朱 蕾 徐仁伵

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，江西 南昌 330006)

·綜述·

蛋白質(zhì)組學(xué)在常見神經(jīng)退行性疾病中的臨床研究進(jìn)展

朱 蕾 徐仁伵

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)科，江西 南昌 330006)

神經(jīng)退行性疾??；蛋白質(zhì)組學(xué)；阿爾茨海默?。慌两鹕。缓嗤㈩D氏?。患∥s性脊髓側(cè)索硬化

神經(jīng)退行性疾病是癥狀多樣化的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，常見的有阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓氏病(HD)、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化(ALS)及許多其他不常見的、有功能障礙的疾病〔1〕。盡管已經(jīng)證明基因突變與這些疾病密切相關(guān)，但大多數(shù)仍具有一定的年齡依賴性〔2〕。雖然神經(jīng)退行性疾病起源不同，但神經(jīng)退行性疾病都以神經(jīng)元退化引起的進(jìn)展性的運(yùn)動(dòng)、感覺、知覺及相關(guān)的認(rèn)知和行為障礙為特征〔3〕?；蛲蛔兒屯庠匆蛩毓餐瑢?dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和進(jìn)展，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣〔4〕。常見的神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因突變導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，病變蛋白質(zhì)在大腦皮層、基底神經(jīng)節(jié)、小腦、腦干及運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)形成蛋白質(zhì)聚集和包涵體〔5〕。然而，導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集的分子途徑在很大程度上是未知的。盡管特定的基因異常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退化，但是遺傳性的基因突變并不是神經(jīng)細(xì)胞死亡的唯一原因，現(xiàn)有證據(jù)表明，外源性因素以及基因變異共同導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡〔6〕。至今導(dǎo)致神經(jīng)退化的根本機(jī)制目前是不明確的。本文就蛋白質(zhì)組學(xué)在神經(jīng)退行性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 神經(jīng)退行性疾病概述

不同的神經(jīng)退行性疾病的癥狀、發(fā)病年齡和疾病進(jìn)展特點(diǎn)各不相同，但是很多疾病在早期階段經(jīng)常出現(xiàn)類似的癥狀。

AD最常見的臨床表現(xiàn)發(fā)生在生命的后期，但遺傳性早發(fā)型AD也是被證實(shí)存在的〔7〕。淀粉樣前體蛋白(APP)、早衰蛋白(PS)1及PS2與早發(fā)性家族型AD相關(guān)〔8〕。這些突變的基因?qū)е录?xì)胞產(chǎn)生對神經(jīng)元細(xì)胞具有毒性的β淀粉樣肽(β-amyloid)42〔9〕。AD的神經(jīng)病理特點(diǎn)是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)和細(xì)胞外老年斑(SPs)。NFTs是微管相關(guān)tau蛋白(MAPT)過度磷酸化形式的〔10〕。SPs由多個(gè)蛋白質(zhì)及β-amyloid與局部炎癥反應(yīng)形成的。NFTs與SPs導(dǎo)致神經(jīng)退化的確切作用目前尚不清楚。進(jìn)展的AD主要在海馬體、大腦皮質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)元丟失〔11〕。tau蛋白的突變也伴隨著NFTs和17號染色體常染色體顯性遺傳的額顳葉癡呆(FTD)〔12〕。FTD是癡呆在所有年齡組有臨床特征的第3個(gè)主要原因〔13〕。

PD是除了AD最常見的神經(jīng)退行性疾病，特點(diǎn)是神經(jīng)元多巴胺(DA)的缺失及黑質(zhì)密部中形成的路易小體(LB)〔14〕。 PD大多是散發(fā)的，家族遺傳型與Parkin(PARK2)、PINK1(PARK6)、DJ-1(PARK7)、α-synuclein(PARK1和PARK4)、泛素羧基端水解酶-L1基因(PARK5)和富亮氨酸重復(fù)激酶2(PARK8)突變有關(guān)〔15〕。在路易體癡呆(DLB)中，LB廣泛表達(dá)于大腦皮質(zhì)神經(jīng)元亞群內(nèi)〔16〕。

