謝欣 褚明亮 陳祎 張著學(xué) 楊迎春 易韋△ 于燕妮△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

IMP3、EGFR和P53蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

謝欣1褚明亮2陳祎2張著學(xué)2楊迎春2易韋2△于燕妮1△

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

目的 檢測IMP3、EGFR、P53蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，研究其與患者預(yù)后的關(guān)系。方法 收集膠質(zhì)瘤標(biāo)本185例和20例因腦血管畸形手術(shù)切除的正常腦組織，采用免疫組化S-P二步法檢測IMP3、EGFR和P53的表達(dá)情況，并結(jié)合患者生存時間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 IMP3、EGFR和P53在對照組中表達(dá)極低，在膠質(zhì)瘤組織高級別組中表達(dá)水平均明顯高于低級別組。且三者表達(dá)呈顯著正相關(guān)。單因素及COX多因素模型分析表明，IMP3的表達(dá)可作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，EGFR的表達(dá)對患者預(yù)后存在一定影響，但不可作為預(yù)后獨(dú)立危險因素。結(jié)論 IMP3、EGFR和P53的聯(lián)合檢測可能成為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記的新指標(biāo)，IMP3、EGFR可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的特異靶點(diǎn)。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤； 免疫組化； 胰島素樣生長因子IImRNA結(jié)合蛋白3； 表皮生長因子受體； 抑癌基因P53蛋白

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見腫瘤，呈浸潤生長，術(shù)后易復(fù)發(fā)，目前治療效果較差。胰島素樣生長因子IImRNA 結(jié)合蛋白3 ( insulin-like growth factor-II mRNA-binding protein 3，IMP3)是IGF-IImRNA的翻譯激活子，通過上調(diào)IGF-IImRNA的翻譯進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1]。表皮生長因子受體 (epidermal growth factor receptor, EGFR)基因的編碼產(chǎn)物是一種具有酪氨酸激酶(tyrosines kinase,TK)活性的跨膜蛋白受體，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)增多,能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲[2]。p53為抑癌基因，其基因突變是腦膠質(zhì)瘤中最常見的基因突變，最終能導(dǎo)致腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[3]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中IMP3、EGFR及P53的表達(dá)情況，分析三者與膠質(zhì)瘤病理分級及患者術(shù)后生存時間的關(guān)系，并探討三者間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 資料與試劑

收集貴州省人民醫(yī)院病理科膠質(zhì)瘤石蠟組織標(biāo)本185例，其中男113例，女72例；年齡4～75歲，中位年齡46歲。所有患者術(shù)前均未行放、化療。根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，分為低級別組(Ⅰ-Ⅱ級)85例，高級別組(Ⅲ-Ⅳ級)100例。另取因腦血管畸形手術(shù)切除中的非瘤腦組織(白質(zhì))20例作為對照組。收集2012-2013年臨床膠質(zhì)瘤患者臨床資料并進(jìn)行隨訪，入組標(biāo)準(zhǔn)：膠質(zhì)瘤初發(fā)病例，診斷明確，臨床資料完整；手術(shù)鏡下全切除。排除標(biāo)準(zhǔn)：確診為膠質(zhì)瘤，同時患有其它系統(tǒng)嚴(yán)重疾??；組織石蠟標(biāo)本過小。

主要試劑：兔抗人IMP3多克隆抗體(工作濃度1∶100)、兔抗人EGFR多克隆抗體(工作濃度1∶100)、兔抗人P53多克隆抗體(工作濃度1∶100)，購于北京博奧森生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水溫箱(上海躍進(jìn)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Leica RM2135石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；低溫冰箱(青島海爾集團(tuán))；光學(xué)顯微鏡(DM2700 M)(德國Leica公司)；加樣器(日本Nichimate 公司)；玻片及蓋玻片(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；5810-R型臺式冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf Germany公司)。

1.3 免疫組化方法

采用免疫組化S-P法，均以PBS代替一抗及探針作為陰性對照，試劑公司提供陽性對照。IMP3和EGFR陽性信號定位在腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色顆粒；P53陽性表達(dá)在細(xì)胞核，著色棕黃色；根據(jù)著色強(qiáng)度及陽性百分比進(jìn)行評分：無色為陰性，計0分；淡黃色為弱陽性，計1分；棕黃色為中等陽性，計2分；棕褐色為強(qiáng)陽性，計3分。陽性細(xì)胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分，兩者相乘為免疫組化半定量評價標(biāo)準(zhǔn)：≤4分為低表達(dá)，>4分為高表達(dá)。

