝,劉桂芹,劉 敏,李大成,韓 軍,王正平

(聊城大學(xué)臨床營(yíng)養(yǎng)研究中心,山東聊城 252000)

本實(shí)驗(yàn)以80只雄性小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)連續(xù)四周的灌胃實(shí)驗(yàn)研究了核糖復(fù)方對(duì)疲勞小鼠生理功能的影響。實(shí)驗(yàn)小鼠被隨機(jī)分為生理鹽水組、核糖組、人參瑪咖組以及核糖復(fù)方組。在各組給予相應(yīng)的干預(yù)措施下,測(cè)定了小鼠末次運(yùn)動(dòng)0 h和24 h后的血清乳酸含量、尿素氮含量及肝糖原含量的變化。結(jié)果表明,與對(duì)照組比較,D-核糖及核糖復(fù)方在急性疲勞期間可以顯著延長(zhǎng)小鼠的游泳時(shí)間(p<0.05);長(zhǎng)期疲勞中,核糖復(fù)方組可以增加小鼠的肝糖原(p<0.01),降低血清乳酸(p<0.01)及尿素氮(p<0.05)含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)核糖復(fù)方總體效果優(yōu)于人參瑪咖及核糖單方的抗疲勞功效；對(duì)急性疲勞中的小鼠,D-核糖及其核糖復(fù)方均具有明顯的抗疲勞作用;對(duì)長(zhǎng)期疲勞的小鼠,D-核糖沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗疲勞作用。

小鼠,抗疲勞,D-核糖,人參,瑪咖,D-核糖復(fù)方

D-核糖天然存在于所有生命細(xì)胞中,是生物體內(nèi)遺傳物質(zhì)核酸的重要組成成份,與腺苷酸的形成和ATP的再生有關(guān)[1]。D-核糖除了在核苷類物質(zhì)、蛋白質(zhì)及脂肪代謝中處于樞紐位置[2],具有重要的生物功能外,更在心臟和骨骼肌代謝中起關(guān)鍵作用。D-核糖的生理作用已成為近年來(lái)營(yíng)養(yǎng)保健領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),其臨床應(yīng)用也逐漸增多[3]。歐美市場(chǎng)上有關(guān)D-核糖的食品及保健食品比較豐富[4],國(guó)內(nèi)以D-核糖作為功效因子添加的保健食品較少。研究表明,D-核糖能夠促進(jìn)局部缺血組織、局部缺氧組織的功能恢復(fù)[5]、還有助于由心肌缺血缺氧引起的心臟功能下降的恢復(fù)[6]。還有數(shù)據(jù)表明,D-核糖能有效解除機(jī)體疲勞、消除肌肉酸痛強(qiáng)直[7]及痙攣[8],外源D-核糖通過(guò)直接進(jìn)入ATP的重新合成過(guò)程[1]顯現(xiàn)出明顯的抗疲勞功能。但前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)卻反映出D-核糖在提高動(dòng)物的耐力上具有一定的局限性。國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)表明,人參[9]、瑪咖[10]具有良好的抗疲勞功效,其作用原理有別于D-核糖的機(jī)制。為此,本課題擬以核糖、人參和瑪咖組成復(fù)合配方,探究復(fù)方D-核糖對(duì)小鼠游泳能力及長(zhǎng)期疲勞后生理功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級(jí)昆明種小鼠 100只,動(dòng)物批號(hào):N0.37009200000724,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,4周齡,體質(zhì)量(19±1) g,單一雄性;標(biāo)準(zhǔn)鼠顆粒飼料 濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司;D-核糖 純度99.2%,由江西誠(chéng)志生物工程有限公司提供;人參提取物(UV含量10%)、瑪咖提取物 由浙江天草生物制品有限公司提供;其它試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

