董偉航孫大林綜述 金保方吳萍審校

1. 青海大學醫(yī)學院（西寧 810001）；2. 東南大學附屬中大醫(yī)院 中西醫(yī)結合男科

·綜述·

睪丸間質細胞內調控StAR影響睪酮合成因素的研究進展

董偉航1孫大林2綜述 金保方2吳萍1審校

1. 青海大學醫(yī)學院（西寧 810001）；2. 東南大學附屬中大醫(yī)院 中西醫(yī)結合男科

StAR（steroidogenic acute regulatory）是睪丸間質細胞（Leydig cells）內促進膽固醇作為睪酮合成前體從線粒體外膜轉運至內膜的關鍵因子[1,2]，膽固醇在StAR的調控下通過線粒體外膜TSPO（translocator protein）與VDAC1（voltage-dependent anion channel 1）進入線粒體內膜，再經CYP11A1（cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1）裂解其側鏈成為孕烯醇酮，孕烯醇酮經線粒體與內質網內的3βHSD（3β-hydroxysteroid dehydrogenase）轉化為孕酮，孕酮在內質網內被CYP17A1（cytochrome P450 steroid 17-α-monooxygenase）轉化為脫氫表雄酮最后經17-βHSD代謝為睪酮[3]。本文從睪丸間質細胞膽固醇來源開始，以cAMP-PKA、Notch、ERK1/2、PI3K-AKt信號通路，非編碼RNA及其他StAR影響因素展開綜述，意在為今后國內睪丸類固醇合成實驗研究提供思路與參照。

一、脂滴與睪丸間質細胞

與在脂肪細胞中占滿幾乎整個細胞容積并作為能量倉庫的脂滴不同，睪丸間質細胞內的脂滴以小體積貯存形式短暫存在，其利用受黃體生成素誘導的類固醇合成過程調節(jié)[4]。脂滴內有一個被單層磷脂包圍的膽固醇脂（cholesteryl ester，CE）核心，磷脂單層嵌有相關蛋白（PLINs、CIDEs、lipases、SNAREs、vimentin、Rabs、VDACs及一些類固醇生成酶）。間質細胞內的膽固醇優(yōu)先來源于受激素刺激而從脂滴分離的游離膽固醇，而HSL（hormone sensitive lipase）是將膽固醇酯轉換成游離膽固醇的主要中性膽固醇酯酶。通過HSL與vimentin及StAR的相互作用，游離膽固醇被轉運到線粒體用于類固醇激素的合成[5]。

二、StAR相關通路及相關因子

（一）cAMP-PKA通路

cAMP-PKA通路是包括類固醇合成在內多種生理進程的調控者。

細胞內cAMP（3',5'-cyclicadenosine monophosphate）濃度受LH/CG受體LHCGR（the luteinizing hormone/chorionic gonadotropin receptor）、ACs（adenylyl cyclases）與PDEs（cyclic nucleotide phosphodiesterases）調控，LH與LHCGR結合促使ACs將ATP轉換成cAMP，cAMP將其下游效應器PKA（protein kinase A）磷酸化并激活Creb（cyclic AMP-responsive element-binding protein），進而誘導StAR與CYP（cytochrome P450）家族表達以促進類固醇合成；而PDE4與PDE8抑制cAMP對PKA的磷酸化作用。PKA還可磷酸化PLIN1、StAR與HSL以促進CEs水解[6]。

Nur77由Nr4a1基因表達，是孤核受體超家族中的一個轉錄因子，其作為端點效應器作用于PKA信號通路上促進StAR表達乃至類固醇合成[7]。本研究小組前期實驗已證實，用AD-siNur77阻斷Nur77后，StAR與3βHSD的表達明顯下降[8]。而另有研究證實20αHSD（20a-hydroxysteroid dehydrogenase）、3βHSD、P450c17與StAR的表達均受Nur77調控，而Nur77基因表達受ERα（estrogen receptor α）抑制[9]。

