張 達， 李姝玉， 王巖飛， 李奕萱， 易月娥， 高譽珊， 張淑靜， 賈德賢， 王 謙

(北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029)

?

·短篇論著·

黃芪與葛根素聯(lián)用對KKAy小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)PERK通路的影響*

張 達， 李姝玉， 王巖飛， 李奕萱， 易月娥， 高譽珊， 張淑靜， 賈德賢， 王 謙△

(北京中醫(yī)藥大學(xué)， 北京 100029)

目的： 研究黃芪注射液與葛根素注射液合用對小鼠糖尿病腎病內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)通路相關(guān)因子的影響。方法: 將12周齡的雄性KKAy小鼠隨機分成模型組和治療組，每組14只，分別注射生理鹽水或黃芪、葛根素注射液合劑，14只同齡雄性C57BL /6J小鼠為正常組。于16周齡時處死小鼠，電鏡觀察各組小鼠腎臟形態(tài)改變，通過real-time PCR和Western blot法檢測PERK、真核起始因子2α(eIF2α)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的mRNA及蛋白表達。結(jié)果: 模型組及治療組小鼠腎小管上皮細胞細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹。模型組PERK、eIF2α及GRP78的mRNA及蛋白表達均高于正常組(P<0.05)，治療組較模型組下降。結(jié)論: 黃芪注射液同葛根素注射液聯(lián)用可能通過減少PERK、eIF2α及GRP78的表達降低2 型糖尿病KKAy小鼠腎臟過強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

KKAy小鼠; 黃芪； 葛根素； 糖尿病腎病； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的信號途徑是糖尿病過程中各臟器實質(zhì)細胞損傷早期反應(yīng)的一個共性機制，在糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發(fā)病機制起重要作用[1-2]。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)葛根素注射液與黃芪注射液的使用可以明顯降低糖尿病腎病患者尿蛋白總量，明顯改善血脂及血液流變學(xué)指標(biāo)，對減輕腎臟病變、緩解癥狀、提高臨床療效均有裨益[3-4]，然而該作用的機制還不甚明確。本實驗擬通過觀察黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對KKAy糖尿病小鼠腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase, PERK)、真核起始因子2α(eukaryotic initiation factor 2α, eIF2α)及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)的mRNA及蛋白表達的影響，探討中藥黃芪和葛根防治DN的機理。

材 料 和 方 法

1 試劑和儀器

黃芪及葛根素注射液分別購自成都地奧九泓制藥廠和浙江康恩貝制藥股份有限公司；提取及逆轉(zhuǎn)錄RNA所用試劑盒均購自Promega；Western blot實驗所用抗體購自Abcam；血糖測量儀及試紙購自Bayer。離心機(Eppendorf)；透射電子顯微鏡(JEOL)；real-time PCR 儀(ABI)；凝膠成像儀(Alpho Innotech Fluor Chem)。

2 實驗動物

SPF級KKAy雄性小鼠28只，許可證編號為SCXK(京)2009-0004；C57BL/6J雄性小鼠14只，許可證編號為SCXK(京)2009-0007，均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。動物飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心屏障系統(tǒng)，每籠2只，每日更換墊料、飼料及水。高脂飼料及普通飼料均購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

3 方法

3.1 動物分組及給藥 KKAy小鼠給予高脂飼料； C57BL/6J小鼠給予普通飼料，均為普通飲水，每日更換墊料，KKAy小鼠高脂飼養(yǎng)至12周齡時，將隨機血糖≥13.9 mmol/L的KKAy小鼠確定為糖尿病小鼠，隨機分為模型組(14只)和治療組(14只)，C57BL/6J小鼠全部進入正常組。按照注射液藥品說明書，根據(jù)體重計算，治療組小鼠每日先腹腔注射黃芪注射液(0.003 mL/g)，隨后葛根素注射液(0.0013 mL/g)，模型組及正常組小鼠均每日注射等體積生理鹽水。以上小鼠均2只1籠，各組動物均自由飲食，于16周齡時處死動物。

3.2 形態(tài)學(xué)檢測 打開小鼠腹腔后取雙側(cè)腎臟組織，將所取小鼠腎組織迅速用鋒利的刀片取1 mm×1 mm×1 mm左右的腎皮質(zhì)(冰上操作)，固定于2.5%的戊二醛(pH 7.4)中，制作超薄切片，電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)。

