莊金秋，梅建國，張 穎，劉吉山，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

綜述與專論

牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展

莊金秋，梅建國，張 穎，劉吉山，沈志強(qiáng)

（山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

牛腸道病毒（BEV）感染為國內(nèi)近年來的新發(fā)傳染病，在牛群中普遍存在，且常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。文章概述了牛腸道病毒的病原學(xué)特征及檢測技術(shù)研究進(jìn)展，以期為預(yù)防和控制該疾病提供參考。

牛腸道病毒；病原學(xué)；檢測；進(jìn)展

牛腸道病毒感染是由小RNA病毒科腸道病毒屬的牛腸道病毒（bovine enterovirus，BEV）引起的一種臨床上以發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹瀉和繁殖障礙為主要特征的傳染病。本病在我國為新發(fā)傳染病，在牛群中非常普遍，且常與其他病原體發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，導(dǎo)致牛群出現(xiàn)較高的死亡率，給養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，采取有效措施預(yù)防和控制BEV感染對于確保養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展非常重要。本文對牛腸道病毒的病原學(xué)特征及其檢測技術(shù)進(jìn)行了概述，以期為預(yù)防和控制此病提供參考。

1 牛腸道病毒的由來和發(fā)現(xiàn)

Moll等［1］于 1959 年首次報(bào)道了牛腸道病毒（BEV），之后許多國家也陸續(xù)報(bào)道了本病的暴發(fā)與流行情況。2011年李英利等［2］從內(nèi)蒙古發(fā)生腹瀉的犢牛體內(nèi)分離出1株腸道病毒，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該毒株為F種腸道病毒，進(jìn)而首次確定了我國存在F型牛腸道病毒感染。彭曉薇等［3］從北京發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得了F型腸道病毒。侯佩莉等［4］經(jīng)過一系列病毒鑒定方法最終從泌乳奶牛的糞便中也分離出一株F型牛腸道病毒。邢澤黎等［5］從發(fā)病嚴(yán)重致死的肉牛體內(nèi)分離得到E型腸道病毒。張海麗等［6］從山西發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的泌乳奶牛中也分離獲得E型腸道病毒。BEV多從發(fā)生嚴(yán)重呼吸道癥狀、消化道癥狀和繁殖系統(tǒng)障礙的病牛體內(nèi)分離獲得。該病在世界各國牛群中較為常見，感染率達(dá)17.6%～80.0%。感染此病毒可引起牛下痢和呼吸道癥狀，食欲下降，嚴(yán)重的還有便血，產(chǎn)奶量大幅下降，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來本病的發(fā)生與流行有逐漸升高的趨勢。

2 病毒的形態(tài)及分類地位

牛腸道病毒的病毒粒子外觀呈球形、正二十面體、無包膜、大小在25～30 nm之間，其基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA，全長7.5 kb。根據(jù)最新病毒分類，牛腸道病毒與人脊髓灰質(zhì)炎病毒、人柯薩奇病毒和豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員。該屬病毒包括 A、B、C、D、E、F、G、H、J九個腸道病毒種及 A、B、C三個鼻病毒種，其中腸道病毒E和F種屬于牛腸道病毒。E 種包括 E1～E4，F(xiàn) 種包括 F1～F6。

3 病毒的流行病學(xué)特點(diǎn)

牛腸道病毒感染符合腸道病毒屬病毒感染的普遍規(guī)律：一種綜合征可由不同腸道病毒所引起，同一種（型）腸道病毒可以導(dǎo)致不同綜合征；感染腸道病毒后多數(shù)為亞臨床表現(xiàn)（有超過90%的感染牛無癥狀），不易被發(fā)現(xiàn)；普遍分布于世界各地，感染廣泛存在，并且常引起暴發(fā)；在環(huán)境中非常穩(wěn)定，能在環(huán)境中存活很長時間。牛腸道病毒的病原性并不明顯，但由于其有時會侵犯其他器官而導(dǎo)致臨床上各種綜合征的出現(xiàn)。牛腸道病毒的感染宿主較廣，包括牛、羊、馬、犬、羊駝等動物。

4 病毒檢測技術(shù)研究進(jìn)展

4.1 病毒的分離培養(yǎng)

