(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118)

聚合酶鏈反應(yīng)在貓幾種病毒診斷中的應(yīng)用

杜翔宇，孫英堯，楊一鳴，董浩

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130118)

本文以聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)的理論與應(yīng)用為基礎(chǔ)，立足于貓細(xì)小病毒、貓杯狀病毒及貓皰疹病毒的生物學(xué)特征，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)貓幾種病毒的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，為實(shí)驗(yàn)用貓的檢測(cè)以及實(shí)驗(yàn)用貓的標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)在公共衛(wèi)生學(xué)方面也具有重要意義。

1 聚合酶鏈反應(yīng)在貓細(xì)小病毒病診斷中的應(yīng)用

1．1 貓細(xì)小病毒生物學(xué)特征貓細(xì)小病毒(Feline parvovirus virus，F(xiàn)PV)具有高度接觸傳染性，以引起貓科動(dòng)物以高熱、嘔吐、白細(xì)胞嚴(yán)重減少和腸炎為主要臨床特征的病毒性傳染病，故又稱之為貓傳染性腸炎病毒、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒和貓瘟病毒;病毒核酸為二十面體對(duì)稱的單股、無囊膜的DNA病毒，直徑為20～24 nm;FPV除了感染貓科動(dòng)物外，還感染浣熊、水貂和狐貍等動(dòng)物，該病對(duì)各種野生動(dòng)物造成極大的威脅，具有很高的發(fā)病率和死亡率。目前，F(xiàn)PV在細(xì)小病毒屬中屬于感染范圍最廣、致病性最強(qiáng)的一種病毒［1］。

1．2 貓細(xì)小病毒病病毒的診斷貓細(xì)小病毒廣泛存在于世界各地，是發(fā)病率和死亡率高的一種病毒性傳染病，PCR作為靈敏度高、準(zhǔn)確的一種檢測(cè)方法在FPV診斷中具有重要的價(jià)值。李爽建立了具有高度特異性和靈敏性的FPV PCR檢測(cè)方法，對(duì)長春地區(qū)某寵物醫(yī)院的疑似FPV感染貓進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為FPV陽性［2］。王翀根據(jù)GenBank中FPV NS基因、FCV ORF2基因、FHV-I TK基因設(shè)計(jì)3對(duì)引物，貓細(xì)小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒可在同一PCR體系中擴(kuò)增出來，最低檢出限分別為101．5TCID50、101．9TCID50、101．2TCID50，血清檢測(cè)結(jié)果表明，陽性率分別為5%、2．5%、4．1%，該方法具有良好的特異性和敏感性［3］。王吉建立FPV的PCR檢測(cè)方法，研究結(jié)果表明，與貓皰疹病毒I型、貓冠狀病毒、貓合胞體病毒、貓免疫缺陷病毒均無交叉反應(yīng)，檢測(cè)病毒最小滴度為5 lg TCID50/mL，DNA模板濃度為4．9×102拷貝/μL，在貓臨床樣本33份中檢測(cè)出21份FPV陽性［4］。邱杰建立了FPV PCR快速檢測(cè)方法，檢出的最小DNA濃度為6．19×10－8μg/μL ，檢出DNA濃度低于1fg/μL，靈敏度高、特異性高，在3004份樣品中檢出13份FPV核酸陽性，可應(yīng)用于FPV流行病學(xué)調(diào)查［5］。貓細(xì)小病毒還可以感染貓科動(dòng)物，喬軍應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)1只病死東北虎的脾臟進(jìn)行檢測(cè)，得到與標(biāo)準(zhǔn)FPV完全一致的核酸條帶，而對(duì)輪狀病毒、犬腺病毒、犬瘟熱的檢測(cè)均為陰性，PCR技術(shù)的特異性與靈敏性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的血凝和血凝抑制試驗(yàn)［6］，為虎、熊貓和獅子等動(dòng)物的早期診斷以及進(jìn)出口部門檢疫工作提供了技術(shù)支持。

