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剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)簡(jiǎn)稱弓形蟲，是一種人獸共患的細(xì)胞內(nèi)專性寄生物，宿主廣泛，幾乎可以感染所有溫血?jiǎng)游颷1]，宿主常常通過飲用受弓形蟲卵囊污染的水、攝入未煮熟的肉或者食物感染[2]，也可通過胎盤傳染給胎兒。免疫功能低下以及先天免疫缺陷的人群感染后可造成嚴(yán)重后果，甚至死亡。近年來，我國(guó)畜牧業(yè)迅速發(fā)展，養(yǎng)寵物的人也越來越多，弓形蟲病發(fā)病率逐年增高，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)以及人身健康。弓形蟲病至今尚無理想的治療藥物，因此研制安全、有效的弓形蟲疫苗尤為重要。

1956年Cuchins等人利用蟲體粗抗原提取物研制出了最早的弓形蟲疫苗[3]，屬于滅活疫苗。伴隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，科研工作者們研制出了更多類型的弓形蟲疫苗，主要包括全蟲疫苗、基因缺失疫苗、基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗，現(xiàn)階段研究較多的是后3種。

1 弓形蟲全蟲疫苗

1.1滅活疫苗 滅活疫苗是將蟲體的多種組分抗原提取物經(jīng)理化方法滅活，再添加適當(dāng)?shù)拿庖咦魟┲瞥梢呙?。滅活疫苗安全性很高，但不能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的抗弓形蟲保護(hù)免疫，免疫效果并不理想，只有部分疫苗能在一定程度上能降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡率。2004年Saavedra等人提取Wiktor蟲株的速殖子可溶抗原[4]，添加佐制成疫苗，免疫BALB/c小鼠后接種RH蟲株的速殖子，發(fā)現(xiàn)該疫苗雖然能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生Th1型免疫應(yīng)答，但I(xiàn)FN-γ水平很低，由該疫苗誘導(dǎo)的特異性保護(hù)作用是暫時(shí)的，無法抵抗RH蟲株的感染。

1.2弱毒活疫苗 弱毒活疫苗是將病原經(jīng)過人工處理，如紫外線、放射線以及化學(xué)試劑等處理，最大程度削弱其致病性，但仍具有一定的毒力和免疫原性。利用弓形蟲速殖子制成的弱毒活疫苗可以誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生與天然主動(dòng)免疫相似的免疫應(yīng)答，其免疫效果強(qiáng)于滅活苗[5]。唯一針對(duì)弓形蟲的弱毒活疫苗Toxovax是利用傳代致弱的S48蟲株制成的[6]。S48蟲株最初是由Buxton等人于1956年在新西蘭從流產(chǎn)的羊體內(nèi)分離出來[7]，其速殖子在小鼠體內(nèi)經(jīng)過3 000次以上傳代后，喪失了形成組織包囊或卵囊的能力。Montoya等人研究發(fā)現(xiàn)Toxovax疫苗誘導(dǎo)的免疫主要涉及CD4+和CD8+T細(xì)胞以及IFN-γ[8]，但該疫苗僅用于羊。2014年Katzer等人利用S48蟲株速殖子制成弱毒苗[9]，用該疫苗免疫羊后能明顯減少體內(nèi)寄生蟲數(shù)量，降低肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變程度，但未完全阻止組織包囊的形成。2015年Burrells等人用免疫了S48蟲株弱毒苗后再接種M4蟲株卵囊和未免疫而直接接種卵囊的兩組豬的組織提取物接種小鼠[10]，結(jié)果顯示，接受前一組豬組織提取物的小鼠存活率為100%，而接受后一組豬組織提取物的小鼠存活率為51.1%。但結(jié)果只表明接種該種疫苗會(huì)減少豬體內(nèi)弓形蟲包囊數(shù)量，卻并未完全阻止包囊的形成。此外，致弱蟲株毒力恢復(fù)野生型也是不可忽視的一個(gè)問題，尤其針對(duì)免疫功能低下的動(dòng)物或人群，這將可能出現(xiàn)弓形蟲再次感染發(fā)病和傳播疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

2 基因缺失疫苗

基因缺失疫苗是利用基因工程技術(shù)將強(qiáng)毒株的毒力相關(guān)基因敲除后構(gòu)建的活疫苗。氨基甲酰磷酸合成酶II(CPSII)基因是參與嘧啶合成的第一個(gè)酶，若破壞這種酶可造成蟲體尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型，無法完成復(fù)制和生長(zhǎng)。2002年Fox等敲除RH蟲株CPSII基因獲得了尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株[11]，并將其接種于BALB/c小鼠，結(jié)果顯示尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型蟲株不僅對(duì)免疫功能正常的小鼠無致病力，對(duì)缺乏IFN-γ的小鼠也無致病力，由此推測(cè)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型蟲株可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生對(duì)弓形蟲病的長(zhǎng)期免疫。

