朱秋強，于曙光，柯蘭蘭，潘大仁

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109)

轉(zhuǎn)基因水稻葉片外卷突變體的機理

朱秋強1，于曙光2，柯蘭蘭1，潘大仁1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院，山東青島266109)

以水稻品種明恢86和明恢86轉(zhuǎn)基因水稻正常葉植株為對照組進行研究，對葉片橫截面組織結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，單位面積突變體外卷葉片的上表皮泡狀細胞數(shù)量增加，推測外卷是由于泡狀細胞數(shù)量增加引起的.遺傳分析結(jié)果顯示，該卷葉突變性狀是由隱性單基因突變引起的.外源基因在卷葉突變體中為單拷貝，并且外源基因與卷葉性狀共分離，說明卷葉性狀是T-DNA插入引起的.T-DNA插入位點分析結(jié)果顯示插入位點位于水稻第9號染色體長臂上的非基因區(qū)，是一個新的與水稻卷葉相關(guān)的突變位點.

卷葉突變體；泡狀細胞；遺傳分析；基因定位

水稻是最主要的糧食作物之一，尤其在中國這樣的人口大國，在耕地有限的情況下，穩(wěn)定和提高水稻單產(chǎn)就成為提高水稻產(chǎn)量最有效的途徑之一，而改良水稻株型對提高水稻單產(chǎn)具有重要意義.水稻葉片的直立性和葉片的適度卷曲是水稻理想株型的重要因素，葉片的適度內(nèi)卷能使葉片保持直立不披垂，從而減少葉片之間的互相遮擋，改善水稻群體的受光狀況.近年來，越來越多的科學(xué)家開始關(guān)注水稻卷葉性狀，致力于分離卷葉相關(guān)基因和探索水稻卷葉的相關(guān)機制.迄今為止已經(jīng)分離克隆到了13個與水稻卷葉相關(guān)的基因[1－13]，研究表明，卷葉性狀的成因大部分與泡狀細胞的發(fā)育異常相關(guān).NRL1和RL14基因分別編碼纖維素合酶和2GO-Fe(Ⅱ)加氧酶，它們對泡狀細胞的發(fā)育起正調(diào)控作用，這2個基因缺失的突變體導(dǎo)致水稻泡狀細胞的面積變小從而引起水稻葉片內(nèi)卷[3].此外，ACL1基因編碼一個含有保守功能域的未知蛋白，OsZHD1基因編碼一個鋅指結(jié)構(gòu)同源結(jié)構(gòu)域類轉(zhuǎn)錄因子，它們對水稻泡狀細胞的發(fā)育也起到正調(diào)控作用.這2個基因的過表達導(dǎo)致水稻泡狀細胞數(shù)量的增加，從而引起水稻葉片外卷[4，13].SLL1基因編碼一個MYB家族的SHAQKYF類轉(zhuǎn)錄因子，sll1突變體的葉片遠軸面后壁細胞發(fā)育缺陷和遠軸面泡狀細胞異常發(fā)育引起葉片內(nèi)卷[8].Roc5基因負調(diào)控泡狀細胞的形成和發(fā)育，其缺失表達導(dǎo)致上表皮泡狀細胞數(shù)量增多而引起水稻葉片外卷[10].SRL1基因表達一個糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，該基因?qū)λ九轄罴毎陌l(fā)育起到負調(diào)控的作用，當其不表達的時候泡狀細胞的數(shù)量增多[12].可見泡狀細胞的發(fā)育對于水稻葉片的形態(tài)維持具有重要作用.