ARR19（androgen receptor corepressor-19kDa）是趨化因子與跨膜4超家族間的調節(jié)蛋白，ARR19基因在睪丸中大量編碼一種19kDa的富含亮氨酸的疏水性蛋白（前列腺亦有適度表達）。ARR19在間質細胞發(fā)育早期階段高表達之后逐步減少，ARR19的表達通過GATA-1轉錄因子及cAMP應答元件結合蛋白受LH-cAMP調控。ARR19作為抗類固醇生成因子，通過抑制Nur77誘導的類固醇生成酶基因的表達從而抑制睪丸類固醇合成。以腺病毒轉染小鼠睪丸使ARR19過表達，可使小鼠睪丸與前列腺縮小，但精囊大小無明顯變化。ARR19還可通過減少3βHSD、 P450c17（CYP17A1）及StAR的表達并抑制孕酮及睪酮分泌[10]。

有研究認為視黃酸亦在cAMP-PKA通路上起重要作用，視黃酸作用于RXR（retinoid X receptor）、LXR（liver X receptor）乃至RAR（retinoic acid receptor），促進cAMP-PKA磷酸化Creb，進而活化HSL、LXR與SREBP-1c（sterol regulatory element-binding protein-1c）以促進StAR轉錄與表達[11]。

（二）Notch通路

Notch基因可在睪丸及睪丸間質細胞內表達，在生殖腺發(fā)生過程中，Notch信號通路可調節(jié)睪丸間質細胞分化——抑制其通路可增加睪丸間質細胞數量；反之則減少睪丸間質細胞數量，過表達或沉默Notch都會引起睪丸畸形以及生殖細胞缺乏[12]。

NOTCHICD（the Notch intracellular domain）在輔因子RBPJK的作用下黏附于胞核DNA上從而激活其下游因子HES與HEY，其中HEY能與GATA組成復合體抑制諸如ANF、MHC及MIS等基因的表達。類固醇合成途徑受SF1上調、Dax1下調，Notch信號通路可抑制SF1并增強Dax1的轉錄以抑制類固醇合成；GATA4在間質及顆粒細胞內都有表達，是類固醇合成途徑基因（SF1、Cyp19a1、StAR、Hsd3b1、Hsd3b2及Cyp11A1）的正向調控者，而Notch可抑制GATA4介導的基因轉錄[12]。

SF1（steroidogenic factor 1，Ad4BP or Nr5a1）屬于腎上腺與性腺核受體家族，其功能主要作用于腎上腺及丘腦-垂體-性腺軸。SF1敲除后，成年小鼠睪丸間質細胞成熟相關基因Sult1e1（estrogen sulfotransferase）、Vcam1（vascular celladhesion molecule I）與Hsd3b6（hydroxy-delta-5-steroiddehydrogenase, 3 beta- and steroid deltaisomerase 6）的轉錄完全阻斷[13]，睪丸間質細胞內脂質堆積，StAR及CYP11A1表達顯著減少（敲除兩者之一亦表現為脂質堆積，同時敲除效果疊加），游離膽固醇的顯著增加而雄激素明顯降低[14]。

Dax1(dosage-sensitive sex reversal, adrenal hypoplasia congenita (AHC) and critical region on the X chromosome gene1)由Nr0a1基因表達，亦屬于孤核受體超家族，它可以抑制SF1表達乃至類固醇合成[15]。

GATA轉錄因子是一鋅指結構蛋白，GATA1/4/6主要在胚胎期于睪丸支持細胞（Sertoli cells）與睪丸間質細胞內表達，其中GATA4在睪丸的主要靶基因為性別決定基因Sry、Sox9、Dmrt1，肽激素分泌基因Inha、Inhb、Amh，促性腺激素信號通路基因Fshr、Lhcgr，類固醇激素的合成基因StAR、Cyp11a1、Cyp17a1，以及細胞間作用基因Clmp、Cldn11、Cx30.2。在睪丸支持細胞及間質細胞中，GATA-4可與SF1、LRH1（liver receptor homolog 1，NR5A2）、FOG1、FOG2協同作用[16]。

Wt1（the Wilms' tumor suppressor gene）編碼一鋅指結構核轉錄因子，Wt1直接沉默SF1啟動子從而抑制SF1表達，而敲除Wt1則SF1表達上調且睪丸支持細胞與顆粒細胞的分化被阻斷，相應的多數生殖嵴細胞分化為類固醇合成細胞（睪丸間質細胞與膜-間隙細胞）[17]。