與PD相比，明確的家族史可以在本質(zhì)上確定所有情況下的HD〔17〕。HD表現(xiàn)為DNA復(fù)制錯(cuò)誤與亨廷頓蛋白基因的胞嘧啶-腺嘌呤-鳥嘌呤(CAG)三核苷酸重復(fù)序列動(dòng)態(tài)突變發(fā)生病理性擴(kuò)增引起多聚谷氨酰胺鏈異常延長導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病〔18〕。

ALS其特點(diǎn)是皮層、腦干和脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元功能損傷，由于細(xì)胞縐縮和軸突腫脹導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞廣泛死亡〔19〕。不到10%的ALS為家族性，其中約10%～20%有超氧化物歧化酶(SOD)1基因突變，參與調(diào)節(jié)自由基的形成〔20〕。遺傳研究表明，SOD1基因突變對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有選擇性毒性作用〔21〕。

最后，還有一系列的早發(fā)型常染色體隱性疾病，主要影響下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，稱為脊髓性肌萎縮，主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肌無力和肌萎縮。絕大多數(shù)脊髓性肌肉萎縮癥患者運(yùn)動(dòng)神經(jīng)SMN1基因缺失〔22〕。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)方法的概述

質(zhì)譜法(MS)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展對多肽或蛋白質(zhì)成分復(fù)雜的混合物的檢測提供了有效幫助，使檢測實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)的靈敏度、準(zhǔn)確度和速度有所提升〔23〕。MS還可以應(yīng)用于不同樣本之間的定性和定量的蛋白質(zhì)差異的比較，尤其是發(fā)病組與未發(fā)病組。結(jié)合各種各樣的蛋白質(zhì)組學(xué)方法不僅可以分析蛋白質(zhì)的特征，而且還可以分析細(xì)胞和生化通路，可以為神經(jīng)退行性疾病生物學(xué)標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)做出貢獻(xiàn)。

功能蛋白質(zhì)組學(xué)是專門收集蛋白質(zhì)表達(dá)、轉(zhuǎn)錄后修飾(PTMs)和活動(dòng)信息的研究方法，不僅僅是蛋白質(zhì)鑒定，并且可以使我們對生物系統(tǒng)的功能有更全面的理解。功能蛋白質(zhì)組學(xué)可以運(yùn)用數(shù)學(xué)模型或其他生物學(xué)工具進(jìn)行系統(tǒng)的生物化學(xué)分析〔24〕。隨著MS技術(shù)的提升，可以結(jié)合MS與蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)來評估蛋白質(zhì)之間的相互作用〔25〕。激酶組學(xué)是功能蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)分支，主要涉及激酶的識(shí)別〔26〕，還可以識(shí)別激酶靶蛋白質(zhì)，并闡明細(xì)胞通路〔27〕。

化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)是集生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、有機(jī)合成和質(zhì)譜于一體的學(xué)科〔28〕。這種方法為識(shí)別疾病潛在的生物學(xué)標(biāo)記和藥物靶點(diǎn)提供了機(jī)會(huì)。臨床蛋白質(zhì)組學(xué)，或稱為平移蛋白質(zhì)組學(xué)的目的是幫助疾病早期診斷、預(yù)測疾病進(jìn)展、識(shí)別新的治療靶點(diǎn)及評估治療療效〔29〕。氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)不斷發(fā)展的分支，目的是識(shí)別和量化在病理?xiàng)l件下氧化的蛋白質(zhì)，更好的理解蛋白質(zhì)氧化〔30〕。不同的蛋白質(zhì)組學(xué)方法適用于不同的神經(jīng)退行性疾病。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對神經(jīng)退行性疾病的研究

3.1樣品制備 蛋白質(zhì)樣品可以應(yīng)用于各種目的，如下游識(shí)別、量化、功能研究。組織破壞有機(jī)械破壞或酶消化，組織破壞后，細(xì)胞已經(jīng)溶解，即可提取蛋白質(zhì)〔31〕。提取蛋白質(zhì)的方法必須考慮到處理材料的數(shù)量和要使用的分析方法(電泳，色譜法，質(zhì)譜法)。生物液體樣品制備往往需要在質(zhì)譜分析之前去除干擾成分及分餾。

