袁世洋 徐慧 謝軍平

分子靶向藥物治療是晚期腫瘤治療的研究熱點之一，因其良好的療效和可耐受的毒副作用而越來越被人們所接受。其中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidermal growth factor receptor tyrosine-kinase inhibitors,EGFR-TKIs）在晚期非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）治療方面已取得了突破性進展，其代表藥物有吉非替尼和厄洛替尼等，目前為EGFR基因敏感突變并且不存在耐藥基因的晚期NSCLC患者推薦EGFRTKIs一線治療得到全世界范圍內(nèi)的認可[1-3]。但是，隨著用藥時間的延長（中位時間為9個月-13個月），大部分患者對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥[4-6]，對EGFR-TKIs耐藥機制及如何逆轉(zhuǎn)耐藥的研究也成為國內(nèi)外研究的熱點。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的內(nèi)環(huán)境，近年來腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞和其他細胞或因子的相互作用逐漸被人們所認識[7-9]，腫瘤內(nèi)微環(huán)境內(nèi)的免疫反應(yīng)與EGFRTKIs抗腫瘤反應(yīng)之間會產(chǎn)生相互影響[10]。本綜述將闡述腫瘤微環(huán)境中免疫細胞、PD-1對EGFR-TKIs靶向治療療效相互影響的可能機制，以期尋求新的治療靶點，進一步提高EGFR-TKIs的抗腫瘤療效和延長有效時間。

1 腫瘤微環(huán)境內(nèi)的免疫細胞與EGFR-TKIs療效的關(guān)系

1.1 調(diào)節(jié)性T細胞 CD4+T細胞和CD8+T細胞是公認的抗腫瘤免疫細胞，通過釋放γ-干擾素、穿孔素和顆粒酶B等腫瘤毒性細胞因子達到殺死腫瘤細胞的作用。Treg細胞是一類控制自身免疫反應(yīng)的細胞群，腫瘤內(nèi)的Treg細胞分泌的轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor, TGF）-β和白介素（interleukin, IL）-10能產(chǎn)生一個免疫抑制環(huán)境，有助于減弱CD4+T細胞、CD8+T細胞及NK細胞產(chǎn)生的抗腫瘤效應(yīng)[11]。實驗[12]證實，在不同小鼠模型中CD25+Treg的消耗極大地提高了小鼠的抗腫瘤免疫效應(yīng)。腫瘤患者通常存在抗腫瘤免疫細胞功能失調(diào)，在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等腫瘤組織內(nèi)部和邊緣，Treg細胞的數(shù)量明顯增加[13-15]。Huang等[16]的研究證實，EGFR+外泌體誘導(dǎo)生成腫瘤特異性Treg細胞，下調(diào)腫瘤特異性CD8+T細胞的表達，從而影響抗腫瘤療效。研究[17]表明，核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子FoxP3是功能性Treg的特異性標志。Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，EGFR信號可以通過抑制糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β, GSK-3β）活性來增強FoxP3蛋白的表達，而使用EGFR-TKI吉非替尼可以修復(fù)GSK-3β活性和減弱Treg細胞免疫抑制功能。He等[19]在肺鱗癌的小鼠模型中，觀察到敲除EGFR基因后形成的腫瘤微環(huán)境中浸潤的FoxP3+Treg細胞較少，而野生型成瘤模型使用吉非替尼治療1 wk后，同樣觀察到FoxP3+Treg細胞、FoxP3 RNA表達減少的趨勢。其認為，EGFR依賴性Treg細胞增強肺鱗癌的生長，相對短暫的系統(tǒng)性抑制EGFR信號通路可改變靶向腫瘤的免疫微環(huán)境。無獨有偶，Mascia等[20]的動物實驗中也得到了類似的研究結(jié)果，系統(tǒng)性EGFR抑制劑可以明顯抑制腫瘤細胞的生長和微環(huán)境中Treg細胞的滲入，EGFR的靶向抗腫瘤治療可以影響腫瘤細胞自身免疫調(diào)節(jié)，而Treg可能是EGFR抑制劑抗腫瘤活性的一個靶點。

