劉思琪，趙明明

(1.中國中藥公司，北京 100195；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所，北京 100193)

·綜述·

基于高通量測序技術的菌根共生研究概況

劉思琪1，趙明明2*

(1.中國中藥公司，北京100195；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)院藥用植物研究所，北京100193)

菌根是自然界中普遍存在的一種共生現(xiàn)象，它是由土壤中的菌根真菌與高等植物根系形成的一種共生體。鑒于其在自然界中的重要作用，菌根研究日益引起世界各國學者的普遍關注。本文歸納總結(jié)了主要菌根互作類型叢枝菌根、外生菌根和蘭科菌根利用高通量測序技術的研究進展。

高通量測序；叢枝菌根；外生菌根；蘭科菌根

大約有90%的陸地植物可與土壤菌根真菌共生，形成菌根。菌根的形成在土壤結(jié)構(gòu)、植物養(yǎng)分吸收與生長、生物多樣性及農(nóng)業(yè)和自然生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力等方面發(fā)揮重要作用[1]。根據(jù)形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同，菌根可分為叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)、漿果鵑類菌根(Arbutoid mycorrhiza)、外生菌根(Ectomycorrhiza，EM)、歐石南類菌根(Ericoid)、石晶蘭類菌根(Monotropoid mycorrhiza)和蘭科菌根(Orchid mycorrhiza)。其中最普遍且最有經(jīng)濟價值的兩大類當屬與農(nóng)業(yè)中絕大部分的谷類作物、蔬菜和水果等共生的叢枝菌根以及與樹木、灌木共生的外生菌根。

1 叢枝菌根

叢枝菌根(AM)真菌是一類以特定的形式定植于植物體根細胞，從而協(xié)調(diào)植物生長的真菌種類。AM真菌從特定的接口入侵植物，從而建立共生關系[2]。基于分子生物學的叢枝菌根共生研究已開展多年，并取得了一定成果。在植物方面，已經(jīng)建立有關AM共生cDNA的文庫，通過抑制性消減雜交技術獲得大量的克隆，測序得到AM共生相關表達序列標簽EST[3]等方面的工作。所獲得的ESTs可以轉(zhuǎn)移到固相載體(陣列)，從而使不同來源獲得的cDNA雜交RNA以積累AM共生過程中的基因表達概況；在真菌方面，EST庫也正在建立，同樣采用的是直接克隆及抑制性消減雜交技術。雙方的互作關系主要表現(xiàn)為一些相關基因的調(diào)節(jié)和功能驗證，以及各自在共生體系中扮演的角色，這已成為科學界關注的熱點[4]。

蒺藜苜蓿Medicagotruncatula和百脈根Lotusjaponicas作為AM菌根互作研究的模式植物[5-6]，已分別進行了基因組測序和突變體篩選[7-9]等方面的研究。Frenzel等[10]已成功構(gòu)建的隨機cDNA文庫MtAMP，來源于蒺藜苜蓿與叢枝菌根真菌Glomusintraradices共生后的主要發(fā)育階段的組織樣品，文庫中共包含了5’端ESTs 3448條。Journet等[11]也在2002年構(gòu)建了含有8567條ESTs的蒺藜苜蓿和叢枝菌根真菌G.intraradices的隨機cDNA文庫MtBC。隨后，Liu等[12]在2003年建立了包含9030條ESTs的蒺藜苜蓿和叢枝菌根真菌G.versiforme的隨機cDNA文庫MHAMHE MHAM2。由于從隨機文庫中發(fā)現(xiàn)高表達的基因是比較困難的，研究趨勢轉(zhuǎn)為用差減測序技術替代隨機cDNA文庫技術[13]。在采用抑制差減雜交(SSH)cDNA文庫方法建立的蒺藜苜蓿和叢枝菌根真菌根的差減雜交EST文庫MtGIM中，對照組分別是未被侵染的根、磷酸鹽處理的根、苜蓿根瘤菌Sinorhizobiummeliloti侵染的根和豌豆褐斑菌Aphanomyceseuteiches侵染的根，共獲得了1686條ESTs，這些序列中很大一部分被證明是菌根誘導相關基因[14-15]。AM菌根真菌G.mosseae建立了附著胞生長相關的SSH cDNA文庫，獲得658條ESTs，這些序列被用于研究共生最早期的真菌基因表達[16]。Ouziad等[17]對AM菌根真菌G.intraradices進行不同外源因子刺激后，菌絲生長的SSH cDNA文庫中共獲得2059條ESTs。Hildebrandt等[18]以G.intraradices的萌發(fā)孢子和向外緣生長的菌絲為材料構(gòu)建的2個SSH cDNA文庫中，共獲得3708條ESTs。由菌根組織獲得的ESTs中，真菌序列低于10%，而來源于AM根的序列主要用于發(fā)現(xiàn)與菌根共生的建立和功能相關的植物基因[19-20]。