3.2蛋白質(zhì)分離 蛋白質(zhì)分離方法基于電泳或色譜法。疾病的蛋白質(zhì)表達(dá)，二維凝膠電泳(2-DE)與MS結(jié)合最常用〔32〕。在2-DE中，蛋白質(zhì)混合物根據(jù)等電點(diǎn)(PI)在第一維度分離，根據(jù)分子量在第二維度分離，并使用多種可視化蛋白質(zhì)染色方法。比較兩個(gè)蛋白樣品，由于蛋白質(zhì)樣品被不同熒光劑示蹤，凝膠電泳(DIGE)的結(jié)果具有差異性〔33〕。由于各蛋白樣本有不同的蛋白表達(dá)，被不同標(biāo)記物標(biāo)記的不同蛋白質(zhì)混合物，可在同一張2-DE凝膠上進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。除了電泳技術(shù)，各種依靠液相色譜法(LC)的無凝膠方法也可用于蛋白質(zhì)或多肽的分離。LC在比較蛋白質(zhì)組學(xué)中是可以從復(fù)雜混合物中分離出完整的蛋白質(zhì)的重要方法〔34〕。多維蛋白質(zhì)識(shí)別技術(shù)(MudPIT)是LC的重要擴(kuò)展，由于不同固定相的分配系數(shù)不同可分離高度復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物〔35〕。色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以用于蛋白質(zhì)自動(dòng)識(shí)別、翻譯后修飾(PTM)特性和蛋白質(zhì)的量化。表面增強(qiáng)激光解吸/電離質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-MS)源自基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-MS)，結(jié)合色譜法固相萃取及飛行時(shí)間質(zhì)譜法(TOF-MS)檢測蛋白質(zhì)，可發(fā)現(xiàn)有診斷價(jià)值的特異蛋白質(zhì)〔36〕。

3.3蛋白質(zhì)識(shí)別和量化 由于高靈敏度和高選擇性，蛋白質(zhì)鑒定首選MS。質(zhì)譜儀可分離和檢測氣相離子，因此必須使用不同的電離技術(shù)電離和蒸發(fā)分析物。常見的電離技術(shù)是電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)〔37〕。質(zhì)量分析器利用電氣或磁場將生成的氣相離子分離。蛋白質(zhì)鑒定中，首先利用肽鏈內(nèi)切酶或胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)混合物，利用MS檢測蛋白質(zhì)消化產(chǎn)生的肽段，將得出來的實(shí)驗(yàn)序列與基因組序列數(shù)據(jù)庫對應(yīng)蛋白質(zhì)理論序列對比。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中需要測量某個(gè)生物樣本中的相對或絕對質(zhì)量。同位素標(biāo)記定量法用于蛋白質(zhì)的量化檢測。細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)是基于MS的利用非放射性同位素檢測樣本中的蛋白質(zhì)差異的技術(shù)。無標(biāo)記定量方法是使用三級四極串聯(lián)質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)技術(shù)。這些方法將對疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床診斷提供有力的幫助。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在神經(jīng)退行性疾病中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)幾乎參與所有生物過程，可以作為疾病的有效的生物學(xué)標(biāo)志。由于神經(jīng)退行性疾病患者的腦組織很難得到，血液及腦脊液(CSF)較容易獲得，多數(shù)時(shí)候利用神經(jīng)退行性疾病患者體液進(jìn)行相關(guān)研究。如Keeney等〔38〕使用氧化還原蛋白質(zhì)組學(xué)確定各種神經(jīng)退行性疾病包括AD和PD患者血清和CSF 中氧化的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示在AD和PD中載脂蛋白(Apo)A-1水平降低，ApoA-1受影響高度氧化變性形成4-羥-2-壬烯(HNE)，ApoA-1氧化可直接導(dǎo)致神經(jīng)退化，ApoA-1可以作為有效的診斷標(biāo)記物及藥物治療靶點(diǎn)。