1.2 樹突狀細胞（dendritic cells, DC） DC在免疫系統(tǒng)中是最有效的專職抗原提呈細胞。在非成熟狀態(tài)，充當(dāng)免疫系統(tǒng)的哨點，持續(xù)地巡查機體環(huán)境內(nèi)的抗原；同時，DC擁有把外源性抗原內(nèi)源化的獨特能力，即所謂的交叉提呈，如把腫瘤相關(guān)抗原提呈給CD8+T細胞；在成熟狀態(tài)下，DC遷移至淋巴器官內(nèi)，把抗原提呈給幼稚T細胞，活化的T細胞增殖分化后離開淋巴結(jié)搜尋和殺死抗原依賴的細胞[21]。在多項臨床實驗中證實，DC疫苗是安全可行的，以DC為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療、靶向藥物以及免疫檢查點抑制劑等制備的疫苗為腫瘤治療的提供多種思路，而Sipuleucel-T在晚期前列腺癌患者三期臨床實驗中被證實顯著的生存獲益[21]。Wang等[22]的研究探討了共培養(yǎng)DC和細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（cytokine-induced killer cells, CIK）在A549肺癌細胞株的殺傷作用和可能機制，其結(jié)果認為DC-CIK可能通過誘導(dǎo)增強IFN-γ蛋白表達、促進PGE-2、caspase-3/9和IL-10活性以及抑制IL-4的活性和TGF-β蛋白、EGFR蛋白的表達來抑制A549肺癌細胞的生長和增加細胞毒性發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，為DC-CIK細胞共培養(yǎng)免疫治療NSCLC進入臨床提供實驗基礎(chǔ)，同時也為EGFR-TKIs耐藥后的治療提供了新的思路。段瓊等[23]的研究首先富集培養(yǎng)人EGFR靶向藥吉非替尼耐藥的肺癌A549、H292干細胞，分離獲得耐藥肺癌A549、H292干細胞膜微粒；分離培養(yǎng)人DC和CIK細胞，將肺癌干細胞膜微粒負載DC-CIK細胞，檢測肺癌干細胞膜微粒負載DCCIK細胞對耐藥肺癌細胞A549、H292的殺傷性；以肺癌干細胞膜微粒負載DC-CIK細胞的分泌上清作用于肺癌干細胞，觀察其對肺癌干細胞凋亡的影響，以期為針對EGFR-TKIs耐藥肺癌的免疫細胞治療提供實驗基礎(chǔ)。其結(jié)果表明肺癌干細胞膜微粒負載DC-CIK細胞對于EGFRTKIs耐藥肺癌干細胞具有促進凋亡作用，這為EGFR-TKIs耐藥肺癌的臨床治療和防止復(fù)發(fā)提供了新的治療途徑和實驗依據(jù)。

1.3 腫瘤相關(guān)的巨噬細胞（tumor-associated macrophages,TAMs） TAMs來自于未成熟的單核細胞，被大量腫瘤源性細胞因子（如CSF-1、IL-6、IL-10以及一系列化學(xué)趨化因子等），募集到腫瘤區(qū)域，TAMs在腫瘤微環(huán)境的誘導(dǎo)下發(fā)生表型和功能的轉(zhuǎn)換，并再產(chǎn)生趨化因子、生長因子、血管生成因子和基質(zhì)蛋白酶等化學(xué)因子作用于腫瘤細胞，進而促進腫瘤生長、侵襲與轉(zhuǎn)移[24-26]。章必成等[27]研究不同活化表型的巨噬細胞對Lewis小鼠肺癌的細胞增殖和侵襲的影響，結(jié)果表明M1型TAMs可產(chǎn)生NO，使Lewis小鼠肺癌細胞增殖和侵襲受到抑制，而M2型TAMs因為能夠高表達血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）-C，所以擁有促進Lewis小鼠肺癌細胞增殖和侵襲能力，且隨著腫瘤進展微環(huán)境的變化可以使M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞方向極化。M2型TAMs低表達IL-12，高表達IL-10，誘導(dǎo)II型免疫應(yīng)答，其腫瘤殺傷活性低，因子TAMs功能更接近M2型巨噬細胞的功能表型。Chung等[28]研究認為TAMs浸潤降低EGFR-TKIs一線治療的敏感性。此外，Zhang等[29]的臨床研究認為晚期肺腺癌M2-TAMs浸潤與EGFR-TKIs治療療效呈負相關(guān)。但是均未闡明TAMs或M2-TAMs影響EGFR-TKI敏感性的具體機制。有研究[30]在索拉非尼耐藥的肝癌細胞中加入M2-TAMs后，其生長速率明顯高于對照組，索拉非尼耐藥的肝癌細胞中的β-catenin、EGFR的蛋白表達均高于對照組，以及獲得索拉非尼耐藥的肝癌細胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯增加；其結(jié)論認為TAMs和EGFR/β-catenin信號通路促進索拉非尼耐藥肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移。綜上所述，TAMs不僅促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也對EGFR-TKIs的療效產(chǎn)生影響。因此阻止TAMs的募集或逆轉(zhuǎn)TAMs的極化的有關(guān)策略也成為研究熱點。我們前期也綜述了逆轉(zhuǎn)TAMs極化的有關(guān)策略[31]，但在EGFR-TKIs耐藥的肺癌患者中，有關(guān)針對TAMs靶向相關(guān)的研究甚少，有待進一步的研究。