（三）ERK1/2通路

ERK1/2（extracellular regulated protein kinases）是MAPK（mitogen-activated protein kinase）的亞族，本身包含在MAP3K-MEK-MAPK三級激酶通路中。

ERK1/2通路參與調節(jié)睪丸間質細胞類固醇合成，其本身受LH與LHR調控，抑制ERK1/2則cAMP誘導的類固醇合成受阻，敲除睪丸間質細胞內MEK1/2，StAR、HSD3B6、CYP17A1與Hsd17b3表達下降，Nr0a1表達上升，睪酮分泌下降但Creb1、Nr4a1與Nr5a1表達上升[18]。ERK1/2磷酸化后才具有相應活性，MKP-1抑制MAPK的磷酸化，黃體生成素與cAMP可促進ERK1/2的磷酸化并誘導MKP-1（MAPK phosphatase-1）的分泌。通過過表達與敲除MKP-1，發(fā)現上調MKP-1可減少8Br-cAMP與hCG對ERK1/2磷酸化的促進作用并減少StAR的蛋白表達乃至睪酮合成。而藥物抑制ERK1/2活性則cAMP對Nr4a1信使水平以及啟動子活性的提升作用亦降低。MKP-1亦可受應激誘導分泌[19]。

AMPK（adenosine 5'-monophosphate-Activated protein kinase）即AMP蛋白激酶，屬能量調節(jié)關鍵酶。一組實驗認為AMPK可激活睪丸間質細胞內睪酮分泌，并可通過抑制ERK1/2的磷酸化以上調3β-HSD、p450scc及StAR的蛋白表達，進而促進間質細胞睪酮分泌[20]。但另一組實驗結果顯示，活化的AMPK通過下調StAR與Nr4a1明顯抑制cAMP誘導的類固醇合成，但卻對SF1蛋白水平無影響[21]。

Annexin A5作為膜聯蛋白家族成員，其在睪丸間質細胞內也有表達。Annexin A5在睪丸間質細胞內可上調 StAR、P450scc、3β-HSD與17β-HSD的表達和睪酮分泌，實驗發(fā)現ERK1/2通路在Annexin A5加入后被激活，而抑制ERK1/2通路則Annexin A5的上調作用被阻斷[22]。

炎性壞死因子TNF-α（tumor necrosis factor alpha）亦被發(fā)現在睪丸間質細胞類固醇合成中起負性調節(jié)作用，它通過JNK-ERK通路磷酸化并激活Dax1，同時下調StAR、3βHSD與17βHSD的表達以進一步抑制睪酮合成[23]。

（四）PI3K-AKt通路

PI3K-AKt通路在以往的研究中主要以抗細胞凋亡為主，但近幾年的實驗研究提示PI3K-AKt通路調控睪酮分泌的機制或與StAR相關。

FGF9（f broblast growth factor 9）在性腺發(fā)育過程中起重要作用，研究發(fā)現FGF9可以通過Ras-MAPK及PI3K通路上調睪酮分泌，并可進一步激活JNK、p38、ERK1/2以及AKt通路[24]。

Foxo（forkhead box class O）是應激、衰老、發(fā)育、胰島素敏感性相關蛋白，PI3K磷酸化AKT進而磷酸化Foxo3的Ser24、Thr32、Ser56三個殘端以促進其轉錄。黃體生成素處理的R2C細胞（間質細胞系），Foxo3磷酸化增加；PIK3敲除后，Foxo3對應磷酸化減少。當Foxo3過表達時，睪酮及StAR蛋白表達減少；而將Foxo3及一個StAR啟動子同時轉染HEK293細胞（外源基因研究細胞系），發(fā)現Foxo3可抑制StAR啟動子活性[25]。

H2R（histamine H2 receptor）屬于G蛋白偶聯家族，一般認為其與細胞的增殖與分化相關。研究發(fā)現H2R可抑制間質細胞PI3K-Akt通路并激活ERK通路，刺激腺苷酸環(huán)化酶上調cAMP乃至PKA的表達[26]。而cAMP-PKA通路上調StAR的表達，暗示H2R促進StAR分泌的可能。

三、非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）中存在著影響StAR活性的因子，已有實驗證實部分miRNAs與睪丸間質細胞激素調節(jié)相關[27]。

