陶薩茹拉，李春生，烏力吉，解 軍，何托雅，馬莉梅，王 莉，杜建儒，莫 仁，康鳳祥，邢玉梅，何云梅，吉日嘎拉

（1.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市家畜改良工作站，東勝 017000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧總站，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，烏蘭 017002）

阿爾巴斯白絨山羊超數(shù)排卵和冷凍胚胎生產(chǎn)技術研究

陶薩茹拉1，李春生1，烏力吉1，解 軍1，何托雅1，馬莉梅1，王 莉1，杜建儒1，莫 仁1，康鳳祥2，邢玉梅2，何云梅3，吉日嘎拉3

（1.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市家畜改良工作站，東勝 017000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧總站，呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗家畜改良工作站，烏蘭 017002）

為了更好地保護阿爾巴斯白絨山羊這一優(yōu)良的地方品種，采取同期發(fā)情及超數(shù)排卵技術，對34只羊進行了手術法胚胎回收。結果表明：34只供體羊共沖出胚胎244枚，其中可用胚胎215枚，冷凍胚胎215枚，共封裝冷凍99管。

阿爾巴斯白絨山羊；超數(shù)排卵；冷凍胚胎

阿爾巴斯白絨山羊是經(jīng)過長期的自然選擇和人工選育而形成的地方良種，所產(chǎn)羊絨以細、長、柔軟而著稱，素有“纖維寶石”之美譽，是世界一流的絨肉兼用型品種。

近年來，由于政府部門沒有出臺“優(yōu)絨優(yōu)價”的收購政策，阿爾巴斯白絨山羊養(yǎng)殖戶受短期利益的驅(qū)動，加之飼養(yǎng)成本成倍增加，當?shù)仞B(yǎng)殖戶片面追求羊絨產(chǎn)量，竭力提高羊絨單產(chǎn)，無計劃地引入其他品種的絨山羊進行雜交，導致其羊絨直徑變粗，使阿爾巴斯白山羊這一優(yōu)良品種資源面臨混雜的危險。因此，通過本試驗胚胎冷凍保存，建立阿爾巴斯白絨山羊基因庫，可以起到長期保護這一優(yōu)良地方品種的作用［1］。

1 材料與設備

1.1 試驗動物

1.1.1 供體羊選擇

供體公羊：絨細度在15 μm以下、產(chǎn)絨量1 000 g以上的優(yōu)質(zhì)阿爾巴斯白絨山羊6只。

供體母羊：絨細度在14.5 μm以下的優(yōu)質(zhì)阿爾巴斯白絨山羊34只。

1.1.2 受體羊選擇 受體羊選擇體型較大，繁殖率較高，哺乳力較強，母性和適應性強的健康羊只。

1.2 設備及藥劑

器材、儀器：白紗布，手術刀，鑷子，大頭針，三棱針，三通管，縫合線，刮毛刀，注射器，培養(yǎng)皿，移液槍，槍頭；顯微鏡，恒溫箱，恒溫水浴鍋，烘干箱，高壓滅菌鍋，凈水儀，數(shù)碼照相機，恒溫臺［2］。

藥品：陰道栓（CIDR栓），前列腺素（PG），孕馬血清（PMSG），促卵泡素（FSH），促黃體素（LH），麻藥，磷酸鹽緩沖液（PBS），保存液，酒精，新潔爾滅，石蠟油，孕馬血清促性腺激素，乙二醇［2］。

冷凍液配制方法

I液：PBS緩沖液；II液：乙二醇∶保存液=1∶2；III液：乙二醇∶保存液=2∶1；IV液：乙二醇［3］。

2 方法

2.1 供體羊超數(shù)排卵

CIDR+FSH+PG法：在母羊發(fā)情周期的任意一天陰道放入CIDR栓，記為0 d，然后從第10天開始肌注FSH，時隔12h早晚各等量注射一次，常以遞減法連續(xù)注射3d。在第5次注射FSH的同時注射PG，并撤出CIDR栓。次日開始試情并對發(fā)情母羊進行人工授精，并注射LH［1］。

2.2 胚胎的采集及檢測

在配種后第6.5天，通過手術法回收胚胎，并對胚胎進行質(zhì)量鑒定，劃分等級［4］。

2.3 胚胎冷凍

2.3.1 胚胎清洗及平衡 采用常規(guī)冷凍法進行冷凍。將胚胎收集好后，鑒定，將A級、B級桑葚胚或囊胚洗凈后移入II液中停留6～7min，再取出放入III液中停留6～7min，使細胞內(nèi)部抗凍劑濃度基本達到飽和。最后移入IV液中準備冷凍［5］。

2.3.2 胚胎裝管 將胚胎和冷凍液按照乙二醇溶液→空氣→含有胚胎的乙二醇溶液→空氣→乙二醇溶液的順序吸入提前標記好供體號和冷凍日期的0.25細管中，再在細管外標記胚胎數(shù)量和等級［6］。