病毒分離與鑒定是檢測BEV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)室常采用MDBK細(xì)胞進(jìn)行病毒分離試驗(yàn)。采集的樣品處理后，接種MDBK細(xì)胞培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），并對其核酸進(jìn)行測序比對，確定是否存在BEV感染。病毒分離與鑒定是BEV最可靠的檢測方法，但其費(fèi)時長，操作繁瑣，技術(shù)人員也需要經(jīng)過長時間的培訓(xùn)。

4.2 血清學(xué)檢測技術(shù)

1989年Zhang等［7］建立了捕獲ELISA法來檢測血清中的BEV抗體。此法具有敏感性強(qiáng)、特異性高的特點(diǎn)，更重要的是比血清中和試驗(yàn)（SN）更經(jīng)濟(jì)。1990年Zhang等［8］又建立了阻斷ELISA法檢測牛血清中的BEV抗體，該方法與傳統(tǒng)SN法相比敏感性高，而且耗時短，可替代傳統(tǒng)SN法用于大規(guī)模牧場的抗體檢測。郭金玉等［9］利用北京某牛場BEV-2型分離毒株的VP1蛋白構(gòu)建了檢測BEV抗體的間接ELISA方法，此法操作比較簡單、快速、使用價(jià)值比較高。朱彤等［10］通過擴(kuò)增BEV的VP2基因并進(jìn)行一系列的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)表達(dá)、純化出重組蛋白，制備了較高效價(jià)的多克隆抗體，為BEV的血清學(xué)診斷方法的建立及亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。周萍萍［11］將純化好的3D蛋白作為包被抗原，建立了BEV-3D-ELISA方法，應(yīng)用該方法對哈爾濱市送檢的425份奶牛血清進(jìn)行了檢測，陽性率高達(dá)41.41%。蓋小春［12］應(yīng)用表達(dá)純化的E種腸道病毒HY12 VP2重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測E種腸道病毒抗體的間接ELISA方法，并對實(shí)驗(yàn)感染小鼠抗體消長規(guī)律進(jìn)行了研究，為本病的免疫機(jī)理和疫苗研制打下基礎(chǔ)。邢澤黎等［13］應(yīng)用大腸桿菌表達(dá)純化的E種腸道病毒HY12的VP1和VP2重組蛋白制備了抗體，并建立了檢測BEV病原的雙抗體夾心ELISA方法，對吉林省不同地區(qū)的牛群感染BEV進(jìn)行了病原流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)調(diào)查地區(qū)牛群的BEV感染率為8.16%～58.70%。雙抗體夾心ELISA法檢測糞便中的BEV抗原的方法，可以快速、有效地確定牛群是否存在BEV感染，將為新發(fā)生BEV感染牛的防控和牛群的凈化提供了有效的技術(shù)手段。

4.3 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

4.3.1 RT-PCR 技術(shù) Jimenez-Clavero等［14］針對 BEV 5′UTR基因建立了RT-PCR方法，并對西班牙多個地區(qū)的牛、綿羊、山羊、驢、馬以及地表水樣進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，除了在驢的檢測樣本中未檢測到外，其余均有陽性樣本存在。Nathamon 等［15］也根據(jù) 5′UTR 基因設(shè)計(jì)引物建立了RT-PCR方法，并對泰國部分地區(qū)的本地牛、印度牛及山羊攜帶BEV的感染率進(jìn)行了調(diào)查和分析，結(jié)果表明，以上幾種動物均有BEV的攜帶，其中本地牛攜帶率最高，為76%。吳丹等［16］根據(jù)口蹄疫病毒（FMDV）和BEV基因的5′UTR保守基因區(qū)域分別設(shè)計(jì)引物，首次建立了同時檢測FMDV和BEV的雙重RT-PCR快速檢測方法，對FMDV的最低檢出限為8 TCID50/0.1mL，對BEV的最低檢出限為2 TCID50/0.1mL。采用該方法檢測了852份臨床樣品，并與病毒分離方法比較，結(jié)果兩種方法檢測結(jié)果完全一致。侯佩莉等［17］針對BEV非結(jié)構(gòu)蛋白3D基因設(shè)計(jì)引物建立了RT-PCR方法，敏感度高達(dá)10-1TCID50。侯佩莉等［18］根椐牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛冠狀病毒（BCoV）和BEV基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成引物，在建立單一病毒RT-PCR檢測方法的基礎(chǔ)上，優(yōu)化條件，建立了上述3種病毒的多重RT-PCR方法，對24份臨床腹瀉病料進(jìn)行了檢測，與單項(xiàng)RTPCR的符合率100%。該多重RT-PCR鑒別診斷方法對牛腹瀉性疾病病因的確診、流行病學(xué)調(diào)查和防控具有重要意義。