對泡狀細胞發(fā)育的相關(guān)分子機制的探索是了解水稻卷葉分子機制的一個重要突破口.然而，已經(jīng)克隆到的與水稻卷葉性狀相關(guān)的基因未能形成一個有效的分子網(wǎng)絡(luò)，無法說明水稻泡狀細胞發(fā)育的分子機制.因此，為了了解水稻泡狀細胞發(fā)育的分子機制，需要分離更多的相關(guān)基因以形成完整的分子網(wǎng)絡(luò).本研究以轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定高代中發(fā)現(xiàn)的一個葉片外卷的突變體為材料，探討與卷葉發(fā)育相關(guān)的細胞學(xué)與分子機制.以期為進一步研究和利用水稻卷葉性狀提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為本實驗室保存的轉(zhuǎn)3α-HSD基因水稻穩(wěn)定高代葉片外卷突變體(Rolled)、轉(zhuǎn)3α-HSD基因水稻穩(wěn)定高代正常平展葉植株(Unrolled)和轉(zhuǎn)基因受體水稻品種明恢86植株(WT).外源3α-HSD基因是睪丸酮叢毛單胞菌的關(guān)鍵酶3α-羥類固醇脫氫酶/碳酰基還原酶基因，對環(huán)境污染物中的類固醇化合物有很好的降解作用.該卷葉突變體從第4片葉開始出現(xiàn)卷葉性狀，苗期葉型正常.試驗材料均隔離種植于福建農(nóng)林大學(xué)試驗田內(nèi)，按常規(guī)方法進行田間管理.樣品采集時間為出現(xiàn)卷葉性狀的苗期末期與分蘗期初期之間.

1.2 水稻葉片石臘切片的組織觀察

分別取WT、Unrolled和Rolled 3個材料的苗期第4或第5片葉片進行石蠟切片分析.首先把剪下來的葉片剪成約1 cm的小段，置于預(yù)先準備好的固定液中，放置12 h以上；然后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色和中性樹膠封片等操作，用顯微鏡觀察水稻葉片橫截面切片.

1.3 外源基因拷貝數(shù)的分析

采用實時熒光定量PCR法確定轉(zhuǎn)基因水稻外源基因的拷貝數(shù)[14].引物用Primer Premier 5.0設(shè)計，由上海生物工程有限公司合成.實時熒光定量PCR采用的引物為SPS-F:TTGCGCCTGAACGGATAT.SPS-R: CGGTTGATCTTTTCGGGATG.HSD-F:CAGCCGTCGTCATCTCGTCC.HSD-R:CCCGCATAGGCCAGATTTCC.定量PCR體系為SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL，上下游引物各0.4 μL，無菌蒸餾水7.2 μL，模板2 μL，總體積20 μL.PCR反應(yīng)程序:預(yù)變性95℃，10 s(循環(huán)數(shù)1).PCR反應(yīng):95℃，10 s；65℃，20 s.退火過程中檢測熒光值，進行40個循環(huán).

1.4 T-DNA與突變性狀的共分離分析

采用篩選顯性純合株的方法觀察后代葉片表型，分別對100株自交后代進行葉片形態(tài)觀察，后代均未出現(xiàn)卷葉突變體親本的為顯性純合株.經(jīng)過篩選獲得10株顯性純合株，另隨機選取20株卷葉植株，提取葉片DNA.T-DNA里包含3α-HSD基因，以3α-HSD基因序列設(shè)計引物進行PCR，驗證顯性純合株和隱性純合株中是否含有T-DNA.

1.5 T-DNA插入位點的分析

本試驗采用TAIL-PCR法擴增T-DNA側(cè)翼序列，然后通過數(shù)據(jù)庫比對確定T-DNA在水稻基因組中的插入位點.首先用3條嵌套的特異引物分別和簡并引物組合，以Rolled的葉片基因組DNA為模板進行TAIL-PCR，從而確定外源T-DNA插入位點.常見的基因定位包括分子標記法和QTL分析等[15－18]，本研究的材料為轉(zhuǎn)基因突變體，所以采用TAIL-PCR法.本研究轉(zhuǎn)基因水稻所用的3α-HSD基因表達載體為以pBR322質(zhì)粒載體構(gòu)建的pBRHSD表達載體，由本研究室保存.根據(jù)表達載體序列設(shè)計T-DNA兩端的3對特異引物，進行側(cè)翼序列的TAIL-PCR擴增，所涉及的引物見表1.