4.1AD 最近LC-電噴霧離子化(ESI)-MS用來研究無癥狀和癥狀性家族性AD和晚發(fā)性AD CSF中PSEN1和APP蛋白表達(dá)的差異〔39〕。雖然56個(gè)蛋白表達(dá)有差異(46個(gè)表達(dá)上調(diào)和10個(gè)表達(dá)下調(diào))，所有AD組CSF中各蛋白表達(dá)明顯重疊。除了已經(jīng)確定的AD相關(guān)蛋白，研究還發(fā)現(xiàn)許多獨(dú)特的蛋白質(zhì)包括calsyntenin-3、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體(AMPA)、4谷氨酸受體、CD99抗原、CTBS及磷分泌蛋白質(zhì)1。Albertini等〔40〕最近使用SELDI-TOF-MS技術(shù)發(fā)現(xiàn)AD CSF 的 Aβ肽亞型。通過免疫蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)散發(fā)的AD相比精神分裂癥患者的CSF所有肽亞型均減少，15個(gè)不同Aβ肽亞型中Aβ1～42是唯一減少的，可以作為AD的生物學(xué)標(biāo)志。Wijte等〔41〕應(yīng)用樣品制備方法對AD患者CSF行多肽分析，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)生的內(nèi)源性肽和多肽共價(jià)結(jié)合蛋白。VGF神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)蛋白和補(bǔ)體C4存在于自由肽部分，蛋白結(jié)合部分存在VGF神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)蛋白和α2-HS型糖蛋白〔42〕。為了評估多肽分析對早期AD的診斷，Jahn等〔42〕開發(fā)了一種新技術(shù)應(yīng)用毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法識(shí)別AD的生物學(xué)標(biāo)志，檢測到CSF中1 104種低分子量肽存在。

4.2PD 為了更好地在分子和細(xì)胞水平了解PD的發(fā)病機(jī)制及診斷生物標(biāo)志物，若干研究利用血液(全血、血漿、血清)和CSF行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。Zhao等〔43〕利用2-DE結(jié)合MS技術(shù)分析了中國PD組的血清蛋白質(zhì)變化，15種蛋白質(zhì)被檢測出來，其中7種是PD的特異性蛋白質(zhì)。分析表明，這些蛋白質(zhì)很可能參與抗氧化作用、脂質(zhì)代謝、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)。Chen等〔44〕利用2-DE-MS技術(shù)對非PD組和PD組血漿行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果顯示IgGκL和人類血清淀粉樣蛋白(SA)P具有表達(dá)差異性，酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測出PD血漿中SAP濃度比非PD組顯著提高，提示SAP可作為PD的生物學(xué)標(biāo)志。

對PD組和對照組利用2-DE技術(shù)行CSF蛋白質(zhì)組學(xué)差異分析，血清白蛋白、血紅蛋白β片段、突變球蛋白、富含脯氨酸蛋白(PRR)14和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白N端具有差異表達(dá)，這些蛋白可能導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙及PD的發(fā)病及進(jìn)展〔45〕。無油凝膠蛋白質(zhì)組學(xué)方法被用來識(shí)別和量化CSF中蛋白質(zhì)和多肽。Zhang等〔46〕利用iTRAQ技術(shù)結(jié)合2D LC-MS/MS分析PD不同階段的差異蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示26個(gè)不同的蛋白質(zhì)，8個(gè)上調(diào)蛋白，18個(gè)下調(diào)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙，蛋白質(zhì)異常聚合和炎癥有關(guān)。

由于某些蛋白存在于PD中，一些研究采用血液和CSF行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。如DJ-1蛋白質(zhì)存在于常染色體隱性遺傳PD及特發(fā)性PD中，已經(jīng)被證實(shí)是人類CSF中的生物標(biāo)志物〔47〕，且具有抗氧化和相關(guān)的神經(jīng)保護(hù)作用〔48〕。早期的PD組和對照組之間的對照研究顯示在PD組CSF中DJ-1水平降低，但在血漿中無顯著差異〔49〕。Lin等〔50〕利用另外的114例樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，建議把全血中的DJ-1亞型而不是總的DJ-1作為遲發(fā)型PD的生物學(xué)標(biāo)志。

為了分析PD的生物學(xué)標(biāo)志，可以應(yīng)用先進(jìn)的生物信息學(xué)和生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包括Biomarker Wizard 3.1，Biomarker Patterns Software，Ciphergen 3.1 Biomarker Wizard與MS結(jié)合。這些軟件通過定義識(shí)別模式和分類樹來分類蛋白質(zhì)。他們通過聚類分析自動(dòng)檢測質(zhì)量峰值，使用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)方法來計(jì)算峰值的靈敏度和特異性。靈敏度是區(qū)分出總疾病病例中準(zhǔn)確分類疾病病例的能力，而特異性區(qū)分出對照病例總數(shù)中準(zhǔn)確分類對照病例的能力。

