趙 帥 孫靜娜 代麗麗 李彥明 單保恩 耿玉蘭 魏從真

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031)

·消化、呼吸系統(tǒng)疾病·

老年慢性乙型肝炎患者用藥治療后乙肝病毒耐藥基因多位點(diǎn)變異

趙 帥 孫靜娜 代麗麗 李彥明 單保恩1耿玉蘭 魏從真

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050031)

目的 分析拉米夫定(LAM)和恩替卡韋(ECV)聯(lián)合用藥及單獨(dú)用LAM后老年乙肝患者乙肝病毒(HBV)耐藥基因突變位點(diǎn)及與基因型的關(guān)系。方法 選擇治療前未檢測出HBV-YMDD變異的老年乙肝患者100例，隨機(jī)分為兩組，在患者治療后24個(gè)月檢測基因分型和反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)位點(diǎn)變異。結(jié)果 聯(lián)合用藥組中檢出耐藥突變類型分別為rtT184L+L180M+M204V、rtT184L+S202G+L180M+M204V、rtM250L+M204I；單用藥組檢出耐藥基因突變類型分別為rtL180M+M204V、rtL180M+M204I、rtM204I。結(jié)論 初期使用LAM聯(lián)合ECV治療老年乙肝患者24個(gè)月后耐藥突變率僅為6%；聯(lián)合用藥在B和C兩種基因型中的耐藥檢出率沒有明顯不同。

聯(lián)合用藥；恩替卡韋；拉米夫定；慢性乙肝；基因型；RT區(qū)位點(diǎn)變異

慢性乙肝患者長期使用核苷類藥物治療后乙肝病毒(HBV)耐藥基因位點(diǎn)變異是常見并不可避免的現(xiàn)象，老年乙肝患者發(fā)病率高，且并發(fā)癥出現(xiàn)也較多，合并急性肝衰竭可達(dá)25%，肝炎病死率超過10%〔1〕。本研究觀察恩替夫韋(ECV)聯(lián)合拉米夫定(LAM)治療老年乙肝患者24個(gè)月后血清基因型及HBV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)耐藥率和突變類型，了解聯(lián)合用藥在慢性乙肝治療和轉(zhuǎn)歸中預(yù)防或降低耐藥率的有效性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院2012年1～12月門診及住院老年慢性乙肝患者100例，治療前未檢測出HBV-YMDD變異，男67例，女33例，年齡62～70歲。分為聯(lián)合用藥組(50例)每日口服LAM 50 mg和ECV 0.5 mg，單獨(dú)用藥組(50例)每日單用 LAM 100 mg。兩組一般資料無顯著差異。

1.2 樣本采集與貯存 治療24個(gè)月后，采集靜脈血于促凝真空采血管中，每管3 ml，離心后取上清，檢測基因型，分析 RT 區(qū)(rt180M、rt184L、rt204V、rt204I、rtS202、rtM250)位點(diǎn)變異。

1.3 檢測方法 HBV基因型分析、RT區(qū)耐藥突變基因檢測采用PCR-反向點(diǎn)雜交芯片法，儀器為檢測儀器為BYQ6056E-298擴(kuò)增儀和YN-H16雜交儀。試劑購自深圳亞能生物有限公司。所有操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，同期室內(nèi)質(zhì)控合格。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

聯(lián)合用藥組檢出HBV耐藥基因突變共3例，其變異類型分別為rtT184L+L180M+M204V(C基因型)、rtT184L+S202G+L180M+M204V(C基因型)、rtM250L+M204I(B基因型)各1例。C基因型33例中檢出2例耐藥突變，B基因型17例中檢出1例耐藥突變，兩種基因型之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(校正χ2=0.36，P>0.05)，單獨(dú)用藥組檢出HBV耐藥基因突變共23例，其變異類型分別為rtL180M+M204V(6例，其中C基因型4例、B基因型2例)、rtL180M+M204I(5例，其中C基因型3例、B基因型2例)、rtM204I(12例，其中C基因型9例、B基因型3例)。C基因型35例中檢出16例耐藥突變，B基因型15例中檢出7例患者耐藥突變，兩種基因型無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.00，P>0.05)。