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻葉片的形態(tài)觀察

觀察不同生長期不同水稻材料間葉片和株型的差異情況.從圖1可以看出正常水稻葉片是平展的，而卷葉突變體的葉片明顯向外卷曲呈半筒狀.

表1 TAIL-PCR引物Table 1 Primers of TAIL-PCR

2.2 水稻葉片橫截面結(jié)構(gòu)的差異

于苗期選取幼嫩的葉片進行石蠟切片分析，結(jié)果見圖2.從圖2可以看出，卷葉突變體的上皮層小側(cè)脈旁的泡狀細胞數(shù)目明顯多于正常葉片的上皮層小側(cè)脈旁的泡狀細胞.上皮層泡狀細胞是水稻葉片在不缺水時保持葉片平展的重要組織結(jié)構(gòu)，而過多的上皮層泡狀細胞則會導(dǎo)致葉片向反軸面卷曲，即葉片外卷.

2.3 卷葉性狀的遺傳性

以Rolled和WT互為父本和母本進行雜交獲得F1代植株，記為Rolled/WT和WT/Rolled.葉片形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株均為平展葉片，沒有出現(xiàn)卷葉性狀.F1代自交得到F2代，觀察F2代的葉片形態(tài)，其分離情況見表2.

表2 F1性狀表現(xiàn)及F2群體分離情況Table 2 Phenotypic expression of F1and segregation status of F2population

從表2可以看出，2個雜交組合Rolled/WT和WT/Rolled的F1代葉型均為平展葉，Rolled/WT和WT/ Rolled的F2代群體葉型為平展葉.卷葉的數(shù)量比分別為266∶86和292∶92，按1對等位基因的分離模式進行3∶1擬合卡方檢驗，Rolled/WT和WT/Rolled的X2(3∶1)分別為0.854和0.680，均小于(3.841)，符合3∶1的孟德爾的單基因遺傳分離規(guī)律.由此可見，該外卷性狀是隱性單基因突變引起的.

2.4 外源基因拷貝數(shù)的確定

由于蔗糖磷酸合成酶基因SPS在水稻基因組中為單拷貝，所以選擇蔗糖磷酸合成酶基因SPS為對照基因檢測外源3α-HSD基因在轉(zhuǎn)基因后代中的拷貝數(shù).3α-HSD基因和SPS基因的標準曲線如圖3所示.3α-HSD基因的標準曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.992 7，相關(guān)性高，所以3α-HSD基因Ct值與起始模板數(shù)(HSD0)之間的相關(guān)性方程為:HSD0＝10(－0.1424Ct＋4.39).SPS基因的標準曲線相關(guān)系數(shù)R2＝0.997 9，相關(guān)性高，所以SPS基因的Ct值與起始模板數(shù)(SPS0)之間的相關(guān)性方程為:SPS0＝10(－0.2738Ct＋7.82).

WT的3α-HSD基因的Ct值是24.84，SPS基因的Ct值是27.31，Rolled3α-HSD基因的Ct值是26.18，SPS基因的Ct值是27.25.由方程HSD0＝10(－0.141Ct＋4.3501)計算出樣品3α-HSD基因的起始模板數(shù)，由方程SPS0＝10(－0.274Ct＋7.9246)計算出樣品SPS基因的起始模板數(shù).計算得到的結(jié)果為:WT的HSD0＝20 195，SPS0＝80 139；Rolled的HSD0＝47 953，SPS0＝40 162.水稻內(nèi)參基因SPS是純合二倍體，本試驗的轉(zhuǎn)基因植株也是經(jīng)過篩選得到的卷葉突變純合株，所以3α-HSD基因也是純合二倍體.根據(jù)Ding的實時熒光定量PCR法確定轉(zhuǎn)基因水稻外源基因拷貝數(shù)，計算結(jié)果表明，WT中3α-HSD基因的HSD0/SPS0為0.252，拷貝數(shù)為0；Rolled中3α-HSD基因的HSD0/SPS0為1.194，拷貝數(shù)為1，即為單拷貝.