如前面所述，vimentin與StAR共同參與游離膽固醇轉運。mi-RNA 200c可以抑制vimentin的表達。以10-7M MBP（mono-butyl phthalate）處理睪丸間質細胞，StAR與vimentin表達均上升；而過表達mi-RNA 200c，睪丸間質細胞內孕酮分泌減少；沉默vimentin，孕酮分泌亦減少[28]。該實驗提示mi-RNA 200c或可抑制StAR的表達。

長鏈非編碼RNA（IncRNA）H19屬于一個高度保守的印記基因簇，H19作為miRNA let-7的分子海綿，可下調let-7的活性。實驗證實過表達H19能上調StAR的蛋白水平，且StAR mRNA的3'UTR段有l(wèi)et-7結合位點，用let-7轉染小鼠睪丸間質細胞后StAR表達下降[29]。而RNA沉默蛋白Lin28a與Lin28b被發(fā)現可在小鼠睪丸間質細胞內表達，且兩者能與let-7前體結合以阻斷l(xiāng)et-7成熟[30]，尚未證實Lin28可否通過下調let-7以上調StAR的表達。

實驗發(fā)現miRNA mi R-140-5p與mi R-140-3p抑制睪丸間質細胞分化，mi R-140-5p/mi R-140-3p敲除小鼠與Notch敲除小鼠在睪丸間質細胞分化程度上極為相似[31]，提示mi R-140-5p/mi R-140-3p影響Notch通路進而調控StAR的可能。

四、其他影響因素

已有研究表明鋅（Zn）是男性生殖必需的微量元素。在CD-1小鼠睪丸間質細胞中，ZnT7（Zn transporter 7）與StAR協同表達。缺鋅飲食小鼠ZnT7表達下調，而P450scc與3βHSD的分泌降低，血清睪酮水平下降；ZnT7基因靜默的hCG刺激下的睪丸間質細胞其StAR、P450scc及3βHSD表達均下降，孕酮表達亦降低[32]。

ALPK1（alpha-kinase 1）在小鼠睪丸表達豐富，已知睪酮能降低炎性細胞因子與黏附分子的表達以達到抗炎效果。ALPK1轉基因小鼠睪丸與血清睪酮含量均降低，而降低內源性ALPK1則能提高TM3間質細胞系睪酮水平及上調睪酮正向基因（P450scc、3βHSD、 P450C17、17βHSD、StAR及INSL3）的表達；反之則提高睪酮水平則TM3間質與THP1單核細胞系的ALPK1表達下降，且炎性細胞因子亦伴隨減少。提高ALPK1水平還能拮抗睪酮在THP1細胞內的作用。ALPK1還能增加TNFα與TGFβ的分泌，而睪酮拮抗其對TNFα與TGFβ的上調作用[33]。

Nesfatin-1是前體蛋白NUCB-2 N端的神經肽，于雄性大鼠主要分布于下丘腦、腺垂體和睪丸間質細胞內。側腦室注射Nesfatin-1后，下丘腦GnRH、Kiss1，垂體FSHβ、LHβ和睪丸StAR的基因水平均明顯下降。青春期大鼠睪丸3βHSD、17βHSD、P450scc的基因水平顯著提升，但成年大鼠睪丸相應基因水平與血清卵泡刺激素、黃體生成素與睪酮濃度明顯降低[34]。

糖尿病嚴重影響男性生殖。AGEs（advanced glycation end products）明顯抑制以hCG誘導的大鼠睪丸間質細胞內睪酮的分泌，并明顯下調StAR、3βHSD和P450scc的蛋白與mRNA表達?？寡趸瘎㎞AC（N-acetyl-L-cysteine）與內質網應激抑制劑TUDCA（tauroursodeoxycholic acid）可逆轉AGEs的抑制作用。AGEs處理的睪丸間質細胞內ROS（reactive oxygen species）明顯上升，應激相關蛋白CHOP（C/EBP homologous protein）與GRP78（glucose-regulated protein 78）的蛋白表達顯著上調?？芍狝GEs通過誘導氧化應激與內質網應激以抑制大鼠睪丸間質細胞睪酮分泌[35]。

