許 棟，何 俊，賀長青，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

高通量測序技術(shù)在豬miRNA功能研究中的研究進展

許 棟，何 俊，賀長青，馬海明

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

miRNA的研究是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，該文對miRNA的形成及作用機制進行了論述。當(dāng)前研究miRNA最主要的手段是高通量測序技術(shù)，文章對該技術(shù)的起源、發(fā)展、原理、分類及近幾年在豬miRNA功能研究中的應(yīng)用進行了綜述。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)促進了基因組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，目前已成為豬轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段，為豬的基因組學(xué)研究提供了一個高效的平臺，為當(dāng)前豬品種遺傳改良、輔助育種選擇工作提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

豬；高通量測序技術(shù)；miRNA

隨著人類基因組計劃（human genome projiect，HGP）的提出，數(shù)量龐大的基因組計劃需要更強大的技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)分析軟件，高通量DNA序列分析技術(shù)（High-throughput DNA sequence analysis technology）的突破，使得人類基因組計劃得以完成。該技術(shù)是基于Sanger的雙脫氧鏈終止法發(fā)展起來的，利用了DNA聚合酶的雙脫氧鏈終止原理來測定核苷酸序列。自從1993年在秀麗新小桿先蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個miRNA lin-4，基因的表達調(diào)控出現(xiàn)了一個新的研究領(lǐng)域—microRNA調(diào)控。miRNA通過與靶基因的3’端堿基互補配對，從而調(diào)控靶基因的表達。在過去的十幾年間，整個生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點大多集中在對miRNA的研究上，一些新的研究技術(shù)應(yīng)運而生。

1 高通量測序技術(shù)

高通量DNA序列分析技術(shù)成為了挖掘miRNA的主要手段，但由于其成本高、耗時長、檢出效率低，市場上出現(xiàn)了一些改良后的新高通量測序平臺，如羅氏公司發(fā)開的454技術(shù)，Illumina公司的Solexa Genome Analyzer技術(shù)、ABI公司的SOLID System技術(shù)等等，都是目前市場上運用最廣泛的miRNA研究手段。這些測序技術(shù)被稱作下一代測序技術(shù)（Nextgeneration sequencing，NGS），又名深度測序技術(shù)（Deep Sequencing），屬于第二代測序技術(shù)。

羅氏公司于2005年推出的454測序技術(shù)開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河，該技術(shù)是基于焦磷酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)。454測序技術(shù)的原理是依靠一系列酶的協(xié)同作用，在每一輪測序反應(yīng)中只加一種dNTP，與模板配對就能釋放一次熒光信號，通過檢測熒光信號獲得DNA序列，其優(yōu)點是讀取序列長度可達600～1 000 bp，但是通量很低。此后，Illumina公司推出了Solexa Genome Analyzer技術(shù)，其主要原理是邊合成邊測序，在生成新的DNA互補鏈時，加入的dNTP通過酶促級聯(lián)反應(yīng)催化底物釋放出熒光信號，或者通過直接加入有熒光標記的dNTP或半簡并引物，在合成互補鏈時發(fā)出熒光信息，利用采集到的熒光信號來獲得序列信息，其優(yōu)點是測序通量大，結(jié)果較準確，但讀取序列長度通常只有100～200 bp。ABI公司研發(fā)的SOLID System技術(shù)，與焦磷酸測序的原理類似，主要采用雙堿基編碼的原理，通過寡核苷酸連接和熒光信號的檢測進行測序，其結(jié)果的準確率大大提高，但其讀取序列長度最短，僅50 bp左右。

第二代測序技術(shù)的出現(xiàn)大大減少了實驗成本和縮短了實驗時間，通過實驗獲得的產(chǎn)物無需進行電泳，直接通過收集的熒光信號值就能獲取序列信息，單次反應(yīng)中可以對大量的樣品進行同時分析，這是傳統(tǒng)的測序儀所不能達到的，此外，也不用像基因芯片技術(shù)那樣需要設(shè)計探針，能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測和量化轉(zhuǎn)錄片段，并可用于研究基因組圖譜尚未完成的物種。第二代測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用到多個生命科學(xué)領(lǐng)域，如基因組重測序，基因組結(jié)構(gòu)變異、全基因組分型、miRNAs的挖掘等。轉(zhuǎn)錄組測序RNA-seq（RNA sequencing）就是基于深度測序技術(shù)的新一代高通量測序技術(shù)的代表，已廣泛用于挖掘新miRNAs的研究中，不僅可以對miRNAs的遺傳變異進行檢測，同時也能檢測到miRNAs的表達豐度。

