桂明才 李兵 戚思國 周長華

(1達(dá)州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 達(dá)州635000；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，重慶400016)

1,25二羥維生素D3誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞凋亡及其對Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

桂明才1李兵2△戚思國1周長華1

(1達(dá)州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，四川 達(dá)州635000；2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，重慶400016)

目的 研究1,25二羥維生素D3抑制人喉癌Hep-2 細(xì)胞增殖作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及其凋亡相關(guān)機(jī)制。方法 用不同劑量(10-8、10-7、10-6mol/L)1,25二羥維生素D3處理Hep-2細(xì)胞24 h、48 h、72 h，四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT)檢測Hep-2細(xì)胞的增殖情況，計算抑制率。流式細(xì)胞術(shù)檢測Hep-2細(xì)胞的凋亡率。Western blot檢測用藥前后細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 1,25二羥維生素D3可以抑制Hep-2細(xì)胞增殖(P<0.05)，最高抑制率可達(dá)30.71%，在上述濃度內(nèi)隨著濃度增加、時間延長抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈時間-劑量依賴性。10-7、10-6mol/L 1,25二羥維生素D3作用48 h后，Hep-2凋亡細(xì)胞比例顯著增加，凋亡率高于空白對照組(P<0.05)。1,25二羥維生素D3處理48 h后，Hep-2細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)上升，Bcl-2蛋白表達(dá)水平下降。結(jié)論 在一定濃度范圍內(nèi)1,25二羥維生素D3能夠抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞的增殖，呈時間-劑量依賴性，其抑制作用與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)；1,25二羥維生素D3可通過上調(diào)Bax蛋白表達(dá)、下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。

1,25二羥維生素D3； 喉癌； Hep-2細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡

喉鱗狀細(xì)胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是頭頸部區(qū)域常見的惡性腫瘤之一，占人類所有惡性腫瘤的2%[1]。傳統(tǒng)喉癌化療藥物對喉癌患者總的生存率一直沒有明顯提高，而且毒副作用明顯，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量以及后續(xù)治療，因此尋求高效、低毒的抗腫瘤藥物已成為喉癌治療方面的研究熱點(diǎn)。1,25二羥維生素D3是一類人體所需的維生素，已有研究發(fā)現(xiàn)1,25二羥維生素D3可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[2]。但目前尚無1,25二羥維生素D3作用于人喉癌Hep-2 細(xì)胞的國內(nèi)外相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 材料

人喉上皮樣癌Hep-2 細(xì)胞株(南京凱基生物有限公司)；Bax、Bcl-2和β-actin 單克隆抗體(Santa Cruz公司)；辣根過氧化酶標(biāo)記物山羊抗小鼠IgG(二抗)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；1,25二羥維生素D3(Sigma 公司)，溶于RPMI1640 培養(yǎng)基制成10 mmol/L 的母液，過濾除菌后-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 人喉癌Hep-2 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI-1 640 培養(yǎng)液中，置入培養(yǎng)箱(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳，飽和濕度)進(jìn)行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法測定細(xì)胞增殖抑制效應(yīng) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度7.5×104個細(xì)胞/mL細(xì)胞懸液，按100 μL/孔接種。細(xì)胞貼壁后分組，加入1,25二羥維生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72 h后終止。終止前4 h每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL 并繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀測各孔吸光度值(A 值)計算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率(%)=(對照組A 值- 給藥組A 值)/對照組A 值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集對數(shù)生長期Hep-2細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，以1×106/mL細(xì)胞濃度10 mL接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h。各實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度1,25二羥維生素D3，培養(yǎng)48 h，2 000 rpm離心5 min收集細(xì)胞達(dá)到5×105/mL細(xì)胞濃度。加500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，與2 μL Annexin V-FITC混勻后，加5 μL Propidium Iodide，混勻。室溫、避光、反應(yīng)10 min。于1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm。進(jìn)行結(jié)果分析并成像保存。