塑料游泳箱(80 cm×50 cm×50 cm);S-3100紫外分光光度計(jì) Scinco;5804R臺(tái)式冷凍離心機(jī) Eppendorf;BIO-MEDICAL超低溫保存冰箱 Haier;雙列大孔儀表恒溫水浴鍋 上海樹(shù)立儀器儀表有限公司;FB224電子分析天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;乳酸測(cè)定試劑盒、肝糖原試劑盒、血清尿素氮試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 各組灌胃液均以高溫滅菌的雙蒸水為溶劑,4 ℃儲(chǔ)存。100 mL核糖復(fù)方中含有10 g D-核糖、1 g人參提取物、1 g瑪咖提取物;100 mL人參瑪咖溶液含有1 g人參提取物、1 g瑪咖提取物;100 mL核糖溶液含有10 g D-核糖。D-核糖的劑量選擇參考Hellsten[11]的報(bào)道,核糖復(fù)方劑量的選擇參考預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果。

1.2.2 動(dòng)物分組與模型 100只小鼠購(gòu)進(jìn)后,實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,進(jìn)行連續(xù)3 d的適應(yīng)性游泳訓(xùn)練,每天游泳20 min。隨后進(jìn)行游泳能力篩選實(shí)驗(yàn),淘汰體重及游泳能力與平均水平有顯著性差異的小鼠,淘汰后剩余80只。按體重隨機(jī)分為4組,每組20只,分別為生理鹽水組(NC組)、D-核糖組(DH組)、人參瑪咖組(RM組)、核糖復(fù)方組(HF組)。每日灌胃1次,連續(xù)28 d,每?jī)商旆Q體重1次,根據(jù)小鼠的體重按0.10 mL/10 g劑量經(jīng)口灌胃,每天給藥30 min后進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)。每天負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)的水箱溫度為25 ℃,鉛皮綁定在小鼠尾根部。

急性疲勞模型:第1周綁定小鼠體質(zhì)量3.5%的鉛皮游泳,每天游泳至力竭,記錄力竭時(shí)間,通過(guò)比較同一組小鼠每天的游泳能力是否呈現(xiàn)穩(wěn)定的顯著性差異,來(lái)決定小鼠的急性疲勞模型是否成功。長(zhǎng)期疲勞模型:第2周負(fù)重增加為體質(zhì)量的4%,每天游泳至力竭,撈出并記錄時(shí)間;第3周負(fù)重增加為體質(zhì)量的4.5%,每天游泳至力竭;第4周的每天上午增加不負(fù)重游泳10 min(水溫20 ℃),間隔6 h后再進(jìn)行負(fù)重體質(zhì)量5%的游泳,共4周。

1.2.3 樣品處理以及指標(biāo)測(cè)定 末次給藥30 min后,進(jìn)行負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn),待小鼠力竭后撈出,各組一半小鼠立即取血,剩余一半小鼠在運(yùn)動(dòng)24 h后取血。取血方式是用毛細(xì)管從眼眶內(nèi)眥采血0.7 mL(不加抗凝劑),然后將血液置4 ℃冰箱約2 h,3700 r/min離心10 min后取血清,血清分裝兩管,置于-20 ℃冰箱凍存。前面一半小鼠取血后立即頸椎脫臼處死,剩余的小鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束72 h后以同樣方法處死,取出肝臟、心臟、腓腸肌,將樣品迅速投到液氮中速凍,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。取肝臟約0.1 g在冰冷的生理鹽水中漂洗,除去血液,濾紙拭干,稱重,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定肝糖原含量(蒽酮法)。血清解凍后,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求測(cè)定血清的尿素氮含量(二乙酰肟比色法)和血清乳酸含量(比色法)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,各組的結(jié)果分別以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間的數(shù)據(jù)差異比較用單因素方差分析法,當(dāng)數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)再用最小顯著差值法(LSD)進(jìn)行兩兩比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠第1周的游泳時(shí)間比較

由圖1～圖4可知,各組小鼠在前期先進(jìn)入游泳適應(yīng)期,游泳能力達(dá)到頂峰后逐漸下降或趨于平穩(wěn)。生理鹽水組第4 d游泳能力最強(qiáng),平均游泳時(shí)間由415 s提高到536 s;D-核糖組第3 d游泳能力最強(qiáng),平均游泳時(shí)間由416 s提高到712 s;人參瑪咖組第2 d游泳能力最強(qiáng),平均游泳時(shí)間由426 s提高到556 s;核糖復(fù)方組第2 d游泳能力最強(qiáng),平均游泳時(shí)間由452 s提高到664 s。各組出現(xiàn)最強(qiáng)游泳能力后,隨后幾天與這一天比較出現(xiàn)不同程度的顯著性差異,說(shuō)明各組均進(jìn)入不同程度的運(yùn)動(dòng)性疲勞期,表明急性疲勞模型構(gòu)建成功。