3 討 論

慢性乙肝體內(nèi)HBV DNA的不斷復(fù)制可導(dǎo)致肝硬化甚至肝癌，抗病毒藥物核苷類似物可以干擾病毒DNA的合成，終止HBV的復(fù)制，但是長期服用核苷類似物藥物可導(dǎo)致HBV產(chǎn)生耐藥性。LAM是一種在結(jié)構(gòu)上與核苷酸類似，可替代核苷酸參與DNA和RNA的合成過程，從而達(dá)到終止病毒復(fù)制的目的。研究〔2〕結(jié)果顯示，LAM可迅速有效抑制HBV復(fù)制，長期應(yīng)用可以顯著改善肝細(xì)胞壞死并緩解肝臟纖維化進(jìn)程，隨著LAM的長期使用會(huì)產(chǎn)生耐藥性，引起HBV P基因區(qū)180位點(diǎn)或204位點(diǎn)發(fā)生突變，影響了長期的治療效果，5年耐藥率高達(dá)60%～70%〔3〕。ECV是國內(nèi)新上市的鳥嘌呤核苷類抗病毒藥物，初治患者具有耐藥率低，抗HBV強(qiáng)的特點(diǎn)，且在有效抑制 HBV-DNA復(fù)制、降低患者體內(nèi)病毒載量的同時(shí)間接改善機(jī)體T細(xì)胞亞群免疫功能。Colonno等〔4〕發(fā)現(xiàn)，ECV在對(duì)LVD耐藥的患者的搶救性治療后96 w，耐藥率為9%,LAM耐藥的常見突變位點(diǎn)為rtM204I和rtL180M，經(jīng)ECV用藥后進(jìn)一步增加出現(xiàn)rtT184、rtS202或rtM250等位點(diǎn)的突變，即出現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)的突變。有研究〔5～7〕結(jié)果顯示，LAM耐藥后會(huì)導(dǎo)致對(duì)ECV的敏感性下降近60倍，使治療出現(xiàn)耐藥基因突變后的挽救措施越來越困難，因此預(yù)防耐藥基因突變的出現(xiàn)及優(yōu)化治療方案比耐藥后的挽救顯得越來越重要。目前聯(lián)合治療乙型肝炎已逐漸被國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注和認(rèn)可，國外研究顯示〔8〕，LAM聯(lián)合ECV用藥可使肝臟炎癥在早期得到控制、對(duì)于肝纖維化的出現(xiàn)起到預(yù)防干預(yù)及延緩逆轉(zhuǎn)的作用，療效更佳。

楊瑞鋒等〔9〕研究顯示，DNA微陣列芯片法檢測HBV耐藥突變有很好的準(zhǔn)確性，檢測結(jié)果與克隆測序完全符合率達(dá)95.5%(214/224)。近些年來，基因芯片技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，具有檢測微量基因突變的高敏感性，由于具備快速和易于自動(dòng)化等優(yōu)勢，可同時(shí)進(jìn)行多種基因聯(lián)合檢測的特點(diǎn)，逐漸成為遺傳疾病篩查及微生物耐藥檢測領(lǐng)域的前沿技術(shù)并開始在臨床廣泛使用〔10～12〕。薛瑞霞等〔13〕研究顯示B、C基因型在我國慢性乙肝患者中為主要出現(xiàn)的基因型，且ECV多為LAM耐藥后加用或換用，使rtM204V+rtL180M+rtT184L成為目前我國ECV耐藥的主要變異類型，此結(jié)果與本研究結(jié)果相似。

1 成炳祥,陳紅花,莊 莉.老年乙肝患者肝硬化相關(guān)危險(xiǎn)因素的評(píng)估〔J〕.中華全科醫(yī)學(xué),2014;12(6):920-1.

2 徐東平.乙型肝炎病毒耐藥的檢測與判斷〔J〕.中華肝臟病雜志,2009;17:61-3.

3 朱錦宏.阿德福韋酯聯(lián)合拉米夫定治療慢性乙肝的療效研究〔J〕.藥物與臨床,2012;50(12):73-5.

4 Colonno RJ,Rose R,Levine S,etal.Entecavir two year resistance update:no resistance observed in nucleoside naive patients and low frequency resistance emergence in lamivudine refractory patients〔J〕.Hepatology,2005;42(Suppl 1):962.

5 Langley DR,Walsh AW,Baldick CJ,etal.Inhibition of hepatitis B virus polymerase by Entecavir〔J〕.J Vir,2007;81(8):3992-4001.

6 Park JW,Kim HS,Seo DD,etal.Long-term efficacy of entecavir in adefovir-refractory chronic hepatitis B patients with prior lamivudine resistance〔J〕.J Viral Hepat,2011;18(10):475-81.

7 Ling R,Harrison TJ.Functional analysis of mutations conferring lamivudine resistance on hepatitis B virus〔J〕.J Gen Virol,1999;80(Pt 3):601-6.

8 Schiff ER,Lee SS,Chao YC,etal.Long-term treatment with entecavir induces reversal of advanced fibrosis or cirrhosis in patients with chronic hepatitis B〔J〕.Clin Gastroen Hepatol,2011;9(3):274-6.

9 楊瑞鋒,杜紹財(cái),叢 旭,等.DNA微陣列芯片法檢測慢性乙型肝炎拉米夫定和阿德福韋酯耐藥突變〔J〕.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2010;33(11):1049-53.

10 張 華,劉宇清,王幼勤,等.遺傳性耳聾基因芯片檢測及其臨床意義〔J〕.臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2009;23(11):1032-5.

11 Zhu LX,Zhang ZW,Liang D,etal.Multiplex asymmetirc PCR-based oligonucleotide microarray for detection of dru g resistance genes containing single mutations in Enterobacteriaceae〔J〕.Antimicrob Agents Chemother,2007;51:3707-13.

12 Guo Y,Zhou Y,Wang C,etal.Rapid，accurate determination of nmhidrug resistance in Mtuberculosis isolates and sputum using a biochip system〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis,2009;13:914-20.

13 薛瑞霞,張繚云,楊 松,等.恩替卡韋治療失敗的慢性乙型肝炎患者耐藥分析20例〔J〕.世界華人消化雜志,2009;17(12):1260-3.

〔2016-02-23修回〕

(編輯 苑云杰)

河北省衛(wèi)生廳科研立項(xiàng)(20130565)

魏從真(1984-)，女，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要從事微生物免疫檢驗(yàn)研究。

趙 帥(1982-)，女，主管檢驗(yàn)師，碩士，主要從事微生物免疫檢驗(yàn)研究。

R512.6

A

1005-9202(2017)10-2484-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.10.061

1 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科