2.5 T-DNA與卷葉性狀的共分離檢測

遺傳分析結(jié)果表明，卷葉性狀是隱性單基因突變引起的，選取WT和Rolled的雜交后代F2代為研究材料，觀察卷葉性狀與3α-HSD基因的共分離情況.由于卷葉性狀是隱性單基因突變引起的，所以F2代中的平展葉植株中有雜合株的存在，需要先把F2代中的顯性純合株分離出來，最終分離得到10株顯性純合株.對顯性純合株和隱性純合株進行3α-HSD基因的PCR驗證.從圖4可以看出，顯性純合株都沒有TDNA，而隱性純合株都有T-DNA，由此可以推斷T-DNA與卷葉性狀共分離.

2.6 外源基因插入位點的確定

外源T-DNA插入位點分析結(jié)果表明:以T-DNA右邊界終止子nos序列設(shè)計的特異引物與簡并引物的引物組合在3輪PCR之后沒有獲得條帶；而以T-DNA左邊界hpt基因序列設(shè)計的特異引物與簡并引物的引物組合經(jīng)過3輪PCR，hpt/AD2-1引物對獲得1條500 bp左右的DNA條帶，hpt/AD3引物對獲得1條300 bp左右的DNA條帶，結(jié)果見圖5.回收條帶后，先用軟件DNAMAN進行比對，確認回收的DNA片段為T-DNA的側(cè)翼序列.比對結(jié)果顯示2個回收DNA條帶中只有hpt/AD3引物對獲得的300 bp左右的DNA條帶是T-DNA的側(cè)翼序列，而hpt/AD2-1引物對獲得的500 bp左右的DNA條帶不能與T-DNA末端序列配對，推測該擴增DNA條帶是簡并引物AD2-1自身配對擴增獲得的非特異性條帶.hpt/AD3引物對獲得的300 bp左右的DNA條帶采用NCBI的Blastn程序進行比對，結(jié)果顯示該DNA片段與水稻9號染色體上的序列匹配率高達99%.進一步檢索分析發(fā)現(xiàn)，T-DNA插入位點位于水稻9號染色體長臂上的7 504 113 bp處，處于非基因區(qū).

T-DNA插入位點前后100 kb以內(nèi)共有7個基因，其中上游基因為Os09g0292900，下游6個基因，距離插入位點最近的基因是下游的Os09g0293400，這些基因的功能均未知.經(jīng)過同源性比對分析這些功能未知的基因，基因功能的預(yù)測結(jié)果如表3所示.

表3 T-DNA插入位點附近基因的功能預(yù)測Table 3 Prediction on function of genes near the insertion site of T-DNA

3 討論

本研究以轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定高代中發(fā)現(xiàn)的葉片外卷突變體植株為材料，以水稻栽培品種明恢86和明恢86轉(zhuǎn)基因水稻正常葉植株為對照組，進行了葉片橫截面石蠟切片觀察、卷葉性狀遺傳分析和外源T-DNA插入位點確定等研究.結(jié)果表明，突變體外卷葉片的上表皮泡狀細胞數(shù)量增加造成葉片外卷；卷葉突變性狀是由隱性單基因突變引起的；外源基因在卷葉突變體中為單拷貝，并與卷葉性狀共分離；通過T-DNA插入位點分析，發(fā)現(xiàn)了一個新的與水稻卷葉相關(guān)的突變位點.