圖1 NC組小鼠第1周力竭時(shí)間Fig.1 Swimming time of the NC group of first week注：各實(shí)驗(yàn)組每天的力竭時(shí)間與該組力竭時(shí)間最高值比較，*表示有顯著性差異(p<0.05)，**表示有極顯著性差異(p<0.01)；圖2～圖4同。

圖2 DH組小鼠第1周力竭時(shí)間Fig.2 Swimming time of the DH group of first week

表1 各組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間比較±s,n=20)

圖3 RM組小鼠第1周力竭時(shí)間Fig.3 Swimming time of the RM group of first week

圖4 HF組小鼠第1周力竭時(shí)間Fig.4 Swimming time of the HF group of first week

注:*表示與生理鹽水組組比較差異顯著,p<0.05;**表示與生理鹽水組組比較差異極顯著,p<0.01。2.2 各處理組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間

由表1數(shù)據(jù)可知,與生理鹽水組比較,核糖組在第3 d呈極顯著性差異,人參瑪咖組在第9、11、23、27 d呈顯著性差異,核糖復(fù)方組在第2、5、8、9、11、27 d呈顯著性差異。數(shù)據(jù)表明,D-核糖在運(yùn)動(dòng)前期具有一定抗疲勞功效,但在后期功效不顯著;人參瑪咖組合物的抗疲勞功效主要體現(xiàn)在疲勞模型后期;核糖復(fù)方組合物在全程均具有一定的抗疲勞功效。人參瑪咖復(fù)方的抗疲勞功效比較慢速,所以在前期的作用不明顯,在后期逐漸呈現(xiàn)出一定的抗疲勞功效。

外源供給的D-核糖在機(jī)體內(nèi)代謝迅速[12],可以繞過(guò)磷酸戊糖途徑中的限速步驟,使心肌和骨骼肌細(xì)胞通過(guò)重新合成過(guò)程快速合成5-磷酸核糖-1-焦磷[13](PRPP)。隨著PRPP含量增加,肌肉組織的腺苷酸合成速度加快,從而使組織中的ATP含量得以快速恢復(fù)[14]。這樣,組織中增加的ATP將支持肌肉組織進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的收縮,小鼠的游泳能力也會(huì)相應(yīng)延長(zhǎng),這一作用使D-核糖在疲勞模型前期具有一定功效。隨著疲勞程度的增加,核糖組的優(yōu)勢(shì)逐漸不明顯,可能是由于D-核糖對(duì)機(jī)體ATP的補(bǔ)充作用彌補(bǔ)不了它的流失,說(shuō)明核糖在長(zhǎng)期疲勞中的作用不顯著,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Hellsten[11]等的研究結(jié)果相符。

2.3 對(duì)小鼠肝糖元的影響

由表2數(shù)據(jù)可知,運(yùn)動(dòng)后即刻,與生理鹽水對(duì)照組比較,D-核糖組無(wú)明顯變化;人參瑪咖組有顯著性提高(p<0.05);核糖復(fù)方組有極顯著提高(p<0.01)。D-核糖組的肝糖原含量極顯著低于核糖復(fù)方組(p<0.01),人參瑪咖組低于核糖復(fù)方組但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