2 聚合酶鏈反應(yīng)在貓杯狀病毒診斷中的應(yīng)用

2．1 貓杯狀病毒生物學(xué)特征貓杯狀病毒(Feline calicivirus，F(xiàn)CV)是杯狀病毒科、水皰性病毒屬的成員之一［7］;能夠引起貓科動(dòng)物急性口腔潰瘍、結(jié)膜炎、急性關(guān)節(jié)炎、上呼吸道傳染病和慢性胃腸炎等疾病，故又叫貓傳染性鼻-結(jié)膜炎;病毒是無囊膜的單股正鏈RNA，直徑為30～40 nm;FCV在貓科動(dòng)物中廣泛流行，是危害貓科動(dòng)物的重要病原之一，在我國貓群、虎和獵豹之間也存在感染FCV流行的報(bào)道［8］。FCV可導(dǎo)致動(dòng)物患血熱樣疾病，F(xiàn)CV的變異也可導(dǎo)致VSD的暴發(fā)，引起人們高度重視。

2．2 貓杯狀病毒的診斷貓杯狀病毒呈世界性分布，接種疫苗的動(dòng)物仍然可以成為持續(xù)性感染源，造成疾病的流行。該病的鑒定方法有病毒分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)等多種方法，然而PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡易等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)有效控制FCV的傳播提供了有效的方法。鄭翠玲應(yīng)用RT-PCR和重組PCR技術(shù)擴(kuò)增了FCV CH-GD株的全基因，用DNAStar軟件比較分析其氨基酸序列和核苷酸序列，采用重組PCR方法獲得了含突變位點(diǎn)的FCV全長cDNA克?。?］。劉曄設(shè)計(jì)一對(duì)FCV衣殼蛋白基因正反向引物，該病毒為自然弱毒株，并進(jìn)行了免疫幼貓的試驗(yàn)，產(chǎn)生較高水平的中和抗體，能抵抗FCV強(qiáng)毒株攻擊而不發(fā)?。?0］。Mohamed等建立了檢測(cè)FCV的實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，并用此法和病毒分離法對(duì)122個(gè)樣本進(jìn)行了檢測(cè)，該法和病毒分離法都具有較高的靈敏度與特異性，但是該檢測(cè)方法用時(shí)更短［11］。姜雪建立了檢測(cè)FCV的熒光定量PCR方法，只能檢出FCV而其他貓相關(guān)病毒為陰性，線性范圍為2．264×1011－2．264×101拷貝/μL，重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)為2．158%，對(duì)24份疑似FCV貓唾液檢測(cè)，結(jié)果與病毒分離鑒定一致［12］。Chris等建立了SYBR greenI實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，并且對(duì)FCV分離株進(jìn)行了檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)熔解曲線和熔解溫度可區(qū)分出不同F(xiàn)CV分離株，其特異性強(qiáng)、敏感度高，可精確定量病毒模板的濃度［13］，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 聚合酶鏈反應(yīng)在貓皰疹病毒診斷中的應(yīng)用

3．1 貓皰疹病毒生物學(xué)特征貓皰疹病毒(Feline herpesvirus，F(xiàn)HV)屬于皰疹病毒科、甲型皰疹病毒亞科的成員，病毒核酸為有囊膜、雙鏈DNA，直徑為128～168 nm;可引起的貓的急性和高度接觸性的上呼吸道感染［14］;病原的組織嗜性廣，不僅侵害呼吸系統(tǒng)，還侵害神經(jīng)系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、胚胎等。病毒在患病貓的舌、鼻、結(jié)膜、咽喉、氣管、支氣管等部位增殖，發(fā)病率可達(dá)到100%，死亡率可達(dá)到50%;目前國內(nèi)沒有專門的貓皰疹病毒等貓易感病毒臨床檢測(cè)的機(jī)構(gòu)，對(duì)于實(shí)驗(yàn)用貓未見有開展FHV-Ⅰ檢測(cè)的報(bào)道;FHV-Ⅰ感染所致疾病與貓杯狀病毒、貓細(xì)小病毒引起呼吸道感染和貓肺炎在臨床上很難區(qū)分［15-16］，需利用實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行鑒別診斷。