4.3.2 實(shí)時熒光定量 RT-PCR技術(shù) 吳丹等［19］根據(jù)5′UTR基因設(shè)計(jì)引物建立了檢測BEV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，對BEV的最小檢測量為0.1 TCID50/0.1 mL。對北京周邊地區(qū)牛群采集的852份臨床樣本進(jìn)行了檢測，且與分離病毒法進(jìn)行了敏感性比較，結(jié)果表明，該方法檢出陽性樣本與病毒分離法檢出的一致，但敏感性比病毒分離法高10倍。朱彤等［20］根據(jù)BEV 3D基因設(shè)計(jì)引物建立了檢測BEV的SYBR Green I熒光定量RTPCR 方法，敏感度達(dá) 7.13×101拷貝/μL，是常規(guī) RT-PCR的10倍。應(yīng)用該方法檢測了3個規(guī)?；膛鏊蜋z的41份奶牛腹瀉樣本和3份氣溶膠樣本，腹瀉樣品陽性檢出率39.02%（16/41）；3份氣溶膠樣本均為陽性。說明SYBR Green I實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測方法具有特異、穩(wěn)定、高效的優(yōu)點(diǎn)，既可以用于臨床檢測，又可對環(huán)境中的BEV進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，為BEV流行病學(xué)調(diào)查、診斷提供了有力的技術(shù)支持。

5 小結(jié)

BEV感染在世界范圍內(nèi)流行，由于其所引起的臨床癥狀與其他病原體（如BVDV、BCoV等）所引起的疾病癥狀非常相似，僅從臨床上進(jìn)行診斷很容易造成誤診，致使病情加重，甚至威脅到生命安全。能夠及早確診所感染的病毒及類型，對于及時撲滅疫情，控制疫病的傳播具有重要作用。目前，我國對牛腸道疾病的診斷和防治還很薄弱，完善該病的診斷技術(shù)及研發(fā)亞單位疫苗對我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)具有重大意義。

［1］Moll T，Davis A D.Isolation and characterization of cytopathogenic enteroviruses from cattle with respiratory disease［J］.Am J Vet Res，1959，20：27-32.

［2］李英利，常繼濤，于力.牛腸道病毒的分離鑒定［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2011，33（5）：388-390.

［3］彭小薇，董浩，吳丹，等.牛腸道病毒2型的分離與鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013（5）：823-828.

［4］侯佩莉，王洪梅，楊盛華，等.牛腸道病毒山東分離株的分離鑒定及序列分析［C］//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集.2013：1027-1030.

［5］邢澤黎，朱利塞，王新平，等.從吉林省肉牛場新發(fā)疫病分離出E種腸道病毒［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（3）：390-394.

［6］張海麗，周萍萍，高明春，等.一株牛腸道病毒的分離與鑒定［J］.中國奶牛，2015（5）：31-34.

［7］Zhang A Q，Smith J R，Burgess G W.A capture antibody ELISA for detection of antibodies against bovine enterovirus［J］.J Virol Methods，1989，12（1/2）：223-226.

［8］Zhang A Q，Smith J R，Burgess G W.Blocking enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against bovine enterovirus［J］.Vet Microbiol，1990，21（3）：275-281.

［9］郭金玉，高志強(qiáng)，張鶴曉，等.牛腸道病毒2型VP1+表達(dá)和間接ELISA 方法的建立與應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)雜志，2014，50（11）：40-43.

［10］朱彤，侯佩莉，劉曉，等.牛腸道病毒VP2基因的原核表達(dá)及其多克隆抗體的制備［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，35（7）：1037-1041.

［11］周萍萍.BEV-3D-ELISA的建立及其在牛腸道病毒陽性個體篩選中的應(yīng)用［D］.哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

［12］蓋小春.E種腸道病毒HY12小鼠感染模型及感染小鼠抗體消長規(guī)律［D］.長春：吉林大學(xué)，2016.

［13］邢澤黎，王新平，朱利塞，等.雙抗體夾心ELISA檢測牛腸道病毒抗原方法的建立及流行病學(xué)調(diào)查［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（4）：567-571.

［14］Jimenez-Clavero M A，Escribano-Romero E，Mansilla C，et al.Survey of bovine enterovirus in biological and transcription-PCR［J］.Appl Environ Microbiol，2005，72（7）：3536-3543.