機(jī)體處于疲勞狀態(tài)時(shí),糖分解代謝占優(yōu)勢(shì),為了維持穩(wěn)定的血糖濃度,機(jī)體的糖異生作用將加強(qiáng)[15],同時(shí)機(jī)體會(huì)促進(jìn)糖原降解,抑制肝糖原合成[16],所以肝糖原的含量是機(jī)體抗疲勞的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中核糖復(fù)方及人參瑪咖組可以明顯的提高運(yùn)動(dòng)中小鼠的肝糖原含量,D-核糖組并未出現(xiàn)顯著性增加,說(shuō)明核糖復(fù)方中人參瑪咖組合物可以增加肝糖原的儲(chǔ)備。在長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)疲勞中,人參瑪咖與核糖復(fù)方可以具有良好的作用,可能是核糖復(fù)方中的人參瑪咖通過(guò)提高小鼠的肝糖原儲(chǔ)備,來(lái)提高小鼠的抗疲勞作用。

表2 各組小鼠肝糖原的比較

注:*表示與NC組比較差異顯著,p<0.05;**表示與NC組比較差異極顯著,p<0.01;#表示與核糖復(fù)方組比較差異顯著,p<0.05;##表示與核糖復(fù)方組比較差異極顯著,p<0.01;表3、表4同。

2.4 對(duì)小鼠血乳酸的影響

由表3數(shù)據(jù)可知,運(yùn)動(dòng)后即刻,與生理鹽水對(duì)照組比較,核糖復(fù)方組乳酸含量極顯著降低(p<0.01);核糖組與人參瑪咖組降低不顯著。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組顯著高于核糖復(fù)方組;核糖組無(wú)顯著性差異。運(yùn)動(dòng)后24 h,與生理鹽水對(duì)照組比較,D-核糖組與核糖復(fù)方組均有顯著降低(p<0.05)。與核糖復(fù)方組比較,核糖組與人參瑪咖組沒(méi)有顯著性差異。數(shù)據(jù)表明,核糖可以加速乳酸循環(huán)及乳酸的清除速度,可能是由于核糖可以加速乳酸循環(huán)速度,人參瑪咖在清除乳酸的作用上不明顯。

機(jī)體經(jīng)歷血供不足、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)或重體力勞動(dòng)時(shí),心肌和骨骼肌處于相對(duì)缺氧狀態(tài),細(xì)胞的有氧氧化過(guò)程受到嚴(yán)重抑制,轉(zhuǎn)而以糖酵解過(guò)程為主要供能來(lái)源[17],導(dǎo)致肌肉組織中丙酮酸、乳酸的大量累積,血漿乳酸水平上升,加重機(jī)體疲勞感,所以乳素的含量可以表明機(jī)體的疲勞程度。運(yùn)動(dòng)后即刻,核糖復(fù)方的乳酸含量顯著低于生理鹽水組,說(shuō)明核糖復(fù)方抗疲勞的作用最明顯。小鼠恢復(fù)24 h后,核糖及其核糖復(fù)方組的乳酸顯著低于生理鹽水組,說(shuō)明疲勞后恢復(fù)期,D-核糖及其復(fù)方可以加快機(jī)體的乳酸清除速度,提高乳酸的清除能力,防止乳酸堆積,從而有利于運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的體力恢復(fù)。

表3 各組小鼠乳酸含量的比較±s,n=10)

2.5 對(duì)小鼠尿素氮的影響

由表4可知,運(yùn)動(dòng)后即刻,與生理鹽水組比較,D-核糖組出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01);核糖復(fù)方組出現(xiàn)顯著下降;人參瑪咖組沒(méi)有顯著性變化。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組與核糖組無(wú)顯著性差異。運(yùn)動(dòng)后24 h,D-核糖組的血清尿素氮含量出現(xiàn)極顯著降低(p<0.01);核糖復(fù)方組出現(xiàn)顯著下降(p<0.05);人參瑪咖組沒(méi)有顯著性變化。與核糖復(fù)方組比較,人參瑪咖組極顯著(p<0.01)高于核糖復(fù)方組;核糖組顯著性(p<0.05)低于核糖復(fù)方組。