1.4 隨訪方法

采用電話聯(lián)系方式進(jìn)行隨訪，截止時間：2015年5月。隨訪內(nèi)容包括：一般情況；是否復(fù)發(fā)及復(fù)發(fā)后是否繼續(xù)治療；是否存活，若死亡，具體死亡原因及時間。總生存期計算從患者第一次手術(shù)時間開始到隨訪截止日期或患者死亡日期為止。共獲訪65例，其中54例死亡，11例生存。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行分析，計數(shù)資料差異性分析采用四格表χ2檢驗(yàn)及連續(xù)校正和Fisher精確法，關(guān)聯(lián)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，生存分析采用Kaplan-Meier單因素分析及Cox回歸多因素模型分析。P<0.05示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IMP3、EGFR、P53蛋白在各組中表達(dá)情況

IMP3、EGFR和P53蛋白在20例對照組中表達(dá)極低或不表達(dá)；在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織高級別組中的表達(dá)率均明顯高于低級別組(χ2=26.673，χ2=18.846，χ2=13.812，P均<0.001)，且陽性表達(dá)程度均隨腫瘤級別增高而增高(rs=0.391，rs=0.330，rs=0.284)。見表1、圖1。

注：a連續(xù)校正。

圖1 免疫組化檢測IMP3、EGFR和P53在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)(×100)

2.2 IMP3、EGFR和P53表達(dá)強(qiáng)度間的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示， IMP3、EGFR與P53表達(dá)水平皆呈正相關(guān)(rs=0.197，rs=0.477，P均<0.01)，且IMP3表達(dá)與EGFR表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(rs=0.374，P<0.001)。見表2。

表1 IMP3、EGFR和P53表達(dá)強(qiáng)度間的相關(guān)性

2.3 IMP3、EGFR和P53表達(dá)對患者生存期的影響

Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，65例隨訪者中，IMP3和EGFR 高表達(dá)的患者總生存時間均低于低表達(dá)患者(Log-rank=15.389，Log-rank=4.230，P均<0.05，見圖2a、圖2b)。但P53高表達(dá)患者與低表達(dá)患者術(shù)后生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05,見圖2c)。運(yùn)用多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險因素，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤組織中IMP3蛋白的表達(dá)可作為患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，雖單因素分析顯示EGFR對患者預(yù)后存在影響，但多因素分析顯示其暫不作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的獨(dú)立危險因素。P53的表達(dá)對患者預(yù)后無明顯影響。見表3、表4。

βSβWaldχ2RR395．0%CIRRPIMP31．1270．30213．9041．707，5．5823．0870．000EGFR-1．0270．7262．0030．086，1．4850．3580．157P530．9790．7951．5180．561，12．6362．6620．218

表4 Cox回歸自變量賦值情況

3 討 論

IMP3是癌胚mRNA 結(jié)合蛋白，為VICKZ 家族[4]成員，在胚胎早期組織中呈高表達(dá)，但在成人正常組織中表達(dá)極低。在腫瘤發(fā)展中，IMP3是IGF-IImRNA的翻譯激活子，通過上調(diào)IGF-IImRNA的翻譯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生。IMP3基因編碼產(chǎn)物通過結(jié)合目的信使RNA如IGF-2，調(diào)控RNA的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后控制[5-6]。一方面，具有抗凋亡、使惡變傾向的細(xì)胞逃避凋亡而形成腫瘤，另一方面IGF2可通過甲硫氨酸腦啡肽信號傳導(dǎo)系統(tǒng)上調(diào)腫瘤細(xì)胞中VEGF的表達(dá),促進(jìn)腫瘤血管的形成[7]。本研究結(jié)果顯示，IMP3蛋白的表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達(dá)顯著高于低級別組(P<0.001)。且IMP3蛋白的表達(dá)對患者預(yù)后有明顯影響，多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析提示，可將其作為預(yù)后的獨(dú)立監(jiān)測因子。結(jié)果均提示IMP3蛋白與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。