3．2 貓皰疹病毒的診斷貓皰疹病毒I型的檢測(cè)主要是采用病毒的分離鑒定、組織學(xué)檢查、免疫熒光等方法［17］，國外已有人建立了針對(duì)FHV-1的PCR檢測(cè)技術(shù)［18-19］，國內(nèi)數(shù)人也都建立了PCR檢測(cè)方法。劉寶山建立FHV-Ⅰ型PCR方法，擴(kuò)增序列與GenBank上序列同源性達(dá)到100%，特異性高、靈敏度高，可以從103個(gè)拷貝的樣品中檢測(cè)出FHV-Ⅰ型，臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明，與間接免疫熒光的陽性符合率可達(dá)95．8%［20］。林穎設(shè)計(jì)FHV-Ⅰ型gD基因的引物，建立了PCR診斷方法，可從含有103個(gè)拷貝的樣品中檢測(cè)出FHV-Ⅰ，靈敏性高;特異性強(qiáng)，僅能擴(kuò)增出貓三聯(lián)弱毒苗［21］。屈哲設(shè)計(jì)針對(duì)TK基因的引物，PCR產(chǎn)物與GenBank基因部分序列同源性達(dá)到100%，建立的PCR檢測(cè)方法的敏感性試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出的最低DNA量約為300 pg［22］。王吉建立的PCR方法靈敏性高，可檢測(cè)FHV-Ⅰ最小滴度為7 lg TCID50/mL，相應(yīng)的DNA模板濃度為1．46×102拷貝/mL，在15份貓臨床樣本中檢出10份FHV-Ⅰ陽性，適合于臨床對(duì)該病的感染檢測(cè)［23］。李林翔建立虎源FHV-Ⅰ巢式PCR的快速鑒定方法，可以特異擴(kuò)增出FHV-Ⅰ的gD基因片段，檢測(cè)極限是1×102copies/μL，敏感性明顯高于一步法PCR，對(duì)疑似FHV-1的樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與病毒分離鑒定一致［24］。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不僅可以提高檢測(cè)的特異性與準(zhǔn)確性，還可以對(duì)病毒核酸進(jìn)行定量分析。王吉建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)貓F(tuán)HV-Ⅰ核酸的定量檢測(cè)分析，線性范圍1×102－1 ×109copies/μL。檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10copies/μL。批內(nèi)變異系數(shù)均小于5%，且適合于臨床FHV-Ⅰ的快速定量檢測(cè)［25］。劉健建立的FHV-Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法可特異地檢測(cè)出FHV-Ⅰ的DNA，敏感性達(dá)到75 fu/μL，反應(yīng)效率達(dá)到107%，R2值為0．9 965，Ct值的變異系數(shù)低于2%，應(yīng)用該方法對(duì)上海地區(qū)寵物門診送檢的疑似FHV-Ⅰ感染的樣品進(jìn)行檢測(cè)，其陽性率達(dá)到27．78%，高于普通PCR的15．87%［26］。

4 結(jié)語

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)貓細(xì)小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒這3種病毒的認(rèn)識(shí)越來越深刻，在基因組和分子生物學(xué)功能等方面取得較大進(jìn)展，貓細(xì)小病毒、貓杯狀病毒、貓皰疹病毒作為貓的重要傳染病原，嚴(yán)重威脅貓科動(dòng)物的養(yǎng)殖，至今尚無特效藥物和有效的治療辦法控制其發(fā)生和復(fù)發(fā)，在診斷和預(yù)防方面還需要進(jìn)一步建立準(zhǔn)確、簡便、快速的方法;傳統(tǒng)疫苗在病毒防制過程中起到重要的作用，大多數(shù)尚處于實(shí)驗(yàn)研究階段，免疫原性差，迫切地需要制備高效、穩(wěn)定、無毒副作用的新型疫苗，因此研制開發(fā)新型、安全、高效的疫苗具有很好的應(yīng)用前景。

［1］Harrison T M，Mazet J K，Holekamp K E，et al．Antibodies tocanine and feline viruses in spotted hyenas(Crocuta crocuta)in the Masai Mara National Reserve［J］．J Wildl Dis，2004，40(1):1-10．

［2］李爽．貓細(xì)小病毒分離鑒定與基因組序列分析及VP2基因的原核表達(dá)［D］．長春:吉林大學(xué)，2008．

［3］王翀，劉大飛，劉春國，等．同時(shí)檢測(cè)貓細(xì)小病毒、杯狀病毒、皰疹病毒1型多重PCR方法的建立［J］．中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，36(1):31-33．

［4］王吉，付瑞，衛(wèi)禮，等．貓細(xì)小病毒PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2015，32(1):1-6．