2 miRNA的形成及其作用機制

過去20年間最令人驚喜的生物發(fā)現(xiàn)之一就是非編碼RNA（noncoding RNA），miRNA長約22 nt，屬于非蛋白編碼的單鏈RNA，但能調(diào)控蛋白編碼基因的表達。大多數(shù)哺乳動物的miRNA由RNA聚合酶II編碼，miRNA被發(fā)現(xiàn)于不同的基因組區(qū)域：蛋白編碼基因的內(nèi)含子、非編碼基因的外顯子和內(nèi)含子和蛋白編碼基因的3’端區(qū)域。大約1/3哺乳動物的miRNA嵌在蛋白編碼基因的內(nèi)含子上，且具有它們所存在的蛋白編碼基因相同的轉(zhuǎn)錄模式。根據(jù)計算預(yù)測發(fā)現(xiàn)人類有60%的蛋白編碼基因通過mRNA的3’端與miRNA上被稱為種子區(qū)域的5’端堿基配對受miRNA靶向，配對會抑制靶基因的翻譯和降解，從而控制基因表達。成千上百個靶基因會受同一個miRNA調(diào)控，同時幾個miRNA也可以靶向同一個轉(zhuǎn)錄子。幾乎所有類型的生物學(xué)過程都會被miRNA調(diào)控，如發(fā)育時間的控制、細胞增殖、胚胎干細胞分化、肢體發(fā)育、脂肪沉積、肌細胞生成、血管生成和造血作用、神經(jīng)發(fā)生、脂肪代謝、胰島素分泌乃至癌癥的形成。大多數(shù)miRNA家族在脊椎動物中是保守的，所以它們的功能也很好地被遺傳下來。然而，也有研究表明在人和黑猩猩中發(fā)現(xiàn)了許多在哺乳動物中并不保守的新miRNA，約有10%是物種特異性的。這種類型的研究已拓展到更多物種中，發(fā)現(xiàn)了大量的譜系特異性miRNAs和物種特異性miRNAs。這些結(jié)論表明，對單個生物體miRNA文庫的測序更有利于對保守和新的物種特異性miRNAs進行鑒定和分類。計算方法能有效識別不同植物和動物物種中的保守miRNAs，但是這種方法需要知道完整的基因組序列，若信息不全，物種特異性miRNAs不能被可靠地鑒定，直接對miRNA進行測序是一種描述生物體基因組表達的miRNAs直接且有效的方法。

3 高通量測序技術(shù)在豬miRNA功能研究中的應(yīng)用

豬肉是世界上最廣泛的食用肉類。近年來，由于豬和人類在解剖學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)和藥理學(xué)上具有很多相似性，豬被認為是生物醫(yī)學(xué)研究的潛在模型系統(tǒng)。因此，豬可以為人類健康相關(guān)的研究提供一個全面系統(tǒng)的了解，如肥胖、糖尿病、癌癥、胃潰瘍、女性生殖健康、心血管疾病、傳染病、器官移植等方面。此外，豬在進化上比小鼠更接近人類。豬的經(jīng)濟學(xué)和生物醫(yī)學(xué)意義促進了豬基因組測序聯(lián)盟（S wine Genome Sequencing Consortium，http：//www.piggenome.org/）的成立，以破譯豬的基因組序列?；蚪M序列和轉(zhuǎn)錄組分析大大提高了我們探索各種生物和生物醫(yī)學(xué)秘密的能力，從而更好地利用豬的商業(yè)性狀及有益于人類健康。miRNA和其靶基因的鑒定可以進一步了解影響豬中各種生物和代謝過程的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控機制。