肥胖狀態(tài)同時增加短期與長期肥胖大鼠的血清雌二醇（E2）和瘦素水平，抑制長期肥胖大鼠StAR和CYP11A1基因的表達并使長期肥胖大鼠睪丸內睪酮保持在低水平狀態(tài)。此外，長期肥胖會降低睪丸間質細胞的數目，升高睪丸促炎脂肪細胞因子TNF-α水平并增加睪丸巨噬細胞數量?？芍L期肥胖可能誘發(fā)睪丸慢性炎癥并對睪丸間質細胞類固醇激素合成造成負面影響[36]。

應激（stress）可誘發(fā)腎上腺素與糖皮質激素快速上升，并使睪酮分泌急速減少；但反復應激刺激下，黃體生成素分泌雖然下降但睪酮分泌回升。腎上腺素受體(adrenergic receptors,ADRs)參與雄激素代謝，應激可誘導睪丸間質細胞內所有ADRs的表達提高，包括α1-ADRs，腎上腺素誘導的α1-ADRs能通過 PRKA、 ERK1/2和PI3K通路下調睪丸間質細胞中Nur77的轉錄并上調Arr19及Dax1的轉錄。以IMO法（immobilization stress）制造應激大鼠模型，部分模型鼠造模前睪丸注射哌唑嗪（prazosin阻斷α1-ADRs），發(fā)現α1-ADRs阻斷后，10×IMO大鼠睪酮回升，StAR的上升趨勢亦被阻斷，LHcgr轉錄減少，原本表達下降的Nur77轉錄升高，而原本上升的Arr19及Dax1表達下降[37]。

由松果體分泌的褪黑素（melatonin）是生物節(jié)律蛋白。研究褪黑素對松果體切除術后小鼠及其間質細胞的作用，發(fā)現松果體切除術后小鼠血清睪酮含量上升，間質細胞cAMP水平上升，Insl3、Per1、StAR、Hsd3b1/2、Nr4a1基因表達上升，ARR19基因表達下降，Per2節(jié)律表達消失，而在下丘腦-垂體水平Gnrh、Lhb及Mntr1a的表達提升；而加予褪黑素處理后，動物水平基因表達改變均恢復，但間質細胞層面時鐘基因及類固醇生成基因無明顯變化[38]。

五、討論與展望

圍繞睪丸間質細胞內的StAR相關通路，cAMPPKA與Notch通路的研究已較為成熟，可以預見未來在這兩條通路上的實驗研究會繼續(xù)橫向縱深多元發(fā)展；ERK1/2通路實驗尚未明確ERK1/2與StAR及上游相關因子的作用機制，短期內實驗仍應以通路機制研究為主；PI3K-AKT通路研究剛剛起步，以現有實驗結果可預期其與StAR關系密切，可以適度橫向鋪展。圍繞睪丸間質細胞內ncRNA調控StAR表達的研究雖少，但我們已能看到其中更深的研究價值。微量元素、炎性反應、神經調控、糖尿病、肥胖、應激、生物節(jié)律，看似獨立的StAR影響因素亦可聯系起來，譬如應激實驗就提示α1-ADRs可能作用在Nur77與StAR之間上調StAR轉錄而負反饋于Nur77，其與StAR抑制因子Arr19及Dax1間可能為拮抗關系；MKP-1亦可受應激誘導，ERK1/2通路實驗的不穩(wěn)定結果是否能與應激實驗聯系起來。以此類思考為出發(fā)點展開研究，不但可以為睪酮代謝異常、性功能障礙乃至男性不育癥等臨床研究提供實驗擴展，更可為多病種之間的發(fā)病機制以及交叉機制的研究提供思路。

致謝：本課題由國家自然科學基金（編號：81403402；81473678）項目資助。

間質細胞; 睪酮; StAR; 信號通路;非編碼RNA

1Wang H, Wang Q, Zhao XF, et al. Arch Toxicol 2010; 84(1): 53-61

2Chung JY, Kim YJ, Kim JY, et al. Environ Health Perspect 2011; 119(11): 1569-1574

3Aghazadeh Y, Zirkin BR, Papadopoulos V. Vitam Horm 2015; 98: 189-227

4Yamaguchi T, Fujikawa N, Nimura S, et al. Biochim Biophys Acta 2015; 1851(10): 1285-1295