雖然利用尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型蟲體制成疫苗對(duì)預(yù)防弓形蟲急性感染很有效，且具有終生性，但能否預(yù)防弓形蟲慢性感染還是未知的。為了解決這個(gè)問題，2015年Fox等人首次通過敲除基因Ⅱ型Δku80蟲株的乳清苷5′-單磷酸脫羧酶(OMPDC)和尿苷磷酸化酶(UP)基因，構(gòu)建了非復(fù)制型尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型活疫苗[12]，該疫苗具有不返祖特點(diǎn)，能刺激小鼠產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，預(yù)防弓形蟲急性和慢性感染。OMPDC是參與弓形蟲在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和形成包囊的重要毒力基因，它的缺失可引起嚴(yán)重的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷，使速殖子喪失復(fù)制功能，失去形成包囊和發(fā)展慢性感染的能力。此外，該疫苗不返祖，能克服致弱蟲株恢復(fù)野生型的風(fēng)險(xiǎn)，可作為進(jìn)一步開發(fā)弓形蟲疫苗的新工具。

乳酸脫氫酶(LDH) 能催化丙酮酸和乳酸在厭氧生長(zhǎng)條件下的相互轉(zhuǎn)化，用于能量供應(yīng)，在弓形蟲不同時(shí)期會(huì)表達(dá)不同的亞型，速殖子僅表達(dá)LDH1，緩殖子主要表達(dá)LDH2。2017年Abdelbaset等人研發(fā)了LDH1基因缺失苗、LDH2基因缺失苗以及兩基因均缺失的活疫苗[13]。結(jié)果表明，LDH1基因缺失苗能降低弓形蟲急性感染的毒力，影響緩殖子的分化，顯著減少緩殖子階段包囊在體內(nèi)的形成。LDH2基因缺失苗也會(huì)減少緩殖子階段包囊的形成，但不會(huì)影響蟲株毒力和緩殖子的分化。LDH1和LDH2基因均缺失的疫苗則更明顯的減少了緩殖子階段包囊的形成。使用低劑量的LDH基因缺失苗免疫小鼠即可對(duì)致死劑量的弓形蟲感染起到有效的保護(hù)作用。由此揭示了LDH基因與弓形蟲毒力有關(guān)，LDH基因缺失苗能夠有效減慢緩殖子的分化復(fù)制，預(yù)防慢性感染，可用于理想弓形蟲疫苗的研發(fā)，但LDH1和LDH2在寄生蟲無性生殖期的確切作用尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

3 基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗

頂端復(fù)合體細(xì)胞器分泌抗原如棒狀體蛋白(ROP)、微線體蛋白(MIC)和致密顆粒蛋白(GRA)等，在蟲體入侵宿主細(xì)胞、運(yùn)動(dòng)以及增殖過程中具有非常重要的作用。近年來許多學(xué)者針對(duì)弓形蟲SAG、ROP、MIC、GRA、TgSPATR和TgEF-1α等抗原基因進(jìn)行了深入的研究，將其作為疫苗候選分子，研制出了多種基因工程亞單位疫苗和核酸疫苗。單基因疫苗免疫效果不理想，通過把生活史不同階段的多個(gè)特異組分抗原聯(lián)合，制成復(fù)合基因疫苗，可以彌補(bǔ)不足，是現(xiàn)今研究的一個(gè)發(fā)展方向。

3.1基因工程亞單位疫苗 目前棒狀蛋白研究較多的是 ROP1和ROP2家族，其中ROP2家族包括ROP2、ROP3、ROP4、ROP5、ROP、ROP8、ROP16、ROP18等蛋白。ROP5能使由GTP酶誘導(dǎo)的IFN-γ失活，幫助弓形蟲逃避宿主的免疫攻擊。ROP18是強(qiáng)毒I型弓形蟲基因組中最重要的毒力分型基因，ROP18蛋白具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性[14]，在感染的不同階段分別靶向宿主免疫相關(guān)因子IRGs和ATF6，分別抑制宿主的固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，使弓形蟲具備急性強(qiáng)毒力。迄今為止，關(guān)于ROP5和ROP18的免疫原性及其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答機(jī)制的研究相對(duì)較少。2015年Grzybowski等人構(gòu)建了ROP5和ROP18復(fù)合的亞單位疫苗[15]，通過動(dòng)物保護(hù)性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該疫苗引起的體液免疫比較溫和，不會(huì)劇烈產(chǎn)生IgG抗體。將Chinese1型弓形蟲ROP16Ⅰ/Ⅲ克隆，在插入真核表達(dá)載體PEGFP1中在進(jìn)行轉(zhuǎn)染體外觀察發(fā)現(xiàn)，其分泌位置和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生IgG來抵抗弓形蟲感染[16]。此外，2016年Ching等人建立了GRA2和GRA5復(fù)合基因亞單位疫苗[17]，能引起體液免疫和以Th1型為主的細(xì)胞免疫，IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10細(xì)胞因子以及IgG抗體水平顯著升高，可對(duì)弓形蟲急性感染產(chǎn)生部分保護(hù)作用。

