周慧芳 洪 敏 王夢(mèng)甜 單佳雯 吳建宇 楊立偉 何徐軍

聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的滅活作用研究

周慧芳 洪 敏 王夢(mèng)甜 單佳雯 吳建宇 楊立偉 何徐軍

目的探尋聚維酮碘溶液快速滅活子宮內(nèi)膜細(xì)胞的最佳有效濃度和作用時(shí)間，并對(duì)聚維酮碘溶液誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行研究。方法不同濃度（0.1％～2.0％）、不同時(shí)間（15～90s）的聚維酮碘溶液作用原代培養(yǎng)子宮內(nèi)膜細(xì)胞，采用MTT染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的滅活作用，Hoechst33342染色實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞促凋亡作用。結(jié)果聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有明顯的滅活作用，呈濃度依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)，且隨著聚維酮碘溶液濃度的增加，子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論聚維酮碘溶液可有效滅活子宮內(nèi)膜細(xì)胞，對(duì)預(yù)防腹壁子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生有著重要的臨床應(yīng)用意義。

聚維酮碘腹壁子宮內(nèi)膜異位癥子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡

子宮內(nèi)膜異位癥是指具有生長(zhǎng)活力的子宮內(nèi)膜組織在子宮腔以外部位異常生長(zhǎng)。子宮內(nèi)膜異位癥常見(jiàn)于育齡婦女,其發(fā)病機(jī)制尚未闡明，Luciano等[1]提出種植理論,認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥是由經(jīng)期返流的內(nèi)膜細(xì)胞從輸卵管逃逸后在盆腔周?chē)M織種植后形成。腹壁子宮內(nèi)膜異位癥（abdominalwall endometriosis，AWE）是指發(fā)生于腹膜表面的異位內(nèi)膜病灶[2-4]。目前，除了規(guī)范剖宮產(chǎn)技術(shù)，用常溫0.9％氯化鈉溶液反復(fù)沖洗切口是預(yù)防AWE最常用的方法，但剖宮產(chǎn)術(shù)后AWE的發(fā)生還是呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)[5-6]。聚乙烯吡咯烷酮和碘絡(luò)合形成的聚維酮碘是一種臨床常用的廣譜消毒劑[7-9]。本研究利用聚維酮碘溶液不同濃度和浸泡時(shí)間對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行滅活處理，以期能找到聚維酮碘快速滅活子宮內(nèi)膜細(xì)胞的最佳有效濃度和作用時(shí)間，并對(duì)聚維酮碘溶液誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡作用進(jìn)行研究。

1 材料和方法

1.1 材料聚維酮碘溶液購(gòu)自上海運(yùn)佳黃浦制藥有限公司；MTT[3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]、Hoechst33342染色液購(gòu)自江蘇碧云天生物科技有限公司；AnnexinⅤ/PI凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。

原代培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞均取自本院產(chǎn)科的擇期剖宮產(chǎn)術(shù)產(chǎn)婦。產(chǎn)婦年齡22～35（27±4.5）歲；足月妊娠、恥骨聯(lián)合上橫切口。剖宮產(chǎn)術(shù)產(chǎn)婦胎盤(pán)娩出后刮取子宮內(nèi)膜，一部分內(nèi)膜組織投入盛有培養(yǎng)液的無(wú)菌瓶中，30min內(nèi)帶回進(jìn)行培養(yǎng)。另一部分內(nèi)膜組織用10％中性甲醛固定后送病理學(xué)檢查，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)為子宮內(nèi)膜者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，不符合者舍棄。實(shí)驗(yàn)室取回的標(biāo)本用D-Hank’s液沖洗3次，剪碎至＜1mm，再置于含0.25％ Trypsin、0.02％膠原酶的消化液中37℃振蕩消化20～30min。加入含20％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，并用Pasteur吸管反復(fù)抽吸、吹打，對(duì)細(xì)胞群進(jìn)行機(jī)械消化。洗滌后，置入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。標(biāo)本留取經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和產(chǎn)婦同意。

1.2 方法

1.2.1 MTT染色檢測(cè)細(xì)胞增殖收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期子宮內(nèi)膜細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，將細(xì)胞以100μl/孔接種于96孔板，使待測(cè)細(xì)胞密度為1×104/孔。5％CO2、37℃孵育24h后，吸出培養(yǎng)液，分別加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚維酮碘溶液100μl，分別作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化鈉溶液作為對(duì)照。每孔加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490nm處測(cè)量各孔的吸光值（OD）。細(xì)胞存活率=（OD藥物作用孔-OD調(diào)零孔）/（OD對(duì)照孔-OD調(diào)零孔）×100％。

1.2.2 Hoechst33342染色觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡對(duì)數(shù)期子宮內(nèi)膜細(xì)胞按3.5×105個(gè)/ml接種至6孔板中，貼壁培養(yǎng)24h后，吸出培養(yǎng)液，分別加入0.1％、0.5％、1.0％、1.5％和2.0％的聚維酮碘溶液100μl，分別作用15、30、45、60和90s，以0.9％氯化鈉溶液作為對(duì)照。加入10μg/ml的Hoechst33342染料。37℃染色30min后熒光倒置顯微鏡觀察，然后置于共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞處理與Hoechst33342染色觀察腫瘤細(xì)胞的凋亡方法相同，參照AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明：收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩遍，用100μl的1× Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入5μl的AnnexinⅤ和1μl的PI，冰上避光15min后，加入400μl 1×Binding Buffer，采用流式細(xì)胞儀分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)圖1為子宮內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)，細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好，呈梭形，證明本研究細(xì)胞培養(yǎng)成功。