4.3HD 關(guān)于HD生物液體中的生物學(xué)標(biāo)志蛋白質(zhì)組學(xué)研究并不多。Dalrymple等〔51〕嘗試應(yīng)用2-DE和MALDI-TOF 技術(shù)對HD組及對照組的血漿和CSF進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，得出叢生蛋白是HD確定的生物學(xué)標(biāo)志。Huang等〔52〕發(fā)現(xiàn)HD患者CSF中凝血酶原水平、ApoA-Ⅳ和結(jié)合珠蛋白表達(dá)升高，可以確定它們參與HD的發(fā)病機(jī)制，可作為HD的診斷生物學(xué)標(biāo)記。

4.4ALS 基于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)很少有ALS的生物學(xué)標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)。Ranganathan等〔53〕應(yīng)用SELDI-TOF-MS和Subsequent biomarker wizard技術(shù)發(fā)現(xiàn)ALS CSF中甲狀腺素運(yùn)載蛋白和半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白7B2水平升高。Pasinetti等〔54〕使用類似的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，在ALS 患者CSF中驗(yàn)證了半胱氨酸蛋白酶抑制物C水平降低，并且發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)內(nèi)分泌蛋白質(zhì)VGF消化型片段的存在。最近應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)分別快速和緩慢進(jìn)展的ALS患者和對照組的CSF行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，在快速進(jìn)展型ALS的CSF中發(fā)現(xiàn)了6種上調(diào)蛋白質(zhì)。除此之外，胎球蛋白A和甲狀腺素運(yùn)載蛋白也被證實(shí)可作為ALS的生物學(xué)標(biāo)志〔55〕。

4.5其他神經(jīng)退行性疾病 Constantinescu等〔56,57〕應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)對56例PD患者的CSF和非典型帕金森疾病患者(ADP)的CSF:包括42例帕金森疊加綜合征(MSA)患者，39例進(jìn)行性核上性麻痹(PSP)患者，9例皮質(zhì)基底核變性(CBD)者和24例正常人的CSF進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。泛素、β2微球蛋白和兩種分泌粒蛋白1(嗜鉻粒蛋白B)碎片在正常人和PD患者有差異性，但PD組和各APD對照組無明顯差異性。

5 蛋白質(zhì)組學(xué)對于神經(jīng)退行性疾病的臨床意義

神經(jīng)退行性疾病是一類癥狀表現(xiàn)和疾病進(jìn)展有明顯異質(zhì)性的疾病，甚至在相同的神經(jīng)退行性疾病不同的疾病表型癥狀表現(xiàn)各異。由于生物學(xué)的異質(zhì)性需要了解疾病的發(fā)病機(jī)制，預(yù)后標(biāo)志物的識(shí)別比診斷標(biāo)記物的識(shí)別來得容易，并且將對藥物治療改變疾病的進(jìn)展產(chǎn)生巨大影響。預(yù)后標(biāo)記物能夠?qū)Ω呶；颊哌M(jìn)行早期預(yù)防，使得藥物開發(fā)效率更高，成本更低。

綜上，蛋白質(zhì)組學(xué)與神經(jīng)影像、臨床數(shù)據(jù)的結(jié)合可以提高神經(jīng)退行性疾病診斷的準(zhǔn)確性，增強(qiáng)生物標(biāo)志物的驗(yàn)證能力。蛋白質(zhì)組學(xué)研究本身還存在許多缺點(diǎn)和不足，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和信息技術(shù)發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)研究將為病理機(jī)制、建立診斷標(biāo)準(zhǔn)、發(fā)現(xiàn)藥物治療靶點(diǎn)等方面做出更大的貢獻(xiàn)。

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〔2016-08-19修回〕

(編輯 李相軍)

R741

A

1005-9202(2017)19-4914-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.102

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30560042,81160161,81360198)

徐仁伵(1969-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事肌萎縮側(cè)索硬化和帕金森病的發(fā)病機(jī)制和防治研究。

朱 蕾(1989-)，女，博士，主要從事肌萎縮側(cè)索硬化的防治研究。