對于人和小鼠來說，目前miRBase數(shù)據(jù)庫（http：//www.mirbase.org/）收錄的豬miRNA數(shù)量并不多，至2014年7月，發(fā)現(xiàn)人的前體miRNA數(shù)1 181條，成熟miRNA數(shù)2 603條；小鼠的前體miRNA數(shù)為1 193條，成熟miRNA數(shù)1 920條；豬的前體miRNA數(shù)為382條，成熟miRNA數(shù)為430條。RNA-seq技術(shù)已運用在豬的不同組織研究中，如骨骼肌、性腺、肝臟、脂肪組織、子宮內(nèi)膜上的研究結(jié)論使我們對豬的mRNA轉(zhuǎn)錄組有了更好的理解。miRNA在β細胞、肌肉細胞個脂肪細胞的代謝轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起重要作用。通過微陣列芯片技術(shù)（Microarray chip technology）對骨骼肌中的整體miRNA豐度進行了檢測，用以評價miRNA在豬發(fā)育和肉生產(chǎn)中作用。miRNA-seq技術(shù)為研究豬miRNA轉(zhuǎn)錄組提供了新的視野，尤其是通過Microarray分析未充分檢測到的miRNAs。目前為止，通過NGS對豬的腸道、產(chǎn)前和產(chǎn)后的仔豬、發(fā)育中的大腦和骨骼肌的miRNA轉(zhuǎn)錄組進行了研究。

最近大量研究利用高通量測序方法對豬組織特異性miRNA庫進行檢測。McDaneld鑒定了豬骨骼肌中的基因表達情況，并預(yù)測了可能靶向這些基因的miRNA。Liu等研究氧化型和糖酵解型骨骼肌之間的差異，鑒定了不同肌纖維類型中觀察到的表型變異中發(fā)揮重要作用的miRNAs。分析了不同豬品種腎臟中表達的miRNAs，鑒定出了品種特異性miRNA，這些miRNAs可能與特定的品種表型有關(guān)。此外，豬牙齒中表達的miRNAs已被作為研究牙齒發(fā)育分子機制的工具；由于兩個物種的相似性，豬腸道中表達的miRNAs可用于研究人類腸道的病理過程。從豬大腦的miRNA表達譜中鑒定了在大腦發(fā)育過程中特異性激活的miRNAs。豬胚胎期的睪丸、卵巢和精細細胞的miRNAs表達對了解豬和其他動物胚胎發(fā)育過程的調(diào)控機制提供了有價值的資源。垂體腺通過特定的激素分泌來維持體內(nèi)的平衡：有研究表明腺體細胞能產(chǎn)生很多參與這個器官的發(fā)育和生理學(xué)過程的miRNA。Li等人在豬的肌肉和脂肪組織的比較研究中發(fā)現(xiàn)，兩種組織中檢測到的miRNA組成和表達水平存在巨大差異，說明皮下脂肪發(fā)育的基礎(chǔ)是由一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來實現(xiàn)。表觀遺傳因子（如miRNA、lncRNA和DNA甲基化）可以調(diào)節(jié)基因的表達，是骨骼肌發(fā)育、代謝和其他過程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。已有研究對豬骨骼肌中miRNA和lncRNAs做了全基因組分析，以研究豬骨骼肌的表型變異，并鑒定出了與肌肉發(fā)育相關(guān)的幾種miRNA和lncRNA，如miRNA-1、m i R N A-2 0 6、m i R N A-1 3 3、miRNA-155、miRNA-127、miRNA-148a、Malat1和H19。

4 高通量測序技術(shù)存在的問題及其展望

高通量測序技術(shù)近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)展的相當(dāng)迅速，特別是給基因組學(xué)的研究帶來了許多方向和思路，盡管如此，高通量測序技術(shù)依然存在一些不容忽視的局限性。第一，高通量測序技術(shù)只適合大規(guī)模的測序，其昂貴的實驗費用對于一些小型簡單的測序來說并不合理，且一般的小型實驗室也無法承受。第二，高通量測序后得到的數(shù)據(jù)量很大，后續(xù)的分析工作也是個難點。第三，高通量測序獲得的結(jié)果僅僅只是研究工作的開始，能用來說明生物學(xué)機制的數(shù)據(jù)還很有限，目前還只是初步獲得了基因組信息，其遺傳機制和通路還有待進一步研究。

高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)促進了基因組學(xué)研究領(lǐng)域的發(fā)展，目前已成為豬轉(zhuǎn)錄組研究的重要手段，為豬的基因組學(xué)研究提供了一個高效的平臺，為當(dāng)前豬品種遺傳改良、輔助育種選擇工作提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

略，若有需要請與作者聯(lián)系

2017-02-21）

寧鄉(xiāng)花豬基礎(chǔ)研究（5026401-0315069）

許棟（1990.8-），女，漢，湖南岳陽人，博士在讀，就讀于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖專業(yè)，豬的分子遺傳，E-mail：112668472@qq.com