弓形蟲延伸因子(TgEF-1α)在真核細(xì)胞中高度保守且普遍表達(dá)，2017年Wang等人構(gòu)建了TgEF-1α基因工程亞單位疫苗[18]，能抵抗致死量速殖子對(duì)小鼠的攻擊，抑制速殖子入侵巨噬細(xì)胞，IFN-γ和IL-4細(xì)胞因子水平升高，MHC-I和MHC-II分子表達(dá)增多，CD4+和CD8+T細(xì)胞百分比顯著增加，小鼠存活時(shí)間延長(zhǎng)。

3.2 核酸疫苗

3.2.1DNA疫苗 弓形蟲表面抗原(SAG)能參與宿主細(xì)胞的粘附，刺激宿主產(chǎn)生免疫應(yīng)答[19]，具有較高的免疫原性和免疫保護(hù)性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG、IgM、IgA抗體以及細(xì)胞因子IFN-γ等殺死蟲體。2013年Zhang等人構(gòu)建了表達(dá)SAG2C，SAG2D，SAG2X以及3種基因復(fù)合的DNA疫苗[20]，免疫BALB/c小鼠后均可引起IgG抗體水平顯著升高，淋巴細(xì)胞大量增殖，產(chǎn)生劇烈的Th1型免疫應(yīng)答，IL-2和IFN-γ等細(xì)胞因子水平也有所增高，能有效對(duì)抗基因II型蟲株卵囊的感染，腦組織包囊減少率分別達(dá)到72%，23%，69%和77%，特別是3種基因復(fù)合的DNA疫苗能有效保護(hù)小鼠抵抗弓形蟲慢性感染。

弓形蟲在入侵的早期階段能分泌一種含有血小板反應(yīng)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域的蛋白(TgSPATR)，并以Ca2+依賴性微線體蛋白形式釋放，在弓形蟲粘附和侵襲中發(fā)揮重要作用[21]。瘧原蟲也可分泌此類蛋白(PfSPATR)。臨床志愿者實(shí)驗(yàn)顯示，臨床免疫成年人的血清可以識(shí)別PfSPATR，而含抗瘧原蟲子孢子抗體水平很低的志愿者血清和對(duì)照組的血清不能識(shí)別PfSPATR，表明宿主免疫系統(tǒng)可以識(shí)別PfSPATR。此外，PfSPATR抗體已被證實(shí)能夠抑制瘧原蟲子孢子侵襲人的肝細(xì)胞。TgSPATR與PfSPATR是同源物，因此，它可能具有與PfSPATR類似的功能。2017年Zheng等人首次制備了pVAX1-TgSPATR DNA疫苗[22]，免疫小鼠后獲得了較好的保護(hù)效果，IFN-γ、IL-2、IL-4以及IL-10細(xì)胞因子和IgG抗體水平顯著升高，能夠誘導(dǎo)Th1/ Th2型細(xì)胞免疫以及體液免疫，與未接種疫苗的小鼠相比，在接種RH蟲株速殖子后存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)，但不能抵抗高劑量RH強(qiáng)毒株的感染。此外，2014年Hassan等人用編碼弓形蟲脫氧核糖磷酸醛縮酶(TgDPA)的DNA疫苗免疫小鼠，產(chǎn)生了很強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，存活率升高[23]。