1.4 腫瘤相關(guān)成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs） CAFs是一類不同細胞源性的細胞群，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，近年來研究[32-34]發(fā)現(xiàn)，其通過多種介導(dǎo)機制，影響腫瘤能量代謝，促進血管生成，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。Choe等[35]的研究共培養(yǎng)了CAFs和PC9細胞，使PC9對EGFR-TKI厄洛替尼產(chǎn)生了耐藥性［IC50＜0.01 μmol/L，轉(zhuǎn)變?yōu)镮C50=0.05 μmol/L（P＜0.05）］，其機制可能和hedgehog（Hh）信號通路激活和CAF誘導(dǎo)PC9細胞表型上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition, EMT）有關(guān)。Yoshida等[36]的研究，通過評價共培養(yǎng)EGFR突變的肺腺癌細胞系和podoplaninposiotive CAFs對EGFR-TKIs吉非替尼治療的敏感性，探討EGFR基因突變的NSCLC對EGFR-TKI靶向治療的敏感性是否受podoplanin-positive CAFs的影響。其結(jié)果和對照組相比，共培養(yǎng)了podoplanin-positive CAFs肺腺癌細胞系表現(xiàn)出更強的耐藥性，對于術(shù)后復(fù)發(fā)的患者，podoplanin-positive CAFs組和podoplanin-negative CAFs組相比，總體表現(xiàn)出對EGFR-TKIs更低的治療反應(yīng)（53% vs 83%； P＜0.01）?？梢?，podoplanin-positive CAFs對EGFRTKIs原發(fā)性耐藥起重要作用，是一個理想的治療靶點，可聯(lián)合EGFR-TKIs用于治療EGFR突變的NSCLC患者。值得注意的是，Ishibashi等[37]探討了CD200-positive CAFs對EGFR突變的肺腺癌PC9細胞系EGFR-TKIs吉非替尼治療的敏感性的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)共培養(yǎng)PC9和CD200-positive CAFs，可以增強吉非替尼對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)，而對于未加入吉非替尼培養(yǎng)基組內(nèi)，腫瘤細胞的生存不受影響。同時，他們也對術(shù)后復(fù)發(fā)的肺腺癌患者手術(shù)切除的樣本進行免疫組化的分析，含有CD200-positive CAFs患者組，其接受吉非替尼治療后的無進展生存期（progression-free survival, PFS）明顯延長。因此他們認為，CD200-positive CAFs可以增強EGFR-TKIs治療的敏感性，擁有更深遠的臨床應(yīng)用價值。綜上所述，CAFs可影響EGFR突變的肺腺癌細胞系對EGFR-TKIs分子靶向治療的敏感性，其機制可能和CAFs誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象和激活Hh信號通路有關(guān)，但仍需要進一步研究證實。而在EGFRTKIs耐藥的NSCLC患者中，針對CAFs靶點研究值得進一步深入，其有望與EGFR-TKIs聯(lián)合治療，進一步延長腫瘤患者PFS。

1.5 髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC） MDSC是一類具有免疫抑制功能的細胞群，參與抗腫瘤免疫抑制，促進腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸[38]。Holdman等[39]在乳腺癌復(fù)發(fā)機制的研究中，對荷瘤小鼠使用成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor, FGFR）抑制劑BGJ398后，發(fā)現(xiàn)腫瘤快速消退伴有MDSC水平顯著降低，在停止治療后，大多在1個月-4個月出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)的腫瘤組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)磷酸化的EGFR表達和MDSC水平升高，考慮EGFR信號通路激活參與了腫瘤的復(fù)發(fā)。而聯(lián)合使用EGFR抑制劑拉帕替尼組與單用BGJ398組相比，腫瘤復(fù)發(fā)時間延長，MDSC水平再次降低。結(jié)論為EGFR信號上調(diào)和乳腺癌復(fù)發(fā)有關(guān)，聯(lián)合EGFR抑制劑治療可以延長PFS。研究者認為，此項研究雖然沒有直接闡明MDSC水平是否能影響EGFR-TKI療效，但間接表達MDSC水平與EGFR信號、腫瘤復(fù)發(fā)之間存在著一定的聯(lián)系。Feng等[40]研究認為，S100A9 MDSC是EGFR突變的晚期肺腺癌患者使用吉非替尼一線治療PFS的獨立危險因素之一（HR=4.944, 95%CI： 1.578-15.490,P=0.006），與低水平MDSC患者相比，高水平MDSC患者的PFS更短［中位PFS 7.2個月（95%CI： 5.5-8.9） vs 12.7個月（95%CI： 8.1-17.2），P=0.014］?？梢奡100A9 MDSC可能影響EGFR-TKIs的治療反應(yīng)。