2.3.3 胚胎冷凍和植冰 將細管直接浸入冷凍的液氮浴槽內(nèi)，選擇程序，以1℃/min的速度從室溫降至-6℃，停留5 min后用頂端纏好棉花冷凍過的鑷子捏住細管一端植冰，再保留10 min，以0.3℃/min的速度降至-36℃，再以0.1℃/min的速度降至-38℃，在液氮中熏蒸短時間后，直接投入液氮，長期保存［6-7］。

3 結果

3.1 供體母羊胚胎采集情況

供體母羊沖胚共34只，總沖出胚胎244枚，其中可用胚胎215枚，A級胚胎208枚，二級胚胎7枚；胚胎可利用率88.11%，供體平均沖胚7.18枚/只，只均沖出可利用胚6.32枚。

3.2 胚胎冷凍情況

共冷凍胚胎215枚，其中桑葚胚7枚（3.26%）,緊縮桑葚胚172枚（80%），早期囊胚9枚（4.19%），囊胚20枚（9.30%），擴張囊胚7枚（3.25%），封裝冷凍99管。

4 分析與討論

（1）利用胚胎冷凍保存可建立家畜和瀕危動物基因庫，免受各種災害造成品種滅絕的危險。阿爾巴斯白絨山羊作為一個優(yōu)良的地方品種，近年來由于受絨價下跌的影響，牧民為了追求更高的經(jīng)濟效益，使用絨纖維粗、產(chǎn)絨量高的品種進行雜交的現(xiàn)象嚴重，所以除通過政府補貼及建立保護區(qū)等形式鼓勵牧民保護這一優(yōu)良地方品種外，胚胎冷凍保存也是很好的保護措施之一。

（2）研究表明，發(fā)情后6.5 d采集的胚胎均處于緊縮桑葚胚至早期胚泡階段，此時的胚胎解凍后的存活率可高達91.18%，遠遠高于孵化囊胚解凍后的存活率，表明冷凍胚胎的最佳采集時間為供體羊發(fā)情后的6.5 d［3］。

（3）胚胎程序化冷凍是指將胚胎移入含低濃度抗冷凍劑的冷凍保存液中，通過程序冷凍控制儀使胚胎緩慢降溫，以誘導胚胎外液形成冰晶，胚胎內(nèi)形成玻璃化狀態(tài)，而使胚胎存活的技術［1］。這是目前胚胎冷凍最常用的一種方法。龐彥等［8］的研究證明，對于桑葚胚的冷凍，程序化冷凍方法的形態(tài)正常率高于玻璃化冷凍；在發(fā)育率方面，程序化冷凍桑葚胚、解凍后發(fā)育率也高于玻璃化冷凍方法。本研究大部分胚胎為桑葚胚，所以根據(jù)上述研究結果，選擇了程序化冷凍方法進行冷凍保存。

（4）程序化冷凍過程緩慢，時間較長使細胞內(nèi)水分的滲出、胚胎保護劑的滲入和冰晶的形成達到一定的平衡狀態(tài)，所以形成的冰晶數(shù)量極少，從而不會對胚胎造成致命的傷害［8］。但是此過程必須依賴昂貴的冷凍儀才能完成，成本較高，而且冷凍過程較長，在冷凍數(shù)量較多的情況下花費的時間較長［9］。

［1］朱士恩.家畜繁殖學［M］.6版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：232-243.

［2］龐春英，楊春艷，李日聰，等.不同冷凍方法對水牛體外生產(chǎn)胚胎冷凍效果的研究［C］//中國畜牧獸醫(yī)學會動物繁殖學分會第十五屆學術研討會論文集.天津：中國畜牧獸醫(yī)學會，2010：23-28.

［3］趙霞.純種肉羊超數(shù)排卵和胚胎冷凍試驗［J］.黑龍江動物繁殖，2007（5）：21-22.

［4］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.綿羊胚胎移植技術規(guī)程：NY/T826—2004［S］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

［5］趙霞.純種肉羊超數(shù)排卵和胚胎冷凍技術的研究［J］.畜牧與飼料科學，2007（5）：32-33.

［6］余文麗，李樹靜，包呼格吉樂圖，等.牛胚胎一步細管冷凍解凍技術的研究和應用［J］.中國畜牧雜志，2000，36（2）：45.

［7］李武，王健，叢慧敏，等.優(yōu)質(zhì)肉羊冷凍胚胎移植應用技術研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（8）：10-11.

［8］龐彥，張勝.牛、羊胚胎冷凍方法探討［J］.獸醫(yī)導刊，2011（S1）：229-230.

［9］楊中強，朱士恩.不同冷凍和解凍方法對小鼠桑葚胚發(fā)育的影響［J］.中國畜牧雜志，2006，12（1）：5-8.

S827.3

A

2095-3887（2017）02-0064-02

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.02.021

2017-01-10

內(nèi)蒙古現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)科技服務體系絨毛用羊示范推廣團隊建設項目；鄂爾多斯市絨山羊選育提高項目

陶薩茹拉(1983-)，女，中級畜牧師，碩士研究生。

烏力吉(1968-)，男，副高級畜牧師，副站長。