3.3 Real-time PCR檢測mRNA的表達 處死小鼠打開腹腔后取雙側(cè)腎臟組織，取出后置于液氮罐中保存，而后使用TRIzol提取腎臟組織細胞中的RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，之后采用real-time PCR方法檢測小鼠腎組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中PERK和eIF2α的mRNA表達情況，所用引物序列詳見表1。用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達率，其中ΔΔCt是按照以下公式計算的，計算公式：ΔCt=Ct(樣品基因)-Ct(內(nèi)參照)；ΔΔCt=ΔCt(治療組或模型組基因)-ΔCt(對照組基因)。最后，計算表達比率。依據(jù)以上公式，選取GAPDH作為內(nèi)參照，求GRP78、eIF2α和PERK的相對表達量。

表 1 Real-time PCR引物序列

3.4 Western blot實驗檢測蛋白表達 小鼠腎臟組織經(jīng)蛋白提取并變性后依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、 I抗孵育、 II 抗孵育后曝光，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激PERK通路中相關(guān)蛋白PERK、eIF2α及GRP78的蛋白表達情況。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 9.4軟件處理，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，并采取Bonferroni校正的t檢驗進行各組均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠的一般狀況

治療組及模型組小鼠均有精神不振，體毛缺乏光澤，活動遲緩，并出現(xiàn)多飲、多食、多尿，與正常組相比，體重增加，而且隨著周齡增加癥狀加重，治療組部分小鼠上述情況得到一定改善。在整個實驗過程中，C57BL/6J小鼠未死亡；模型組死亡2只，其原因為被同籠小鼠或自己咬傷，治療組死亡2只，原因可能與糖尿病酮癥酸中毒、感染或其它相關(guān)并發(fā)癥有關(guān)，最終共計38只小鼠完成實驗，其中正常組14只，模型組12只，實驗組12只。

2 腎臟形態(tài)學(xué)觀察

透射電鏡觀察可見正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完好，足突排列有序，腎小管上皮細胞線粒體結(jié)構(gòu)清晰，基底膜清楚完整。模型組小鼠腎小球基底膜輕度增厚，可見腎小球系膜基質(zhì)增多，足突排列出現(xiàn)紊亂、融合；腎小管上皮細胞胞漿疏松，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細胞核腫脹，線粒體腫脹、嵴消失。與同周齡模型組小鼠相比，治療組小鼠腎小球毛細血管基底膜增厚程度有所減輕，腎小球系膜區(qū)基質(zhì)輕度增多；腎小管上皮細胞線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹有一定改善；腎間質(zhì)膠原纖維增生不明顯，見圖1。

Figure 1.The ultrastructural changes of the renal tissues in all groups observed under electron microscope. A: normal group; B: model group; C: treatment group.

圖1 小鼠腎組織的電鏡觀察

3 Real-time PCR檢測PERK及eIF2α的mRNA表達

由表2可知模型組PERK及eIF2α的mRNA表達量均高于正常組，治療組的表達量則低于模型組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而治療組的表達水平同正常組比較差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

表 2 小鼠腎臟組織中PERK和eIF2α的mRNA表達

Table 2. The mRNA expression of PERK and eIF2α in the mouse renal tissues (Mean±SD.n=6)

GroupPERKeIF2αNormal1．00±0．001．00±0．00Model1．53±0．12?1．45±0．64?Treatment1．21±0．19#1．23±0．20#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group．

4 Western blot實驗檢測eIF2α、GRP78和PERK蛋白的水平

模型組的eIF2α、GRP78和PERK蛋白表達高于正常組和治療組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，治療組略高于正常組,但兩者之間的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見圖2、表3。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)失衡即為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。為消除這種應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)迅即啟動未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)，未折疊蛋白反應(yīng)是包括蛋白合成暫停、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶和折疊酶表達上調(diào)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解等在內(nèi)的一種綜合性反應(yīng)[5]。存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)、PERK、活化轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6， ATF6)3種蛋白分子是感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激信號的一類跨膜感受蛋白[6]。正常情況下, 這3種信號感受蛋白都分別與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi) GRP78結(jié)合形成復(fù)合物，且處于無活性狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白蓄積增加時，GRP78分子轉(zhuǎn)而結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不斷增多的新生未折疊蛋白，從而導(dǎo)致這3種感受蛋白從其 GRP78復(fù)合物中解離出來[7-8]，啟動后續(xù)反應(yīng)，解離后的PERK形成同源二聚體，發(fā)生自身磷酸化而激活，激活的PERK 使真核翻譯起始因子eIF2α的第5l位絲氨酸發(fā)生磷酸化而活化，使80S核糖體的組裝和蛋白合成被抑制，下調(diào)幾乎所有的蛋白質(zhì)翻譯，進而減緩了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白質(zhì)的合成，減少錯誤蛋白的折疊，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負擔(dān)，維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡。雖然活化后的eIF2α能抑制大部分蛋白的翻譯，但卻能特異性的上調(diào)ATF4的表達，ATF4的表達上調(diào)可以激活CHOP啟動凋亡，在細胞的損傷不可修復(fù)的情況下使細胞發(fā)生凋亡[9-10]。綜上所述，GRP78、PERK和eIF2α的表達情況可以一定程度上反映細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，尤其是PERK通路的狀態(tài)。

Figure 2. Western blot was performed to detect the protein expression of PERK, eIF2α and GRP78 in the renal tissues of the mice with different treatments.