［15］Natham Kosoltanapiwat，Marnoch Yindee，Irwin Fernandez Chavez，et al．Genetic variations in regions of bovine and bovine-like enteroviral 5'UTR from cattle，Indian bison and goat feces［J］.Virology Journal，2016，13：13.

［16］吳丹，吳濤，張鶴曉，等.同時檢測口蹄疫病毒和牛腸道病毒雙重 RT-PCR 方法的建立［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（12）：976-979.

［17］侯佩莉，程洪兵，劉曉，等.牛腸道病毒RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014（2）：13-16.

［18］侯佩莉，王洪梅，何洪彬.牛病毒性腹瀉病毒、牛冠狀病毒和牛腸道病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36（10）：1672-1675.

［19］吳丹，吳濤，張鶴曉，等.牛腸道病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立 ［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào) ，2012，34（11）：903-906.

［20］朱彤，趙貴民，沈付嬈，等.牛腸道病毒SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用［J］.病毒學(xué)報(bào)，2015，31（5）：487-493.

《中國草食動物科學(xué)》對優(yōu)秀稿件實(shí)行數(shù)字優(yōu)先出版通告

《中國草食動物科學(xué)》是由農(nóng)業(yè)部主管、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所主辦的國家級畜牧類學(xué)術(shù)期刊，其前身為《中國養(yǎng)羊》、《草與畜雜志》和《中國草食動物》。本刊2011年被《美國化學(xué)文摘》(CA)收錄，曾榮獲中國科技論文在線優(yōu)秀期刊二等獎、第三屆和第四屆全國優(yōu)秀農(nóng)業(yè)學(xué)術(shù)期刊二等獎、第四屆全國畜牧獸醫(yī)優(yōu)秀期刊二等獎，先后被評為全國中文核心期刊、中國農(nóng)業(yè)核心期刊、中國科技核心期刊和RCCSE中國核心學(xué)術(shù)期刊?！吨袊菔硠游锟茖W(xué)》為中國科學(xué)引文數(shù)據(jù)庫（CSCD）、中國科技論文與引文數(shù)據(jù)庫、中國學(xué)術(shù)期刊綜合評價(jià)數(shù)據(jù)庫（CAJCED）和中國生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫等的統(tǒng)計(jì)源期刊；是《中國核心期刊（遴選）數(shù)據(jù)庫》、《萬方數(shù)據(jù)－數(shù)字化期刊群》、《中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CJFD)》、《中國生物學(xué)文摘》、《中國生物學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫》、臺灣《CEPS中文電子期刊》、中國科技論文在線來源期刊和收錄期刊。優(yōu)先出版稿件的條件：①國家“973”、“863”項(xiàng)目資助論文；②國家級及省級科學(xué)基金項(xiàng)目資助論文；③海外聯(lián)合基金資助論文；④有重大臨床意義的病例報(bào)告；⑤創(chuàng)新研究結(jié)果的首報(bào)。

在作者簽署“中國知網(wǎng)優(yōu)先出版授權(quán)書”后，本刊將于2個月內(nèi)完成優(yōu)質(zhì)稿件的審稿、編輯加工、排版、數(shù)字優(yōu)先出版（單篇），特別優(yōu)秀的稿件將于1個月內(nèi)實(shí)現(xiàn)數(shù)字優(yōu)先出版。數(shù)字優(yōu)先出版后，可在中國知網(wǎng)全文數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索和下載，并在本刊紙質(zhì)期刊上以相同版式刊登。

Progress in the Pathogenic Characteristics of the Bovine Enterovirus and Its Detection Techniques

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，et al
（Binzhou Academy of Animal Scienceamp;Veterinary Medicine，Binzhou 256600，Shandong，China）

Bovine enterovirus（BEV）infection is a new infectious disease.It has been prevalent in the herd in China in recent years，and often has mixed with other pathogens infection and secondary infection.It often results in high mortality of cattle，causes huge economic losses to the cattle industry.In this paper，the research progress in the pathogenic characteristics and detection techniques of bovine enterovirus was summarized in order to provide reference for its prevention and control.

bovine enterovirus；etiology；detection；progress

S852.653

A

2095-3887（2017）06-0049-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2017.06.014

2017-06-30

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2015GSF121027）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系牛產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SDAIT-09-12）

莊金秋（1978-），女，副研究員，碩士，主要從事細(xì)胞培養(yǎng)和動物用病毒疫苗研制工作。