微列陣技術也是近年來研究有多少基因能相互作用以及一個細胞網(wǎng)如何同時控制大量基因的新方法。微陣列分為cDNA微陣列和寡聚核苷酸微陣列。微陣列技術就是利用分子雜交原理，使同時被比較的標本(用同位素或熒光素標記)與微陣列雜交，通過檢測雜交信號強度及數(shù)據(jù)處理，把他們轉(zhuǎn)化成不同標本中特異基因的豐度，從而全面比較不同標本的基因表達水平的差異[21]。微陣列技術是一種探索基因組功能的有力手段[22]。在蒺藜苜蓿M.truncatula中首先建立了含有6359個EST簇的根的微陣列Mt6k-RIT[23]。這些序列代表了來源于氮缺乏根的cDNA文庫、幼小根瘤cDNA文庫和AM菌根cDNA文庫的21 473條ESTs[24]?；诨ê投骨v隨機cDNA文庫中的2516條ESTs、1776個cDNA克隆經(jīng)聚合酶鏈式反應(PCR)擴增后補充到Mt6k-RIT中，建立了新的Mt8k cDNA芯片，該芯片上大約有6300個M.truncatula的基因探針[25]。關于豆科模式植物M.truncatula的其他基因組表達分析還包括AM菌根的2.5 k cDNA宏陣列和6 k微陣列[26-27]。近幾年來cDNA探針逐漸被70mer寡聚核苷酸代替[28]。

2 外生菌根

以歐洲山楊Populustremula和毒蠅鵝膏Amanitamuscaria為外生菌根互作研究的模式共生體系中，已建立了含有6669條ESTs的隨機cDNA文庫[29]。以外生菌根真菌A.muscaria在低氮源的葡萄糖培養(yǎng)基上生長的菌絲和無葡萄糖高氮源培養(yǎng)基上生長的菌絲為對照組，構(gòu)建的SSH cDNA文庫中，共獲得582條ESTs。外生菌根真菌Hebelomacylindrosporum建立了不同氮源條件下菌絲生長的隨機cDNA文庫，共獲得459條ESTs[30]。未來研究可能更多采用差異表達分析策略，鑒定菌根共生互作過程的活性基因，這些策略基于高通量EST測序、EST聚類和注釋、菌根相關基因表達的生物信息學分析及基于基因芯片技術的轉(zhuǎn)錄組分析。

3 蘭科菌根

蘭科菌根是一種內(nèi)生菌根，主要寄生于蘭科(Orchidaceae)植物的種子及根系上。目前已開展對蘭科菌根真菌的分類及真菌資源多樣性、蘭科菌根的形態(tài)和菌根對蘭科植物的效應等最新的研究[31]。研究表明，感染蘭科植物根部并能與之共生的真菌絕大多數(shù)屬于擔子菌門(Basidiomycota)和半知菌門(Deuteromycotina)，也有部分屬于子囊菌門(Ascomycota)；蘭科菌根的形成可分為兩種情況：一是對蘭科植物種子的侵染；二是對成長新根的侵染[32]。菌根真菌對蘭科植物的種子萌發(fā)和植株生長發(fā)育均有一定影響。