圖2 Western blot檢測小鼠腎組織中PERK、eIF2α和GRP78蛋白的表達

表3 小鼠腎組織中PERK、eIF2α和GRP78蛋白的表達

Table 3. The protein xpression of PERK, eIF2α and GRP78 in the mouse renal tissues (Mean±SD.n=6)

GroupPERKeIF2αGRP78Normal0．97±0．040．99±0．010．98±0．06Model1．17±0．04?1．25±0．08?1．32±0．10?Treatment0．99±0．03#0．99±0．02#0．99±0．04#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group．

糖尿病腎病由糖尿病發(fā)展而來。糖尿病在中醫(yī)論著中早有記載，多稱為消渴癥，消渴癥的中醫(yī)分型，通常將其分為陰虛熱盛、濕熱困脾、氣陰兩虛、陰陽兩虛多種證型，但以陰陽兩虛型最多見[11]，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，陰陽兩虛是貫穿其病情發(fā)展始終的主要病機，而腎陽虛衰是糖尿病腎病發(fā)展至后期的主要病機。葛根升陽生津，黃芪益氣利水，臨床葛根常與黃芪相須為用，治療陰虛消渴，共奏滋陰清熱之功效[12-13]。

課題組之前進行的前期實驗對黃芪注射液聯(lián)用葛根注射液的血清指標(biāo)包括空腹血糖、甘油三酯、血肌酐、總膽固醇等及GRP78的mRNA的檢測實驗結(jié)果已經(jīng)可以看出二者合用可以在一定程度對KKAy小鼠的癥狀有一定改善[14]，且GRP78的mRNA表達下降也可以猜測是降低了細胞內(nèi)的ERS。本實驗結(jié)果同前期實驗結(jié)果共同說明，葛根素注射液聯(lián)用黃芪注射液可以在一定程度上控制血糖和降低血脂，并且能夠預(yù)防糖尿病腎病損害的發(fā)生，減輕病理性腎臟損傷，對腎臟有積極的保護作用，前期的光鏡觀察及本實驗中的電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察等形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果中也支持了這種結(jié)論[14]，治療組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)較模型組小鼠完整清晰，說明黃芪和葛根素聯(lián)合用藥能減輕糖尿病腎病腎臟功能和結(jié)構(gòu)的損害。電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)，可見模型組小鼠相比治療組小鼠的腎小球基底膜增厚，足突增寬、扁平，足突融合，足細胞的胞質(zhì)空泡變性。這也與之前某些研究具有相同結(jié)論[15-17]。

在real-time PCR及Western blot實驗的結(jié)果中顯示模型組小鼠PERK和eIF2α的mRNA及上述指標(biāo)及GRP78蛋白的表達最高，且相比于正常組的表達量差異較大，可以認為模型組小鼠由于糖尿病腎病發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。統(tǒng)計結(jié)果顯示KKAy小鼠腎組織中GRP78、PERK和eIF2α的mRNA及蛋白表達均高于正常小鼠，證實在糖尿病腎病過程中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。研究結(jié)果還顯示經(jīng)黃芪注射液和葛根素注射液干預(yù)治療后，KKAy小鼠GRP78、PERK和eIF2α的mRNA及蛋白表達降低，與此一致的是KKAy小鼠的血清生化指標(biāo)也同時得到改善[14]。

綜上所述，我們推測黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液通過減少GRP78、PERK和eIF2α的表達，緩解糖尿病小鼠體內(nèi)持續(xù)存在的ERS，從而保護腎功能，增加胰島素敏感性而降低血糖。

[1] Verzola D, Gandolfo MT, Ferrario F, et al. Apoptosis in the kidneys of patients with type II diabetic nephropathy[J]. Kidney Int, 2007, 72(10): 1262-1272.

[2] Liu F, Brezniceamu ML, Wei CC, et al. Overexpression of angiotensinogen increases tubular apoptosis in diabetes[J]. J Am Soc nephrol, 2008, 19(2): 269-280.

[3] 玉從容， 呂俊華， 王 丹. 葛根素抗氧化作用與改善胰島素抵抗綜合癥模型大鼠胰島素敏感性、血壓和血脂作用的實驗研究[J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2006, 40(4): 53-55．

[4] 王 念， 毛先睛， 王 沈， 等. 黃芪多糖減輕2型糖尿病大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和增加胰島素敏感性的實驗研究[J]. 公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué), 2007, 18(4):13-16.