外源基因3α-HSD在卷葉突變體中的拷貝數(shù)為單拷貝，外源基因3α-HSD和卷葉性狀共分離，外源TDNA插入位點位于水稻9號染色體長臂上的7 504 113 bp處，處于非基因區(qū).外源基因為單拷貝且和卷葉性狀共分離，說明卷葉突變是外源基因插入引起的.目前已發(fā)現(xiàn)的與水稻卷葉性狀相關(guān)的基因分布于不同的水稻染色體上，其中定位在水稻9號染色體上的基因有3個.Zhang et al[8]發(fā)現(xiàn)一個控制水稻卷葉性狀的隱性基因sll1-1，并將其定位于第9號染色體長臂上.sll1-1基因的缺失導(dǎo)致突變體水稻葉片的遠軸面也出現(xiàn)了泡狀細胞，從而導(dǎo)致水稻葉片內(nèi)卷.Luo et al[11]也在一個內(nèi)卷水稻突變體中發(fā)現(xiàn)一個可能與水稻卷葉相關(guān)的基因RL10(t)，并將其定位在9號染色體長臂上.Yan et al[7]發(fā)現(xiàn)一個葉片完全內(nèi)卷和小穗畸形的水稻突變體，通過圖位克隆得到一個位于9號染色體上的與卷葉相關(guān)的RL9基因.這3個基因分別定位在9號染色體上的不同的位點上，sll1-1基因位于9號染色體長臂11 Mbp處，RL10(t)基因位于9號染色體長臂13 Mbp處，RL9基因位于9號染色體16 Mbp處，而本研究中發(fā)現(xiàn)的突變位點位于9號染色體長臂7.5 Mbp處，且距離較遠，基本可以排除與本研究突變位點共分離的可能性.因此可以推斷，本研究發(fā)現(xiàn)的與水稻卷葉相關(guān)的基因是一個新的與水稻外卷性狀相關(guān)的突變位點.另外，已知的3個定位于9號染色體上的基因突變都造成水稻葉片內(nèi)卷，而本研究中的突變體為葉片外卷.新的與水稻外卷性狀相關(guān)的突變位點的發(fā)現(xiàn)為進一步探究水稻卷葉性狀的相關(guān)分子機制提供了新的證據(jù).

本研究通過對轉(zhuǎn)基因水稻后代卷葉突變體的研究發(fā)現(xiàn)該突變體的卷葉性狀是由于T-DNA的插入導(dǎo)致1對隱性基因發(fā)生突變，進而造成泡狀細胞發(fā)育異常，最終導(dǎo)致水稻葉片外卷.T-DNA插入位點位于水稻第9號染色體的長臂上7.5 Mbp處的非基因區(qū)，通過對插入位點附近的基因進行分析得到與水稻泡狀細胞發(fā)育相關(guān)的候選基因.

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(責任編輯:葉濟蓉)

Preliminary investigation on outward rolled leaf mutant of transgenic rice

ZHU Qiuqiang1，YU Shuguang2，KE Lanlan1，PAN Daren1
(1.College of Life Sciences，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China；2.College of Chemistry and Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109，China)

Outward rolling leaf is likely to improve light interception rate of rice.To investigate cytology and molecular mechanism of this trait，mutant plants 3α-HSD with stable traits of outward rolling leaf were used as the experimental group，with cultivated variety MH 86 and transgenic plants with flat leaves used as the control.Microscopic observation on cross section of leaves indicated that rolled leaf of mutant plants was caused by an increased number of bulliform cells.Genetic analysis showed that outward rolling leaf was attributed to the mutation of single recessive genes.This exogenous gene was a single copy in rolled leaf mutant，and co-segregated with rolled leaf trait，indicating that rolled leaf trait was likely caused by T-DNA insertion.Furthermore，analysis of T-DNA insertion site showed that this insertion located in the non-coding region in long arm of chromosome 9，which was a new mutation site related to the mechanism of this trait，related to rice leaf rolling.

bulliform cell；curled leaf mutant；genetic analysis；TAIL-PCR

Q946

:A

:1671-5470(2016)06-0655-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.06.008

2016－06－20

:2016－08－21

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項資助項目(2008zx08009-003).

朱秋強(1986－)，男，博士研究生.研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué).Email:181426249＠qq.com.通訊作者潘大仁(1949－)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向:生物技術(shù).Email:pdr8598＠163.com.