（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

豬弓形蟲病最新檢測方法研究概況

莊金秋，梅建國，張 穎，楊麗梅，李 峰，沈志強

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州 256600）

弓形蟲病是一種人獸共患寄生蟲病。本文綜述了豬弓形蟲病的最新實驗室檢測方法研究情況，如病原學檢測方法、血清學檢測方法（包括凝集試驗和ELISA）和分子生物學檢測方法（包括PCR、熒光定量PCR、PCR-RFLP、原位PCR、免疫-PCR、環(huán)介導等溫擴增法和核度探針技術(shù)）等，闡述了不同檢測方法的檢測效果和優(yōu)缺點，以期為豬弓形蟲病的檢測與防控提供參考。

弓形蟲；豬弓形蟲病；檢測方法；研究進展

弓形蟲?。═oxoplasmosis）是由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）引起的一種人獸共患原蟲病。該病主要引起孕婦流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、畸胎、死胎以及兒童生長發(fā)育受阻、死亡。在家畜中，弓形蟲病主要感染豬，以高熱、呼吸困難、神經(jīng)癥狀以及繁殖障礙為特征。據(jù)了解，我國養(yǎng)豬場中曾大規(guī)模暴發(fā)弓形蟲病，死亡率高達60%，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了極大的經(jīng)濟損失。據(jù)近年來的弓形蟲病血清學調(diào)查結(jié)果顯示，豬弓形蟲病感染率較高，且呈逐年上升趨勢。豬弓形蟲病嚴重威脅著動物健康和人類公共衛(wèi)生安全，因此實時監(jiān)測豬群弓形蟲感染對于防控該病尤為重要。由于豬多表現(xiàn)為隱性感染，其臨床癥狀和病理變化與豬瘟相似，因此需要進行實驗室檢測才能確診。本文綜述了近年來豬弓形蟲病實驗室檢測方法研究進展，以期為科研工作者和廣大養(yǎng)豬業(yè)主更好地防治該病提供參考。

1 病原學檢測方法

病原學檢測方法包括直接涂片染色或組織切片染色觀察法、動物接種或細胞培養(yǎng)法、卵囊檢查法等。該方法是查驗弓形蟲最可靠的方法，缺點是敏感性低、耗時長、容易漏診[1]。

2 血清學檢測方法

2.1 凝集試驗

主要包括直接凝集試驗（DAT）、間接血凝試驗（IHAT）、乳膠凝集試驗（LAT）以及改良凝集試驗（MAT）。IHAT主要用于大規(guī)模的流行病學調(diào)查，Senet等[2]證實了IHAT檢測IgM抗體更敏感，且比間接免疫熒光試驗（IFAT）更能檢測低滴度弓形蟲抗體。王天奇等[3]、王海燕等[4]先后以IHAT方法調(diào)查河南洛陽地區(qū)豬弓形蟲感染情況，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)豬弓形蟲感染有明顯上升趨勢。羅才慶等[5]應用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和IHAT方法，平行檢測來自福建龍巖市某豬場的32份豬血清中抗弓形蟲特異性抗體，結(jié)果顯示ELISA和IHAT方法對豬弓形蟲的抗體陽性檢出率分別為62.5%（20/32）和53.13%（17/32）。王貝貝等[6]發(fā)現(xiàn)MAT方法適用于對初篩樣本以及臨床疑似弓形蟲感染個體的篩查，但該法費時費力，不宜在基層推廣使用。Lorry等[7]認為MAT方法可用于畜群血清學檢測，且該法可作為檢測組織液的良好候選法。