EGFR/ErbB-1/HER1是一種具有TK活性的跨膜蛋白受體，其基因位于人第7號染色體短臂，含28個外顯子[8]，包含細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)激酶區(qū)[9]。目前研究已發(fā)現(xiàn)多條EGFR下游信號傳導(dǎo)分子通路，其主要通路有三條：Ras/Rsf/MEK/MAPK通路、PI3K/PDK1/AKT/mTOR通路和JAK/STAT通路。這三條通路間存在廣泛聯(lián)系，相互影響，構(gòu)成一個復(fù)雜的信號網(wǎng)共同參與到腫瘤的形成中[9]。同時對EGFR與腫瘤的血管生成、高侵襲性及轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究[10]發(fā)現(xiàn)，EGFR可通過Ang-1及VEGF等因子水平的調(diào)節(jié)影響腫瘤血管生成。本研究結(jié)果顯示，EGFR蛋白表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達(dá)顯著高于低級別組(P<0.001)，很好地反映了EGFR的生物學(xué)特性?；颊哳A(yù)后分析結(jié)果顯示，EGFR蛋白的表達(dá)對患者預(yù)后存在一定影響，但多變量Cox比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果暫不支持將其作為膠質(zhì)瘤的獨(dú)立監(jiān)測因子。

P53基因位于染色體17p13.1，屬于抑癌基因，分野生型和突變型兩種，其編碼產(chǎn)物為P53蛋白，是由393個氨基酸組成的53kD的核內(nèi)磷酸化蛋白[11]。P53基因的突變與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)[12-13]，穩(wěn)定的突變型P53蛋白可通過免疫組化檢測出。在對兒童膠質(zhì)瘤研究中一部分檢出了P53基因的突變，且約半數(shù)病例中P53呈顯著表達(dá)[14]。也有研究[15-16]顯示膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中P53突變率高達(dá)35%～60%。本研究結(jié)果顯示，P53蛋白表達(dá)隨膠質(zhì)瘤級別增高而增高(P<0.01)，高級別組表達(dá)顯著高于低級別組(P<0.001)，患者預(yù)后分析顯示，P53蛋白的表達(dá)雖對患者預(yù)后有一定影響，但暫不可作為預(yù)后的獨(dú)立危險因素。

本研究結(jié)果還顯示，IMP3與EGFR的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示在膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中，IMP3與EGFR可能存在一定協(xié)同作用。目前研究發(fā)現(xiàn)，二者均可通過相關(guān)通路使血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)一步為腫瘤生長提供營養(yǎng)，加速腫瘤細(xì)胞增殖，形成惡性循環(huán)[7,10]。相關(guān)分析還顯示，EGFR與P53表達(dá)亦呈顯著正相關(guān)，說明二者可能協(xié)同參與了膠質(zhì)瘤的惡性轉(zhuǎn)變，這也可能與P53的突變引起EGFR的過表達(dá)有關(guān)；但還需進(jìn)一步研究加以明確。同時本研究結(jié)果還顯示IMP3表達(dá)與P53表達(dá)亦呈正相關(guān)性，提示三者與膠質(zhì)瘤的發(fā)展關(guān)系非常密切，對三者的聯(lián)合檢測可能對膠質(zhì)瘤分級提供幫助。

綜上所述，膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟多因素相互作用的過程，IMP3、EGFR和P53蛋白的表達(dá)其關(guān)系密切，三者聯(lián)合檢測可能成為膠質(zhì)瘤生物標(biāo)記的新指標(biāo)，IMP3和EGFR的靶點(diǎn)治療有望成為膠質(zhì)瘤的有效治療方案。

[1] Beljan P R, Durdov M G, Capkun V, et al. IMP3 can predict aggressive behaviour of lung adenocarcinoma[J]. Diagn Pathol,2012,7(1):165.

[2] Stupp R,Hegi ME,Mason WP,et al.Effects of radiotherapy with concomitant and adjuvant temozolomide versus radiotherapy alone on survival in glioblastoma in a randomised phase III study:5-year analysis of the EORTC-NCIC trial[J].Lancet Oncol,2009,10(5):459-466.

[3] 馬家烈，韋芳，李惠明，等.14株腫瘤細(xì)胞P53基因突變的檢測[J].中國腫瘤生物治療雜志，2008,15(2)：163-168.