1.2.4 電鏡觀察INS-1細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

收集對數(shù)生長期的Hep-2 細(xì)胞，以1×106/mL細(xì)胞濃度10 mL接種在100 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h。各實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同濃度1,25二羥維生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)，培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)移入1 mL EP管，2 000 rpm離心20 min成團(tuán)塊狀，吸盡上清后，緩慢加入4%戊二醛，于4 ℃冰箱保存，2 h后用 0.1 M的PBS(pH7.2)沖洗。1%餓酸固定1 h，丙酮酸梯度脫水，618環(huán)樹脂，光鏡定位，制備超薄切片。枸櫞酸鈾染色后，透射電鏡觀察、拍照并保存結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.5 Western 蛋白印跡法檢測1,25二羥維生素D3對Hep-2 細(xì)胞Bax 和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平的影響 1,25二羥維生素D3作用48 h后提取細(xì)胞總蛋白。凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。封閉后與加稀釋一抗抗體(靶蛋白抗體)4 ℃過夜。加入稀釋的2抗室溫孵育2 h，顯色，曝光、顯影和定影。吸光度掃描分析后計算各組細(xì)胞靶蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞增殖的影響

MTT法檢測結(jié)果顯示，1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞的生長抑制作用隨藥物濃度的升高而增強(qiáng)，劑量效應(yīng)關(guān)系顯著。在一定濃度下(10-6、10-7、10-8mol/L)，隨作用時間的延長1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞增殖抑制作用也增強(qiáng)，提示1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞的抑制效應(yīng)呈劑量和時間依賴性。見表1。

表1 1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞生長抑制作用

注：干預(yù)組1：1,25二羥維生素D3濃度為10-8mmol/L；干預(yù)組2：1,25二羥維生素D3濃度為10-7mmol/L；干預(yù)組3：1,25二羥維生素D3濃度為10-6mmol/L。不同濃度、不同作用時間與相應(yīng)對照組吸光度值及抑制率比較，*P<0.01；相同作用時間、不同濃度之間吸光度值比較，△P<0.01；不同作用時間、相同濃度之間吸光度值比較，■P<0.01。

2.2 1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響

不同濃度1,25二羥維生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)作用Hep-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞早期凋亡的檢測結(jié)果見圖1，凋亡率見圖2，不同濃度1,25二羥維生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)干預(yù)組凋亡率顯著高于對照組自發(fā)凋亡率的1.82%(P<0.01)。表明1,25二羥維生素D3對Hep-2 細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用，且呈濃度依賴性。

注：A：對照組；B：1,25二羥維生素D3濃度為10-8 mmol/L；C：1,25二羥維生素D3濃度為10-7 mmol/L；D：1,25二羥維生素D3濃度為10-6 mmol/L。圖1 Annexin Ⅴ標(biāo)記法檢測1,25二羥維生素D3誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡

注：A：對照組；B：1,25二羥維生素D3濃度為10-8 mmol/L；C：1,25二羥維生素D3濃度為10-7 mmol/L；D：1,25二羥維生素D3濃度為10-6 mmol/L。與對照組比較，**P<0.01。圖2 Annexin Ⅴ標(biāo)記法檢測1,25二羥維生素D3誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡率

2.3 電鏡觀察1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞凋亡的影響

電鏡下可見，對照組Hep-2細(xì)胞在48 h后體積較大，細(xì)胞結(jié)構(gòu)規(guī)則，表面可見偽足和微絨毛，核幼稚、核仁清楚(2～5個)、常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)少，核漿比例大，胞漿內(nèi)有一定數(shù)量線粒體，糖原含量低，基質(zhì)電子密度較高。不同濃度1,25二羥維生素D3(10-6、10-7、10-8mol/L)干預(yù)組Hep-2細(xì)胞在48 h后與對照組比較，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)紊亂，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清楚、邊緣不整齊，細(xì)胞體積縮小(胞核縮小)導(dǎo)致核漿比例小, 核仁減少或消失，異染色質(zhì)增多，胞核內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，表面微絨毛和偽足減少，可見較多碎片的凋亡小體(圖3)。

注：A：對照組；B：1,25二羥維生素D3濃度為10-8 mmol/L；C：1,25二羥維生素D3濃度為10-7 mmol/L；D：1,25二羥維生素D3濃度為10-6 mmol/L。圖3 1,25二羥維生素D3誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡48 h后電鏡下形態(tài)(TEM×5000)

2.4 1,25二羥維生素D3對Hep-2 細(xì)胞Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