［5］邱杰，溫肖會(huì)，翟少倫，等．貓泛白細(xì)胞減少癥病毒VP2基因快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］．中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2015，23 (2):21-25．

［6］喬軍，孟慶齡，夏咸柱．用PCR法檢測(cè)東北虎感染貓細(xì)小病毒的研究［J］．畜牧與獸醫(yī)，2001，33(5):14-16．

［7］洪健，周雪平．ICTV第八次報(bào)告的最新病毒分類系統(tǒng)［J］．中國病毒學(xué)，2006，21(1):84-96．

［8］黃倩倩．貓杯狀病毒FB-NJ-13株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究［D］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2015．

［9］鄭翠玲，向華，宣華，等．貓杯狀病毒全基因組的克隆及序列分析［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2010，37(3):109-111．

［10］劉曄，馮譽(yù)齡，張守峰，等．貓杯狀病毒自然弱毒株的分離鑒定及對(duì)貓的免疫試驗(yàn)［J］．中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29 (4):426-429．

［11］Mohamed M，Abd-Eldaim，Rebecca P，et al．Development and validation of a TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection of Feline calicivirus［J］．Archives of Virology，2009，154(4):555-560．

［12］姜雪．貓杯狀病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［D］．長春:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013．

［13］Chris Helps，Philippa Lait，Séverine Tasker，et al．Melting curve analysis of Feline calicivirus isolates detected by real-time reverse transcription PCR［J］．Journal of Virological Methods，2002，106 (2):241-244．

［14］Henzel A，Brum M C，Lautert C，et al．Isolation and identification of feline calicivirus and feline herpesvirus in Southern Brazil［J］．Braz J Microbiol，2012，43(2):560-568．

［15］Courkow N，Lawon J H，Hamon S C，et al．Descriptive epidemiology of upper respiratory disease and associated risk factors in cats in an animal shelter in coastal Western Canada［J］．Can Vet J，2013，54:132-138．

［16］Burns R E，Wagner D C，Leutenegger C M，et al．Histologic and molecular correlation in shelter cats with acute upper respiratory infection［J］．J Clin Microbiol，2011，49(7):2454-2460．

［17］Maggs D J．Update on pathogenesis diagnosis and treatment of feline herpesvirus type I［J］．Clin Tech Small Anim Pract，2005，20 (2):94-101．

［18］Marsilio F，DiMB，DiFC．Use of a dup lex-PCR assay to screen for Feline Herpsvirus-I and Chlamydophila spp．in mucosal swabs from cats［J］．New Microbiol，2004，27(3):287-292．

［19］Maggs D J，Clarke H E．Relative sensitivity of polymerase chain reaction assays used for detection of feline herpesvirus type I DNA in clinical samples and commercial vaccines［J］．AM J Vet Res，2005，66(9):1550-1551．

［20］劉寶山，林穎，尹榮煥．貓皰疹病毒1型PCR檢測(cè)方法的建立［J］．畜牧與獸醫(yī)，2010，42(1):74-76．

［21］林穎，劉寶山，任會(huì)軍，等．貓傳染性鼻氣管炎PCR檢測(cè)方法的建立［J］．現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2010，8:71-73．

［22］屈哲，徐鑌蕊，雎艷平，等．貓病毒性鼻氣管炎PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］．中國獸醫(yī)雜志，011，47(5):25-26．

［23］王吉，付瑞，衛(wèi)禮．貓皰疹病毒I型PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］．中國病毒病雜志，2014，4(3):192-197．

［24］李林翔，韋增暉，張曉明，等．虎源傳染性鼻氣管炎病毒巢式PCR檢測(cè)方法的建立［J］．野生動(dòng)物學(xué)報(bào)，2015，36 (4):369-372．

［25］王吉，衛(wèi)禮，付瑞．貓皰疹病毒I型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2014，24 (12):47-54．

［26］劉健，徐鋒，楊顯超，等．貓傳染性鼻氣管炎病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］．中國畜牧獸醫(yī)，2016，43 (5):1182-1187．

S852．65+9．2

A

0529-6005(2017)01-0072-03

2016-08-15

吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2015209)

杜翔宇(1989-)，碩士生，從事分子病原微生物與分子免疫學(xué)研究，E-mail:dxy1209@163．com

董浩，E-mail:donghao_jlau@163．com