3.2.2RNA疫苗 利用mRNA作為疫苗的想法已流行了30年左右，它可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生由它們編碼的許多蛋白，觸發(fā)強(qiáng)大的免疫反應(yīng)。2006年Dimier-Poisson等人從弓形蟲速殖子中提取了編碼SAG1的mRNA[24]，研發(fā)出了通過鼻內(nèi)免疫的RNA疫苗，免疫C57BL/6小鼠后可得到較好的保護(hù)效果，能有效對(duì)抗致死量76K弓形蟲包囊的攻擊，存活率提高了50%，并能減少亞致死量76K弓形蟲包囊攻擊時(shí)腦組織包囊的形成。2016年Chahal等人首次開發(fā)出一種完全保護(hù)性的單劑量RNA納米顆粒疫苗[25]，該疫苗含有編碼弓形蟲GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1蛋白的mRNA，并由樹狀大分子納米顆粒包被，可在幾天內(nèi)生產(chǎn)出來，快速應(yīng)對(duì)疾病的暴發(fā)，用該疫苗免疫小鼠后可引起CD8+T細(xì)胞數(shù)量增多，誘導(dǎo)體液免疫，在接種致死量基因II型PRU蟲株后6個(gè)月依然沒有臨床癥狀，且能同時(shí)預(yù)防埃博拉病毒和H1N1流感病毒，是首個(gè)能對(duì)廣譜致死性病原體起保護(hù)作用的疫苗，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其保護(hù)作用的長(zhǎng)期性與穩(wěn)定性，以及是否可以應(yīng)用于人類和其他動(dòng)物。

綜合結(jié)果分析，各種抗原基因的DNA疫苗和基因工程亞單位疫苗在一定程度上降低了實(shí)驗(yàn)小鼠的死亡率，顯示出引起Th1型細(xì)胞免疫的優(yōu)勢(shì)，可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ起主導(dǎo)作用來抗擊弓形蟲的感染，但其免疫保護(hù)效果仍不夠理想，不能完全預(yù)防組織包囊形成，盡管對(duì)弓形蟲感染具有良好的保護(hù)作用，但不能完全保護(hù)小鼠免于死亡，還需要進(jìn)一步改善。RNA疫苗不能整合到宿主基因組中，比DNA疫苗更安全，不會(huì)導(dǎo)致突變產(chǎn)生，但目前研究并不是很多，研究出能將其安全、有效的遞送至體內(nèi)的方法是RNA疫苗成功的關(guān)鍵之一。

4 人用弓形蟲疫苗的初步探索

許多用小鼠作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疫苗研究有助于我們了解控制弓形蟲感染的免疫機(jī)制。然而，弓形蟲易感性因蟲株種類、MHC多樣性和感染途徑的不同而不同[26]，且考慮到小鼠和人之間的免疫反應(yīng)差異，小鼠模型不足以識(shí)別保護(hù)性抗原[27]。針對(duì)小鼠模型的保護(hù)性評(píng)估很難用于分析推斷人體的免疫應(yīng)答。開發(fā)能表達(dá)人MHC I分子的轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究人用弓形蟲疫苗的有效替代方法。首先合理選擇免疫原性多肽，然后在表達(dá)人MHC I分子的小鼠中進(jìn)行測(cè)試。已有學(xué)者使用生物信息學(xué)方法鑒定了幾種HLA-A03超型限制性弓形蟲衍生肽，然后通過免疫HLA-A*1101轉(zhuǎn)基因小鼠評(píng)價(jià)其保護(hù)功效。結(jié)果表明，這些肽可以引起人CD8+T細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，可用于預(yù)防HLA-A03超型弓形蟲病。也有學(xué)者證明了HLA-A * 0201和HLA-B * 0702限制的衍生肽的免疫原性。

5 展 望

盡管弓形蟲疫苗研究已取得了較大進(jìn)展，但這些疫苗或多或少都存在一些缺陷，無法完全預(yù)防和控制弓形蟲病的感染和傳播。理想的弓形蟲疫苗應(yīng)包含弓形蟲整個(gè)生活史的重要抗原組分，目前多數(shù)疫苗研究主要針對(duì)速殖子階段，可以加深對(duì)緩殖子的研究，例如阻止緩殖子在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為速殖子。此外，目前商品化弓形蟲疫苗主要針對(duì)綿羊和山羊，針對(duì)豬、貓和人類的弓形蟲疫苗依然很缺乏。預(yù)防食品加工用動(dòng)物組織包囊的形成也是預(yù)防弓形蟲病的重要環(huán)節(jié)之一?？蓪?duì)弓形蟲生活史、各階段的保護(hù)性抗原結(jié)構(gòu)及其編碼基因、與宿主之間的關(guān)系進(jìn)行深入的研究，探索新的保護(hù)性抗原，尋找能被免疫反應(yīng)有效阻斷的重要抗原，開發(fā)新型分子佐劑、免疫增強(qiáng)劑以及高效載體等，研制出安全、有效的弓形蟲病疫苗。有效的弓形蟲疫苗的研發(fā)，將從根本上切斷蟲體侵入細(xì)胞的途徑，從源頭上阻斷其感染與傳播，從而將弓形蟲防控提升到更高的水平。為防控畜禽弓形蟲感染、提高養(yǎng)殖業(yè)效益、保障畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全提供可靠的技術(shù)支撐。

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