2 PD-1及其配體PD-1L/PD-2L與EGFR-TKIs療效的關(guān)系

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，在人類和小鼠的多種細胞（T細胞、B細胞、NK細胞、DC以及活化的單核細胞等）均有表達，而其配體PD-1L/PD-2L常表達于腫瘤細胞表面，包括NSCLC。并且，大約有20%的晚期NSCLC患者受益于PD-1阻斷劑，第一代PD-1阻斷劑pembrolizumab和nivolumab于2015年獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準用于晚期NSCLC患者的二線治療[41]。值得注意的是，在基因突變的NSCLC患者中，EGFR信號可以上調(diào)PD-1、PD-1L的表達，進而調(diào)節(jié)免疫逃逸反應(yīng)，影響EGFR-TKIs療效[42,43]，其機制可能和IL-6/Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（IL-6/JAK/STAT3）信號通路有關(guān)[44]。Lin等[45]的臨床隊列研究中，通過免疫組織化學(xué)法檢測接受EGFR-TKIs的晚期NSCLC腫瘤組織內(nèi)的PD-1和PD-1L表達，多變量分析模型和生存分析模型驗證PD-1/PD-1L的表達與患者PFS和總生存期（overall survival, OS）的關(guān)系。有53.6%的患者陽性表達PD-1L，表明在這些患者中，至少有一半的患者可以聯(lián)合接受PD-1L阻滯劑治療，并可能從中獲益。結(jié)果顯示，和不表達PD-1L的NSCLC患者相比，陽性表達PD-1L擁有更長的PFS（HR=0.46, P=0.014）和OS（HR=0.26, P=0.002）；而陽性表達PD-1與不表達PD-1的NSCLC患者相比，PFS（P=0.907）和OS（P=0.640）無明顯差異。因此認為PD-1L或許可以作為NSCLC患者EGFR基因突變和接受EGFR-TKIs抑制劑臨床預(yù)后的生物學(xué)標志物。PD-1/PD-1L抑制劑的成功問世，是晚期EGFRTKIs耐藥的NSCLC患者的福音，目前推薦單用二線治療。對EGFR-TKIs獲得性耐藥患者，聯(lián)合使用PD-1/PD-1L抑制劑和EGFR-TKIs似乎是更有前景的治療策略，而近期的系列臨床實驗結(jié)果顯示：在化療前或化療后的NSCLC，聯(lián)合使用osimertinib和durvalumab顯示了更優(yōu)的臨床結(jié)局，但這種聯(lián)合提高了間質(zhì)性肺病的發(fā)生率（38%）；吉非替尼聯(lián)合durvalumab的治療作用同樣顯著，但3級-4級肝毒性的發(fā)生率顯著升高（40%-70%）；同樣幾組聯(lián)合方式，但均顯示3級-4級不良事件的增加；總的來說，對NSCLC聯(lián)合使用PD-1/PD-1L抑制劑和EGFR-TKIs，因其治療相關(guān)的毒性反應(yīng)發(fā)生率高而受到限制，但仍然不失為一個有前景的治療策略，有待進一步研究[46]。

3 總結(jié)

腫瘤微環(huán)境是腫瘤細胞賴以生存和發(fā)展的復(fù)雜環(huán)境，而這微環(huán)境內(nèi)的免疫細胞及其調(diào)節(jié)方式對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起著重要的作用。如今，分子靶向治療開啟了腫瘤治療的新潮流，而如何應(yīng)對分子靶向藥物耐藥或者療效不佳成為了我們新的挑戰(zhàn)。本篇綜述從腫瘤微環(huán)境免疫細胞及其調(diào)節(jié)方式以及PD-1/PD-1L的角度出發(fā)，闡述了其可能對EGFR-TKIs療效的影響，為免疫治療和分子靶向治療提供新的契合點。