5Shen WJ, Azhar S, Kraemer FB. Exp Cell Res 2016; 340(2): 209-214

6Golkowski M, Shimizu-Albergine M, Suh HW, et al. Cell Signal 2016; 28(7): 764-778

7Lee SY, Park E, Kim SC, et al. Mol Cell Endocrinol 2012; 362(1-2): 91-103

8谷亞龍,張新東,金保方. 中國男科學雜志 2015; 29(4): 9-13

9Song CH, Gong EY, Park Js, et al. Biochem Biophys Res Commun 2012; 422(2): 327-332

10Qamar I, Ahmad MF, Narayanasamy A. Sci Rep 2015; 5: 13014

11Manna PR, Slominski AT, King SR, et al. Endocrinology 2014; 155(2): 576-591

12George RM, Hahn KL, Rawls A, et al. Reproduction 2015; 150(4): 383-394

13Karpova T, Ravichandiran K, Insisienmay L, et al. Biol Reprod 2015; 93(4): 83

14Hatano M, Migita T, Ohishi T, et al. Endocrine 2016; 54(2): 484-496

15Yeste D, González-Ni?o C, Pérez de Nanclares G, et al. Eur J Pediatr 2009; 168(1): 65-69

16Pihlajoki M, F?rkkil? A, Soini T, et al. Mol Cell Endocrinol 2016; 421: 2-17

17Chen M, Zhang L, Cui X, et al. Development 2017; 144(1): 44-53

18Matzkin ME, Yamashita S, Ascoli M. Mol Cell Endocrinol 2013; 370(1-2): 130-137

19Mori Sequeiros Garcia M, Gorostizaga A, Brion L, et al. Mol Cell Endocrinol 2015; 408:45-52

20 Taibi N, Dupont J, Bouguermouh Z, et al. Anim Reprod Sci 2017; 178: 9-22

21Abdou HS, Bergeron F, Tremblay JJ. Mol Cell Biol 2014; 34(23): 4257-4271

22He Z, Sun Q, Liang YJ, et al. Asian J Androl 2016; 18(3): 456-461

23Sadasivam M, Ramatchandirin B, Balakrishnan S, et al. Inf amm Res 2015; 64(7): 549-556

24Lai MS, Cheng YS, Chen PR, et al. PLoS One 2014; 9(3): e90243

25Choi YS, Song JE, Kong BS, et al. Yonsei Med J 2015; 56(6): 1590-1596

26Alonso N, Diaz Nebreda A, Monczor F, et al. Biochim Biophys Acta 2016; 1860(9): 1998-2007

27Hu Z, Shen WJ, Cortez Y, et al. PLoS One 2013; 8(10): e78040

28Lu H, Zhang C, Hu Y, et al. Toxicol Lett 2016; 241: 95-102

29Men Y, Fan Y, Shen Y, et al. Endocrinology 2016; 158(2): 402-409

30 Gaytan F, Sangiao-Alvarellos S, Manfredi-Lozano M, et al. Endocrinology 2013; 154(3): 1321-1336

31Rakoczy J, Fernandez-Valverde SL, Glazov EA, et al. Biol Reprod 2013; 88(6): 143

32Chu Q, Chi ZH, Zhang X, et al. Int J Mol Med 2016; 37(6): 1619-1626

33Kuo TM, Yeh KT, Hsu HT, et al. J Steroid Biochem Mol Biol 2015; 154: 150-158

34Gao X, Zhang K, Song M, et al. Sci Rep 2016; 6: 32877

35Zhao YT, Qi YW, Hu CY, et al. Int J Mol Med 2016; 38(2): 659-665

36Wagner IV, Kl?ting N, Atanassova N, et al. Mol Cell Endocrinol 2016; 437: 154-162

37Stojkov-Mimic NJ, Bjelic MM, Radovic SM, et al. Mol Cell Endocrinol 2015; 412: 309-319

38Baburski AZ, Sokanovic SJ, Janjic MM, et al. Mol Cell Endocrinol 2015; 413: 26-35

（2017-02-08收稿）

:10.3969/j.issn.1008-0848.2017.02.015

R698