2.2 ELISA

ELISA是國內(nèi)外多數(shù)實驗室檢測弓形蟲抗體的最常用方法。管剛等[8]用弓形蟲的重組蛋白P30作為抗原建立了ELISA方法，對青海省互助縣的139份豬血清抗體進行豬弓形蟲病檢測，陽性率為5.76%，應用IHAT方法檢出的陽性率為13.67%，ELISA檢測的陽性率明顯低于IHAT檢出的陽性率。江濤等[9]應用弓形蟲重組微線體蛋白3（rMIC3）作為包被抗原建立了間接ELISA方法，以ELISA與LAT平行檢測471份豬血清樣本，弓形蟲抗體陽性檢出率分別為39.49%和44.16%，二者總符合率為92.56%。羅才慶等[5]對ELISA和IHAT比較發(fā)現(xiàn)，ELISA更適用于豬弓形蟲抗體檢測。楊亞曉等[10]比較金標法、IHAT和ELISA發(fā)現(xiàn)，ELISA檢測弓形蟲IgG抗體的敏感性和特異性較高，適合于大規(guī)模的弓形蟲IgG抗體篩查。丁邦勝等[11]建立了3種重組抗原（rSAG1 + rHXGPRT + rAK）混合的間接ELISA方法，檢測弓形蟲IgM和IgG。Bartomiej等[12]使用5組弓形蟲重組嵌合抗原建立ELISA方法，檢測馬、豬、羊3種家畜動物血清中的IgG，結(jié)果顯示所有嵌合抗原具有高特異性（100%）。許正茂等[13]以弓形蟲TgSAG2蛋白作為包被抗原，對新疆巴州地區(qū)433份豬血清樣品進行了ELISA檢測，平均陽性率為12.70%（55/433），其中，散養(yǎng)豬場陽性率為16.83%（35/208），規(guī)?；B(yǎng)殖場為9.94%（16/161），散養(yǎng)豬場陽性檢出率顯著高于規(guī)?；B(yǎng)殖場。邵曉冬等[14]采集河南洛陽地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶母豬、育肥豬、保育豬血清樣品410份，應用ELISA方法檢測抗弓形蟲IgG抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬弓形蟲血清抗體陽性率達35.4%，母豬、育肥豬和保育豬的陽性率分別是50.4%、34.5%和22.2%，規(guī)模養(yǎng)殖場母豬及育肥豬陽性率極顯著或顯著低于散養(yǎng)戶。目前，市場上的各種豬弓形蟲病ELISA診斷試劑盒質(zhì)量參差不齊，進口試劑盒與國產(chǎn)試劑盒的符合率、敏感性和特異性都存在較大差距。何勇等[15]、白昀等[16]先后比較國內(nèi)外ELISA商品化試劑盒后提出，選用臨床試劑盒時可從性價比方面考慮，選用質(zhì)優(yōu)價廉的國產(chǎn)試劑盒，不必完全依賴進口試劑盒，但在確有必要引進國外試劑盒時，也應選用質(zhì)量穩(wěn)定可靠的產(chǎn)品。

3 分子生物學檢測方法

3.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

目前，根據(jù)研究者選擇弓形蟲基因組中拷貝數(shù)和保守型的不同，PCR檢測技術(shù)的靈敏度和特異性也有所不同，常作為弓形蟲檢測的基因主要有：200～300個拷貝的529 bp重復序列，基于35個拷貝數(shù)的B1基因、P30基因，以及核糖體第一內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS-1序列）等。

Homan等[17]從弓形蟲基因組中鑒定出200～300個拷貝的529 bp DNA片段，可作為遺傳標記，用于弓形蟲與其他寄生蟲的種間鑒定。宋慧群等[18]對我國不同宿主、不同地域的9個弓形蟲蟲株及國際標準強毒株（RH株），在529 bp重復序列的變異進行研究，進一步證實了該DNA片段可用于種間鑒定。Edvinsson等[19]針對529 bp重復序列181～274 bp位設(shè)計引物，檢測下限約為1個弓形蟲速殖子。Opsteegh等[20]針對529 bp重復序列243～405 bp位設(shè)計引物，檢測下限約0.14個速殖子。趙東岳等[21]針對529 bp重復序列178～376 bp位設(shè)計引物，最低檢出限僅為173個拷貝。候照峰等[22]針對529 bp重復序列268～359 bp位設(shè)計引物，檢測下限10個拷貝，約0.03～0.05個速殖子。