遺傳信息的豐富不僅有利于發(fā)現(xiàn)功能基因，也對未來基因組注釋有幫助，對觀賞性蘭花黃花杓蘭Cypripediumflavum菌根形成的差異基因表達研究中，首次獲得蘭科菌根共生相關差異表達ESTs[33]。以11種蝴蝶蘭屬蘭花的cDNA文庫中的37 979 342條序列[34]構(gòu)建了蘭科數(shù)據(jù)庫OrchidBase，其中41 310條ESTs是由Sanger法獲得的，37 908 032條ESTs由第二代測序技術獲得，包括Roche 454測序技術和Solexa Illumina測序技術所獲得的ESTs經(jīng)過聚類分析，分為8501個重疊群(contigs)和76 116單一序列(singletons)，平均片段長度為459 bp。該數(shù)據(jù)庫是基于網(wǎng)絡的蘭科EST數(shù)據(jù)庫，不僅能查詢到相關的EST數(shù)據(jù)信息，還提供了聚類信息、功能注釋、基因分析(gene ontology)和代謝途徑分析[35-36]。蘭科數(shù)據(jù)庫是第一個在線的蘭科EST序列整合信息庫，可以自由地上傳或下載相關數(shù)據(jù)信息[37]。從基因的分子水平和功能分析水平上都為蘭科植物研究提供了豐富的遺傳數(shù)據(jù)信息。

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo為蘭科(Orchidaceae)石斛屬Dendrobium名貴藥材，其種子細小如粉，自然條件下需共生真菌侵染以提供萌發(fā)所需的碳、氮源等營養(yǎng)元素。真菌侵染蘭科植物種子，形成共生關系是蘭科種子萌發(fā)的前提，但共生機理尚不清楚。在分子水平上揭示蘭科種子共生萌發(fā)成為近來科學界關注的熱點。趙明明等(2013)以鐵皮石斛種子接種蠟殼菌屬真菌Sebacinasp.共生萌發(fā)至第三階段的組織樣品成功構(gòu)建抑制性差減雜交cDNA文庫。測序分析共獲得1437個EST標簽，聚類拼接得到1074個unigenes，包括172個重疊群(contigs)和902個單一序列(singletons)。真核生物蛋白相鄰類聚簇族(KOG)數(shù)據(jù)庫近似蛋白功能分類、基因本體(GO)注釋及京都基因與基因組百科全書(KEGG)途徑分析發(fā)現(xiàn)，植物來源蛋白涉及23個功能類群，主要包含在信號轉(zhuǎn)導、抗逆境脅迫及代謝等途徑中[38]。

我國叢枝菌根、外生菌根和蘭科菌根資源均非常豐富，隨著對菌根資源的藥用價值和食用價值認識的不斷深入，越來越多的學者更加關注菌根互作分子生物學領域的研究，通過高通量測序技術、微列陣技術、差減文庫技術深層挖掘菌根互作過程中分子水平的基因表達信息，這些研究成果為今后菌根資源的合理開發(fā)、利用和保護提供了有力的理論依據(jù)。

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ProgressofMycorrhizalSymbiosisAnalysisUsingHighThroughputSequencing

LIU Siqi1，ZHAO Mingming2*

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation,Beijing100195,China;2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesPekingUnionMedicalCollage,Beijing100193,China)

Mycorrhiza is a common existence in nature, and it is a symbiosis formed by mycorrhizal fungi in soil and roots of higher plants. In view of its important role in nature, mycorrhizal research has attracted more and more attention from scholars all over the world. In this paper, we summarized recent progresses in the research of arbuscular mycorrhiza，ectotrophic mycorrhiza and orchidaceous mycorrhiza symbiosis using high throughput sequencing.

High throughput sequencing；Arbuscular mycorrhiza；Ectotrophic mycorrhiza；Orchidaceous mycorrhiza

] 趙明明，博士后，研究方向：中藥資源學，E-Mail：mmzhao@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.029

2017-05-11)

*[