[4] Yisraeli J K. VICKZ proteins: a multi-talented family of regulatory RNA-binding proteins[J]. Biol Cell,2005,97(1):87-96.

[5] Li C,Zota V,Woda B A,et al.Expression of a novel oncofetal mRNA-binding Protein IMP3 in endometrial carcinomas:diagnostic significance and clinicopathologic correlations[J].Mod Pathol,2007,20(2):1263-1268.

[6] Zheng W,Yi X,Fadare O,et al.The oncofetal protein IMP3:a novel biomarker for endometrial serous carcinoma[J].Am J Surg Pathol,2008,32(2):304-315.

[7] Bermont L,Lamielle F,Fauconnel S,et al.Regulation of vascular endothelial growth factor growth factor expression by insulin-like growth factor-I in endometial adenocarcinoma cells[J].Int J Cancer,2000,85(1):117-123.

[8] Olayioye MA,Neve RM,Lane HA,et al.The EerbB signaling network receptor heterodimerization in development andcancer[J].The EMBO J,2001,19(13):3159.

[9] 孫與晨，出良釗，劉健.惡性膠質(zhì)瘤中EGFR信號通路及靶向治療藥物[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2015,23(4):308-311.

[10] 劉坤，王海江，孫振強(qiáng)，等.胃癌組織HER-2和VEGR及EGFR表達(dá)臨床意義研究[J].中華腫瘤防治雜志,2015，22(10):781-785.

[11] 賴軍，羅林.MGMT和Ki-67及P53蛋白在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)及意義[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2015,42(3)：169-171.

[12] Meder L,Konig K, Ozretic L,et al.NOTCH, ASCL1, p53 and RB alterations define an alternative pathway driving neuroendocrine and small cell lung carcinomas[J],International Journal of Cancer,2016,138(4):927-938.

[13] Arola J,Salmenkivi ,Liu J,et al.p53 and Ki67 in adrenocortical tumors[J].Endocrine Research,2000,26(4):861-865.

[14] Rood BR,MacDonald TJ.Pediatric high-grade glioma:molecular genetic clues for innovative therapeutic approaches[J].J Neurooncol,2005,75(3):267-272.

[15] Nayak A,Ralie AM,harma MC,et al.p53 protein alterations in adultastrocytic tumors and oligodendrogiiomas[J].Neurol India,2004,52(2):228-232.

[16] Watanabe T,Katayama Y,Yoshino A,et al.Deregulation of the TP53/p14ARF tumor suppressor pathway in low-grade diffuse astrocytomas and its influence on clinical course[J].Clin Cancer Res,2003,9(13):4884-4890.

Study on the detections of IMP3, EGFR and P53 in glioma and their relationships with the prognosis

XieXin1,ChuMingliang2,ChenYi2,ZhangZhuxue2,YangYingchun2,YiWei2,YuYanni1.

1.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China. 2.People'sHospitalofGuizhouMedicalUniversity, 550002,Guizhou,China.

Objective To investigate the expressions and clinical significance of IMP3, EGFR and P53 protein in glioma. Methods Expression of IMP3, EGFR and p53 were analyzed by S-P immunohistochemsitry in 185 cases of gliomas and 20 cases of normal brain tissues. Kaplan-Meier and multivariate analysis of Variance was used to analysis the survival rate of patients with gliomas. Results Positive expression rate of IMP3, EGFR and P53 in glioma tissue were higher than those in normal brain tissue. The expression rate of IMP3, EGFR and p53 were positively correlated with the pathologic stage. Meanwhile, there was a significantly positive correlation between IMP3, EGFR and IGF2. Histological grading and expression of IMP3 were the independent risk factors of prognosis of glioma, there was a certain effect on the prognosis of patients for EGFR, but it is not an independent risk factor for prognosis.Conclusions Combined detection of IMP3, EGFR and P53 may be new markers of glioma, and IMP3 and EGFR might be possible novel targets for molecular treatment of gliomas.

Glioma; Immunohistochemistry; IMP3; EGFR; P53

貴州省科技廳基金資助課題 (黔科合字LH[2014]7017號)

R R739.41

A

1000-744X(2016)08-0794-04

2016-06-21)

△通信作者，E-mail：yiwei6252@sina.com(易韋)；gyyxybl2010@163.com(于燕妮)