B1基因是從弓形蟲RH株基因組文庫中克隆篩選的1個2.2 kb的片段，它是在整個基因組中有35個拷貝的串聯(lián)重復片段。Hoyen等[23]應用B1基因設(shè)計合成引物，成功建立了巢式PCR方法用于檢測病人血液樣品中的弓形蟲。王海燕等[4]以B1基因作為弓形蟲種特異的遺傳標記，建立診斷弓形蟲病特異性的PCR方法，最低能檢測到10個弓形蟲速殖子DNA。P30基因為編碼弓形蟲速殖子表膜蛋白。Sawa等[24]首先應用P30基因設(shè)計引物進行PCR檢測，發(fā)現(xiàn)對所檢測的7株弓形蟲株都能擴增，且對任何其他寄生蟲與微生物都未見擴增。崔平等[25]以P30基因設(shè)計引物建立的PCR方法，最低能檢測到5個弓形蟲速殖子的DNA?？椎孟璧萚26]以P30基因設(shè)計了3條特異性引物，建立了半巢式PCR方法，最低檢測的DNA含量為18 fg。

ITS序列是各物種間相對較為保守的序列，已成為在序列水平上探討科內(nèi)、屬間及種間遺傳關(guān)系的有效手段。Homan等[27]證實ITS-1可作為分子標記物，用于弓形蟲與其他原蟲的種間鑒定。Jauregui等[28]根據(jù)弓形蟲ITS-1序列設(shè)計引物建立PCR，敏感性最少可檢100 fgDNA，相當于1個蟲體的DNA含量。謝德華等[29]以ITS-1序列作為弓形蟲種特異性的遺傳標記，建立了PCR方法。廖申權(quán)等[30]應用該法對2例豬弓形蟲病進行了特異診斷。邵國青等[31]以弓形蟲ITS-1序列為遺傳標記建立PCR，最低可以檢測1 pg弓形蟲速殖子DNA，相當于10個速殖子的DNA。黃翠琴等[32]分別以弓形蟲ITS-1序列和529 bp重復序列為目的片段，對疑似豬弓形蟲病的病料進行PCR診斷。

弓形蟲微線體蛋白MIC是分布于蟲體前端棒狀體周圍的微線體所分泌的粘附因子。MIC3在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達，在弓形蟲病的早期診斷中具有重要價值。任科研等[33]以MIC3基因作為弓形蟲特異的遺傳標記，建立了PCR方法，為弓形蟲基因重組疫苗奠定了基礎(chǔ)。

3.2 熒光定量PCR

王頻佳等[34]、Lin等[35]先后建立了以弓形蟲高度保守的529 bp重復序列作為檢測靶基因的熒光定量PCR。候照峰等[22]以529 bp重復序列作為靶基因建立了熒光定量PCR方法，檢測的69個組織樣品中，熒光定量PCR方法的檢出率（50.7%）明顯高于常規(guī)PCR方法的檢出率（34.8%）。朱祥明等[36]建立了以B1基因作為檢測靶基因的弓形蟲SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法。Edvinsson等[19]分別以529 bp重復序列和B1基因為靶基因建立熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)529 bp的靈敏性是B1基因的10倍。Menotii等[37]根據(jù)529 bp序列設(shè)計Taq Man-AF-PCR檢測方法，與B1-PCRELISA檢測方法相比，144份臨床樣本中，B1-PCR-ELISA檢測出的72份陰性樣本，經(jīng)過Taq Man-AF-PCR檢測出15份（20.8%）為陽性，且可提前4～10 d檢測到病原。趙東岳等[38]以529 bp重復序列、ITS-1序列和B1基因作為檢測的靶基因，建立檢測弓形蟲的三重SYBR Green I實時熒光定量PCR方法，并與ELISA進行比較，陽性符合率為53.44%（P<0.01），表明建立的三重SYBR Green I熒光定量PCR具有高特異性和敏感性，可為臨床弓形蟲的診斷提供科學依據(jù)。

3.3 聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）

謝德華等[39]通過對我國不同來源、不同宿主的4個弓形蟲蟲株以及國際標準強毒株RH株的致密顆?？乖℅RA6）基因進行PCR-RFLP分析，結(jié)果證明弓形蟲包含了I和II基因型。Su等[40]利用10個基因標記物建立了多重多位點巢式PCRRFLP進行基因分型。Zhou等[41]從來自我國湖北省、河南省的434頭病豬中分離出16個弓形蟲蟲株，用PCR-RFLP方法也鑒定出2個基因型。