[5] Lin JH, Walter P, Yen TS. Endoplasmic reticulum stress in disease pathogenesis[J]. Annu Rev Pathol, 2008, 3:399-425

[6] Trombetta ES, Parodi AJ. Quality control and protein folding in the secretory pathway[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2003, 19: 649-676.

[7] Chevet E, Smirle J, Cameron PH, et al. Calnexin phosphorylation: linking cytoplasmic signalling to endoplasmic reticulum lumenal functions[J]. Semin Cell Dev Biol, 2010, 21(5): 486-490.

[8] Michalak M, Groenendyk J, Szabo E, et al. Calreticulin, a multiprocess calcium-buffering chaperone of the endoplasmic reticulum[J]. Biochem J, 2009, 417(3): 651-666.

[9] Lin JH, Li H, Zhang Y, et al. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability[J]. PLoS One, 2009, 4(1):e4170.

[10]Mounir Z, Krishnamoorthy JL, Wang S, et al. Akt determines cell fate through inhibition of the PERK-eIF2α phosphorylation pathway[J]. Sci Signal, 2011, 4(192):ra62.

[11]趙靈燕， 畢力夫， 趙慧輝， 等. 147例2型糖尿病患者中醫(yī)辨證分型及臨床指標(biāo)相關(guān)性分析[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013, 36(07):480-483.

[12]Wu F, Chen X. Review of pharmacological study onAstragalusmembranaceus(Fisch.) Bge[J]. J Chin Med Mater, 2004, 27(3):232-234.

[13]王鳳杰， 鄧 娟， 蘇 慧， 等. 黃芪多糖對2 型糖尿病大鼠心肌UCP2表達和AMPK 活性的影響[J]. 武漢大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版, 2009, 30(5):574-578.

[14]張志慧， 李姝玉， 王巖飛， 等. 黃芪注射液聯(lián)合葛根素注射液對糖尿病腎病KKAy小鼠78kD-葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2015, 38(5): 323-326.

[15]陳艷芬， 王春怡， 李衛(wèi)民， 等. 黃芪葛根湯對糖尿病心肌病大鼠氧化應(yīng)激和NF-κB 表達的影響[J]. 中成藥, 2012, 34(8):1428-1432.

[16]許 紅， 尤海燕， 李姝玉， 等. 葛根素注射液對2 型糖尿病動物模型KKAy小鼠腎損傷病理改變的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2014, 37(3):180-183.

[17]易月娥， 聶彥娜， 李姝玉， 等. 葛根素注射液對糖尿病KKAy小鼠腎小管上皮細胞的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(12):2263-2267.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effects of astragalus injection combined with puerarin injection on process of endoplasmic reticulum stress through PERK pathway in dabe-tic nephropathy mice

ZHANG Da, LI Shu-yu, WANG Yan-fei, LI Yi-xuan, YI Yue-e, GAO Yu-shan, ZHANG Shu-jing, JIA De-xian, WANG Qian

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China.E-mail:wangqianchai@163.com)

AIM: To investigate the effects of astragalus injection combined with puerarin injection on endoplasmic reticulum stress through PERK pathway in diabetic nephropathy mice. METHODS: Male KKAymice were randomly divided into model group (injected with normal saline) and treatment group (injected with astragalus and puerarin). The male C57BL/6J mice served as normal group. The mice were sacrificed 4 weeks after treatments for observing morphological changes under electron microscope. The renal tissues were collected to determine the expression of protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels by real-time PCR and Western blot. RESULTS: Under electron microscope, the renal tubular epithelial cells in model group and treatment group showed the swelling of the nucleus, endoplasmic reticulum and mitochondria. The results of real-time PCR and Western blot showed that the expression of PERK, eIF2α and GRP78 at mRNA and protein levels in model group was higher than that in normal group (P<0.05), while that in treatment group was lower than that in model group. CONCLUSION: Astragalus injection combined with puerarin injection reduces the mRNA and protein expression of PERK, eIF2α and GRP78, thus inhibiting the endoplasmic reticulum stress in type 2 diabetic mice to protect the kidney function.

KKAymice; Astragalus; Puerarin; Diabetic nephropathy; Endoplasmic reticulum stress

1000- 4718(2017)01- 0166- 05

2016- 05- 05

2016- 10- 31

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81072926)；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團隊資助項目(No. 2011-CXDT-04)

R363; R587.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.01.028

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 010-64286965; E-mail: wangqianchai@163.com