經(jīng)1,25二羥維生素D3作用48 h后，Hep-2 細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低，不同濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨濃度增加，蛋白表達(dá)降低越明顯；Bax蛋白表達(dá)明顯增高，不同濃度組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨濃度增加，蛋白表達(dá)增高越明顯。見圖4。

注：A：對照組；B：1,25二羥維生素D3濃度為10-8 mmol/L；C：1,25二羥維生素D3濃度為10-7 mmol/L；D：1,25二羥維生素D3濃度為10-6 mmol/L。與對照組比較，*P<0.05；與對照組比較，**P<0.01)。圖4 不同濃度1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響

3 討 論

1,25二羥維生素D3能維持體內(nèi)鈣環(huán)境的相對穩(wěn)定，參與調(diào)節(jié)免疫功能，目前被認(rèn)為不僅僅是人體所需的一類維生素，而且能夠影響腫瘤的生物學(xué)活性，可能干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[3]。1,25二羥維生素D3的作用是通過結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)特異性維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)而實(shí)現(xiàn)的[4]。已有研究證實(shí)，1,25二羥維生素D3具有抑制腫瘤增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低腫瘤侵襲性以及抑制血管新生等作用[5]。本研究通過MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度1,25二羥維生素D3處理Hep-2細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，1,25二羥維生素D3對喉癌Hep-2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且呈濃度和劑量依賴性。

細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞生長平衡的重要途徑，與腫瘤的生長及發(fā)展密切相關(guān) 。其形態(tài)學(xué)改變可以通過電子顯微鏡直接觀察。本實(shí)驗(yàn)電鏡下可見，不同濃度實(shí)驗(yàn)組中均可看到凋亡細(xì)胞特征，細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)紊亂，核仁明顯減少、染色深、染色體濃縮、邊集，核裂碎呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片狀，并有凋亡小體形成。本實(shí)驗(yàn)中采用 Annexin Ⅴ-FITC雙標(biāo)記法檢測Hep-2細(xì)胞早期凋亡，證實(shí)了不同濃度1,25二羥維生素D3可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡。10-8、10-7、10-6mol/L 1,25二羥維生素D3在48h對Hep-2細(xì)胞凋亡率分別為12.04%、17.10%、25.13%，明顯高于對照組的1.82%(P<0.01)。隨著1,25二羥維生素D3濃度增加，Hep-2細(xì)胞的凋亡率也明顯增加。

大量研究已經(jīng)證實(shí)Bcl-2基因(即B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因)對細(xì)胞凋亡有抑制作用，近年來的一些研究已開始揭示這一作用的機(jī)制[6]。Bcl-2 家族蛋白通過二聚體網(wǎng)絡(luò)的形式相互作用，調(diào)控細(xì)胞凋亡，不同二聚體間的精細(xì)平衡決定了細(xì)胞是繼續(xù)存活還是走向死亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)1,25二羥維生素D3干預(yù)組在48h時Bcl-2蛋白表達(dá)均較對照組降低，濃度越高，降低越明顯。而1,25二羥維生素D3干預(yù)組在48h時Bax蛋白表達(dá)均較對照組升高，隨濃度增加升高越明顯。可見1,25二羥維生素D3可下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，使Bcl-2抑制凋亡作用減弱，并增強(qiáng)Bax的凋亡作用，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，不同濃度1,25二羥維生素D3可促進(jìn)Hep-2細(xì)胞凋亡，隨著濃度增加和作用時間延長，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象越突出，細(xì)胞增殖抑制也越明顯，在一定濃度范圍內(nèi)1,25二羥維生素D3對Hep-2細(xì)胞增殖抑制作用呈量-效和時-效關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，1,25二羥維生素D3可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡，深入研究其凋亡作用途徑及其機(jī)制，可以為喉癌的臨床治療提供理論證據(jù)。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于需要細(xì)化和增加1,25二羥維生素D3作用濃度，以利于更好地研究不同濃度1,25二羥維生素D3誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞的凋亡作用；也需要進(jìn)一步進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度1,25二羥維生素D3在體內(nèi)對喉癌細(xì)胞的影響，并檢測臨床患者喉癌標(biāo)本和血清中的1,25二羥維生素D3相應(yīng)代謝物濃度，進(jìn)一步為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] Gallina S,Sireci F,Lorusso F, et al. The immunohistochemical peptidergic expression of leptin is associated with recurrence of malignancy inlaryngeal squamous cell carcinoma[J]. Acta Otorhinolaryngol Ital，2015，35(1):15-22.