圖1 子宮內(nèi)膜細(xì)胞形態(tài)圖

2.2 不同濃度及時(shí)間梯度下聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的抑制作用采用不同濃度的聚維酮碘溶液處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞后，MTT實(shí)驗(yàn)表明，聚維酮碘對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，呈濃度依賴(lài)和時(shí)間依賴(lài)（P＜0.05）。2.0％聚維酮碘溶液的抑制率最高，當(dāng)作用時(shí)間分別為15、30、45、60和90s時(shí)，細(xì)胞存活率僅為（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，見(jiàn)圖2。

圖2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)子宮內(nèi)膜細(xì)胞存活率

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化采用不同濃度聚維酮碘溶液處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞15s后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，細(xì)胞皺縮、細(xì)胞膜出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象。用Hoechst33342染色子宮內(nèi)膜細(xì)胞，細(xì)胞凋亡效應(yīng)明顯。對(duì)照組染色質(zhì)均勻，無(wú)濃縮、邊集現(xiàn)象，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核染色均一，無(wú)明顯亮藍(lán)色；而不同濃度聚維酮碘溶液處理組細(xì)胞核染色質(zhì)明顯凝集、固縮，并有核碎裂出現(xiàn)凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)致密濃染或者碎塊狀致密濃染，見(jiàn)圖3（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率采用不同濃度聚維酮碘溶液處理子宮內(nèi)膜細(xì)胞15s后，收集細(xì)胞，經(jīng)AnnexinⅤ/PI雙染后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。在AnnexinⅤ高染而PI低染區(qū)域的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，在AnnexinⅤ與PI高染區(qū)域的細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著聚維酮碘溶液濃度的增加，子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4-5。

圖4 不同濃度聚維酮碘溶液處理后細(xì)胞凋亡率變化（a:對(duì)照組；b～f：分別表示經(jīng)0.1％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％聚維酮碘溶液處理的劑量組）

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

AWE是一種特殊類(lèi)型的盆腔外子宮內(nèi)膜異位癥，雖為一種良性病變，但具有類(lèi)似惡性腫瘤的生物學(xué)特征，如局部侵犯、遠(yuǎn)處播散、易復(fù)發(fā)等[2，10-11]，表現(xiàn)為周期性腹壁切口增大的包塊和經(jīng)期腹壁切口疼痛，嚴(yán)重影響患者的健康和生活質(zhì)量。趙學(xué)英等[12]研究認(rèn)為醫(yī)源性子宮內(nèi)膜種植是引起AWE的直接原因，剖宮產(chǎn)術(shù)中胎兒胎盤(pán)的娩出、子宮內(nèi)膜的大量組織碎片散落并遺留在腹壁切口上，使子宮內(nèi)膜基質(zhì)層有更多的醫(yī)源性機(jī)會(huì)黏附在腹壁切口上，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的種植。因此，剖宮產(chǎn)術(shù)中采取有效的措施避免子宮內(nèi)膜組織散落和遺留在腹壁切口是預(yù)防本病的關(guān)鍵。目前，剖宮產(chǎn)術(shù)后AWE的發(fā)生還是呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此，尋找一種便捷、有效、安全的沖洗方法以清除遺留在手術(shù)切口的子宮內(nèi)膜組織，控制醫(yī)源性子宮內(nèi)膜種植，對(duì)預(yù)防AWE的發(fā)生有著重要的意義。

聚維酮碘是目前臨床上常用的一種化學(xué)消毒劑。有研究報(bào)道聚維酮碘對(duì)預(yù)防腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移有一定的效果[8，13]，黃惠等[14]研究發(fā)現(xiàn)聚維酮碘對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制效果,李俊等[15]研究了聚維酮碘對(duì)人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的影響。對(duì)于聚維酮碘對(duì)細(xì)胞的殺傷機(jī)制，有研究證明“游離碘”可在短時(shí)間內(nèi)對(duì)有機(jī)體內(nèi)細(xì)胞蛋白產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的凝固作用[16]。本研究結(jié)果表明，2.0％聚維酮碘溶液抑制子宮內(nèi)膜細(xì)胞效率最高，當(dāng)作用時(shí)間分別為15、30、45、60和90s時(shí)，細(xì)胞存活率僅為（4.0±1.3）％、（3.2±1.5）％、（1.9±1.8）％、（1.3±2.2）％和（0.2±1.1）％，考慮到聚維酮碘溶液沖洗切口的便利性，以2.0％濃度、15s作用時(shí)間的聚維酮碘溶液對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的抑制最高，為最佳實(shí)驗(yàn)條件。

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ObjectiveTo investigate the effec t of povidone-iodine at different concentration on the grow th of human endometrial cells.MethodsPrimary cultured endometrial cells were treated w ith d ifferent concentrations(0.1％-2.0％)of povidone-iod ine atdifferent time(15-90s),respectively.The viability,morphologicalchanges,and apop tosis ofendometrialcells were assessed by MTT assay,Hoechst33342 staining,and Annexin V/PI flow cytometry,respec tively.ResultsThe results indicated thatpovidone-iod ine remarkab ly inhibited endometrialcells g row th ata dose-dependentand time-dependentmanner (P＜0.05).ConclusionPovidone-iod ine solution can effec tively inactivate endometrial cells,which may potential c linicaluse in p revention ofendometriosis.

Povidone-iod ine Abdom inalwallendometriosis Endometrialcells Apop tosis

2016-08-14）

（本文編輯：陳麗）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(2014KYB033)

310014杭州，浙江省人民醫(yī)院手術(shù)室（周慧芳、洪敏、王夢(mèng)甜、單佳雯），病理科（吳建宇），婦產(chǎn)科（楊立偉），臨床醫(yī)學(xué)研究所（何徐軍）

周慧芳，E-mail：zhouhuifang818@126.com