表4 各組小鼠尿素氮的比較

機(jī)體疲勞時(shí),機(jī)體不能通過(guò)糖代謝和脂肪代謝產(chǎn)生足夠能量,會(huì)引起蛋白質(zhì)代謝增加[18],蛋白質(zhì)降解、脫氨基作用加強(qiáng),使進(jìn)入肝臟鳥(niǎo)氨酸循環(huán)的氨增多[19],從而導(dǎo)致血漿尿素氮水平上升,所以尿素氮的含量是機(jī)體疲勞狀態(tài)的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)中,運(yùn)動(dòng)后即刻核糖及其核糖復(fù)方組尿素氮含量顯著降低,說(shuō)明在運(yùn)動(dòng)期間核糖可以降低機(jī)體蛋白質(zhì)的分解速度的作用,降低疲勞對(duì)機(jī)體的不利影響;人參瑪咖復(fù)方在降低尿素氮含量的作用上不明顯。運(yùn)動(dòng)后24 h,核糖組的尿素氮平均含量由3.39 mmol/L下降到2.85 mmol/L,說(shuō)明核糖還具有一定清除血清尿素氮的作用,核糖復(fù)方組的清除速度顯著低于核糖組的清除速度,但依然與生理鹽水組有顯著性差異,可能是由于測(cè)量誤差引起。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)成功的建立了一個(gè)小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞模型,各組小鼠均出現(xiàn)了運(yùn)動(dòng)性疲勞。在第一周負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)中,核糖復(fù)方組與核糖組小鼠游泳力竭時(shí)間顯著高于人參瑪咖組及生理鹽水組。隨著小鼠機(jī)體的進(jìn)一步疲勞,D-核糖的作用不在顯著,人參瑪咖復(fù)方的抗疲勞功效逐漸體現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)對(duì)急性疲勞中的小鼠,D-核糖具有明顯的抗疲勞作用;對(duì)長(zhǎng)期疲勞的小鼠,D-核糖沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抗疲勞作用。核糖復(fù)方在兩種疲勞狀態(tài)下均具有良好的功效,其總體效果優(yōu)于人參瑪咖復(fù)方及核糖單方的抗疲勞功效,其可能通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)的肝糖原儲(chǔ)備,降低血清尿素氮含量及減少乳酸堆積來(lái)作用于機(jī)體,產(chǎn)生一定的抗疲勞效果,有關(guān)其抗疲勞機(jī)理還需要進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為更有效的利用D-核糖,以及開(kāi)發(fā)核糖相關(guān)的抗疲勞功能產(chǎn)品提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論根據(jù)。

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Study on anti-fatigue effect of compound D-ribose on mice

YUAN Bao-hui,LIU Gui-qin,LIU Min,LI Da-cheng,HAN Jun,WANG Zheng-ping

(Laboratory of Clinical Nutrition,Liaocheng University,Liaocheng 252000,China)

In this study,80 male mice were examined over a 4-week period of daily gavage feeding to study the effects of D-ribose compounds on the ability of mice to withstand fatigue. The mice were randomly divided into the saline control group,the ribose group,the ginseng and maca group,and the ribose compounds group. Each group was given the appropriate intervening measures,and the mice were evaluated at 0 hours and 24 hours after their movements to measure changes in lactic acid,urea nitrogen,and liver glycogen. The results showed that D-ribose and ribose compounds,during periods of extreme fatigue,could significantly extend the swimming time of mice(p<0.05),and that ribose compounds could increase liver glycogen(p<0.01)and decrease lactic acid(p<0.01)and urea nitrogen concentration(p<0.05). The results also confirmed that the compound d-ribose was better than the D-ribose or the ginseng and maca group in general terms and during period of extreme fatigue in mice,D-ribose and ribose compounded clearly possess anti-fatigue properties. With regards to long-term fatigue,D-ribose did not show clear anti-fatigue uses.

mice;anti-fatigue;D-ribose;ginseng;maca;D-ribose compounds

2016-06-13

袁保輝(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：營(yíng)養(yǎng)學(xué)，E-mail：lcuyuanbaohui@163.com。

*通訊作者:王正平(1961-)，女，教授，研究方向：臨床營(yíng)養(yǎng)，E-mail：bioactiveschina@163.com。

聊城市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013 GJH15)；聊城大學(xué)科技項(xiàng)目(318011405)；聊城大學(xué)大學(xué)生科技文化創(chuàng)新基金項(xiàng)目(26312158809)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)22-0349-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.22.060