[2] Martin-Herranz A,Salinas-Hernández P.Vitamin D supplementation review and recommendations for women diagnosed with breast or ovary cancer in the context of bone health and cancer prognosis/risk[J]. Crit Rev Oncol Hematol，2015 ，96(1):91-99.

[3] Tanner SB,Harwell SA.More than healthy bones: a review of vitamin D in muscle health[J]. Ther Adv Musculoskelet Dis，2015，7(4):152-159.

[4] Grant WB,Wimalawansa SJ,Holick MF,et al. Emphasizing the health benefits of vitamin D for those with neurodevelopmental disorders and intellectual disabilities[J]. Nutrients，2015，7(3):1538-1564.

[5] Basit S. Vitamin D in health and disease: a literature?review[J]. Br J Biomed Sci，2013，70(4):161-172.

[6] Vela L,Marzo I. Bcl-2 family of proteins as drug targets for cancer chemotherapy: the long way of BH3 mimetics from bench to bedside[J]. Curr Opin Pharmacol，2015，23:74-81.

[7] Westphal D,Kluck RM,Dewson G. Building blocks of the apoptotic pore: how Bax and Bak are activated and oligomerize during apoptosis[J]. Cell Death Differ，2014，21(2):196-205.

[8] Vitagliano O,Addeo R,D'Angelo V,et al. The Bcl-2/Bax and Ras/Raf/MEK/ERK signaling pathways: implications in pediatric leukemia pathogenesis and new prospects for therapeutic approaches[J]. Expert Rev Hematol，2013，6(5):587-597.

Mechanisms of human laryngeal carcinoma Hep-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction by 1,25-dihydroxyvitamin D3

GuiMingcai1,LiBing2,QiSiguo1,ZhouChanghua1.

1.DepartmentofOtorhinolaryngologyHeadandNeckSurgery,DazhouCentralHospital,Dazhou635000,Sichuan,China. 2.DepartmentsofOtorhinolaryngology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China.

Objective To investigate the mechanisms of human laryngeal carcinoma Hep-2 cell proliferation inhibition and apoptosis induction by 1, 25-dihydroxyvitamin D3. Methods Hep-2 cells were processed by different concentration of 1, 25 dihydroxyvitamin D3 (10-8and 10-7and 10-6 mol / L) for 24 hrs, 48 hrs and 72 hrs. The Hep-2 cells proliferation and inhibition rate were detected and calculated by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT). Apoptosis rate of Hep-2 cells was detected by flow cytometry. The expression levels of Bax and Bcl-2 were analyzed by western blot (WB).Results MTT results were shown that 1, 25-dihydroxyvitamin D3 can inhibit the proliferation of Hep-2 cells (P<0.05). The highest inhibition rate reached 30.71%, in a time-and dose-dependent manner. Flow cytometry showed 1, 25 dihydroxyvitamin D3 with 10-7, 10-6mol/L significantly increased Hep-2 cell apoptosis rate after 48 hrs (P<0.05). West blot (WB) results were shown that Bax protein expression increased and Bcl-2 protein expression decreased after 1, 25-dihydroxyvitamin D3 treatment for 48 hrs.Conclusion A certain range of concentration of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 (10-6to 10-7and 10-8mol/L) can inhibit proliferation of human laryngeal carcinoma Hep-2 Cells, in a time and dose dependent manner, probably through induced apoptosis. 1, 25-dihydroxyvitamin D3 can up-regulate Bax protein expression and down-regulate Bcl-2 protein expression to induce the apoptosis of Hep-2 cells.

1,25-dihydroxyvitamin D3; Laryngeal carcinoma; Hep-2 cells; Apoptosis

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No:cstc2013jcyjA10059)

R739.65

A

1000-744X(2016)08-0790-04

2016-03-23)

△通信作者，E-mail:634339717@qq.com