3.4 原位PCR（In Situ PCR，IS-PCR）

盧慎[42]應用免疫組化、原位雜交及間接原位PCR技術(shù)，檢測組織細胞中的弓形蟲，結(jié)果表明弓形蟲檢測結(jié)果陽性率從高到低依次為間接原位PCR、原位雜交及免疫組化。

3.5 免疫-PCR（I-PCR）

李輝等[43]建立免疫-PCR檢測弓形蟲抗原最低濃度為0.1 ng/mL，I-PCR檢測弓形蟲抗原靈敏度高于傳統(tǒng)ELISA檢測6 000倍，高于ABCELISA 750倍。

3.6 環(huán)介導等溫擴增法（LAMP）

鄒杰等[44]建立的弓形蟲LAMP法能夠檢測出10個拷貝的目的基因。余傳信等[45]依據(jù)弓形蟲的B1基因設(shè)計引物建立LAMP方法，其敏感性是常規(guī)PCR的10倍。Sotiriadou等[46]分別以LAMP和套式PCR方法對26個弓形蟲的陽性水樣進行檢測分析，結(jié)果LAMP的檢出率為100%，而套式PCR的檢出率為53.8%。Zhang等[47]根據(jù)弓形蟲529 bp重復序列設(shè)計引物，對疑似弓形蟲感染的豬分別以常規(guī)PCR方法和已建立的LAMP方法檢測其淋巴結(jié)樣本，結(jié)果LAMP檢測的陽性率為85.7%，而常規(guī)PCR檢測的陽性率為76.9%。曹利利等[48]在建立LAMP方法的基礎(chǔ)上，對吉林省部分地區(qū)的423份豬血液樣本進行了豬弓形蟲病檢測，陽性率為7.8%（33/423），表明該地區(qū)仍是豬弓形蟲病的流行地區(qū)。

4 小結(jié)

豬弓形蟲感染途徑多、傳播方式廣，且目前尚無特效治療藥物和方法。因此，加強養(yǎng)殖環(huán)節(jié)對該病的預防控制，提高豬產(chǎn)品中弓形蟲檢測技術(shù)水平，對減少其對養(yǎng)豬業(yè)的危害、降低其通過豬產(chǎn)品而致人感染的風險性，具有極其重要的意義。目前，豬弓形蟲病檢測方法很多，其中以病原學方法結(jié)果最為可靠，但其敏感性低，且費時費力。常規(guī)的免疫學方法雖具有簡易、快速等優(yōu)點，但對于陽性結(jié)果的分析要慎重。以PCR為代表的分子生物學方法具有敏感、特異、檢測迅速等優(yōu)點，能直接反應現(xiàn)癥感染，但存在假陽性、操作繁瑣、需專用儀器等缺點。因此，在實際中應按照國家或行業(yè)標準，根據(jù)業(yè)主生產(chǎn)環(huán)節(jié)及加強防疫衛(wèi)生的需要，選擇弓形蟲病檢測方法和配套試劑，以滿足生產(chǎn)管理和公共衛(wèi)生需求，使豬弓形蟲病檢測方法得到更快、更好的發(fā)展。

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（責任編輯：杜憲）

Research Progress on Detection Methods of Swine Toxoplasmosis

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Yang Limei，Li Feng，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science and Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Toxoplasmosis is a zoonotic parasitic disease. The research progress on the latest detection methods of Swine Toxoplasmosis were introduced in this paper，inluding the pathogenic serological detection methods，detection methods（including agglutination test and ELISA），molecular biological detection methods（including PCR，PCR，PCR-RFLP，fluorescence quantitative PCR，in situ immune -PCR，loop mediated isothermal amplification of probe and nuclear technology）and so on. The advantages and disadvantages of different detection methods were analyzed，in order to provide reference for the detection and prevention of Swine Toxoplasmosis

Toxoplasma gondii；swine toxoplasmosis；detection method；research advance

S855.9+9

：B

：1005-944X（2017）06-0063-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.020

山東省重點研發(fā)計劃項目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目（SDAIT-08-17）