王紅霞+李洪雷+郝建梅+丁謙+張一卉+王鳳德+鄧永林+王均邦+何啟偉+李景娟+高建偉

摘 要：玻利瑪細胞質雄性不育（Pol CMS）是目前很有利用價值的胞質雄性不育源。在前期的研究中，我們利用柯桂蘭提供的大白菜Pol CMS不育源為母本，以大白菜骨干親本92-09為輪回親本，培育出大白菜Pol CMS不育系92-09A。本研究對大白菜Pol CMS不育系92-09A及其保持系92-09、恢復系早28的形態(tài)特征進行觀察，并對相應的不育基因Braraorf224及其恢復基因BraraPPR進行了克隆及生物信息學分析。結果表明，大白菜Pol CMS不育系92-09A的花瓣、萼片和雌雄蕊都比保持系92-09小，不能形成有活力的成熟花粉粒；其保持系和雜種F1（不育系92-09A×恢復系早28）均可以產生有活力的花粉粒。大白菜Pol CMS不育基因Braraorf224及恢復基因BraraPPR與甘藍型油菜的Pol CMS不育基因及恢復基因同源性很高。qRT-PCR結果顯示，BraraPPR在恢復系早28和雜種F1中的表達量均明顯高于雄性不育系92-09A。本研究可為進一步揭示大白菜Pol CMS雄性不育機理奠定基礎。

關鍵詞：大白菜；Pol CMS；不育基因；恢復基因

中圖分類號：S634.1+Q78文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2016）12-0006-10

Abstract Polima cytoplasmic male sterile （Pol CMS） is a very important CMS source in plant breeding. In the previous study， we used Pol CMS line KG-Pol of Chinese cabbage provided by Professor Ke Guilan as female parent and core line 92-09 as recurrent parent to breed Pol CMS line 92-09A of Chinese cabbage. Here， the morphological characteristics of Chinese cabbage Pol CMS line 92-09A， its parental maintainer line 92-09 and restorer line Zao 28 were investigated， and the Pol CMS gene Braraorf224 and its restorer gene BraraPPR were cloned and analyzed. The results showed that the petals， sepals， stamens and pistils of Chinese cabbage Pol CMS line 92-09A were all smaller than those of its maintainer line 92-09， and it could not form mature pollen with viability. While the maintainer line 92-09 and the F1 hybrid of Pol CMS line 92-09A×restorer line Zao 28 both had pollen grains with viability. Bioinformatics analysis indicated that the nucleic acids and amino acids of Chinese cabbage Pol CMS gene Braraorf224 and restorer gene BraraPPR were very close to those of Brassica napus.The results of qRT-PCR showed that the expression level of BraraPPR in restorer line Zao 28 and F1 hybrid were both higher than that in Pol CMS line 92-09A. The research would be helpful to understand the molecular mechanism of Pol CMS of Chinese cabbage in the future.

Keywords Chinese cabbage （Brassica rapa L. ssp. pekinensis）； Polima cytoplasmic male sterile （Pol CMS）； Male-sterile gene； Restorer gene

大白菜起源于中國，是我國的特產蔬菜。山東是大白菜的重要起源地之一，有豐富的種質資源，純系間雜交往往表現(xiàn)出極強的雜種優(yōu)勢。大白菜雜種優(yōu)勢利用是靠一代雜種實現(xiàn)的。利用雄性不育系生產一代雜種是最理想的制種技術之一[1]。

大白菜雄性不育主要包括核基因雄性不育和核質互作雄性不育。由于使用核不育系配制的商品種子實際上是三交種，所以核不育系在生產中應用的難度較大。目前報道的大白菜核質互作雄性不育源主要來自于甘藍型油菜玻利瑪（Polima）細胞質雄性不育（Pol CMS）和蘿卜Ogura細胞質雄性不育（Ogura CMS）材料。甘藍型油菜Polima雄性不育源的發(fā)現(xiàn)大大促進了大白菜優(yōu)勢育種的發(fā)展[1，2]。

1972年，傅廷棟等[3]發(fā)現(xiàn)油菜Pol CMS雄性不育株，隨后利用Pol CMS實現(xiàn)了三系配套，培育出優(yōu)良油菜品種華雜2號、湘雜8號及華雜3號。此后，Pol CMS被傳至歐美等國，培育出多個油菜雜交種。1985-1994 年， 中、加、澳、印等國共注冊（審定）22 個油菜雜交種， 17個注明不育系來源中， 13個利用玻利瑪雄性不育材料。Pol CMS成為目前很有利用價值的胞質雄性不育源[4]。Polima不育性的利用受到了其它植物育種學家的重視。任成偉等（1992）[5]將油菜Pol CMS 不育材料與小白菜進行種間雜交和回交， 獲得小白菜不育系；向長萍等（2000）[6]用紅菜薹大股子作轉育親本， 轉育Polima雄性不育系， 經4 年6 代選擇， 育成原始不育系。在大白菜育種方面，柯桂蘭等（1992）[7]選育出大白菜Pol CMS不育系，其它大白菜育種工作者也相繼選育出多個Pol CMS不育親本材料[8]。

1994年，我們利用柯桂蘭提供的Pol CMS雄性不育源，選育出大白菜Pol CMS不育系92-09A。本研究擬通過大白菜Pol CMS不育系92-09A的選育、形態(tài)特征觀察，并對其相應的不育基因、恢復基因進行克隆及生物信息學、表達模式分析，為進一步揭示大白菜Pol CMS雄性不育機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料選育與培養(yǎng)

1.1.1 大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的選育 以柯桂蘭饋贈的雄性不育KG-Pol植株為母本，以大白菜骨干親本純系92-09為輪回親本，連續(xù)回交6代，選育獲得大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。92-09即為92-09A的保持系。不育系92-09A與早28產生的一代雜交種（“魯白13號”，又稱“西白1號”）花粉可育，早28即為92-09A的恢復系。

1.1.2 材料培養(yǎng) 取92-09A、保持系、恢復系及92-09A×早28 F1種子，萌發(fā)后4℃低溫春化4周，于3月15日前后移栽至山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所實驗田內，保證其正常開花，于盛花期分別取花和花蕾進行形態(tài)學觀察、花粉活力鑒定及RNA提取。

1.2 花器官形態(tài)觀察及花粉活力鑒定

采用Nikon Eclipse TE2000-S顯微鏡對雄性不育系92-09A、保持系92-09及92-09A×早28 F1的花器官形態(tài)進行觀察，采用亞歷山大染液對花粉活力進行鑒定，方法參考Alexander（1969）[9]。

1.3 基因克隆、生物信息學及表達模式分析

1.3.1 RNA提取和反轉錄 取當天和第二天花瓣展開的Pol CMS不育系92-09A、恢復系早28及92-09A×早28 F1的花和花蕾分別提取總RNA。采用TRNzol-A+試劑盒（天根）進行RNA提取，方法參考說明書。反轉錄按照TaKaRa PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）產品說明書操作。

1.3.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆 以大白菜Pol CMS不育系92-09A總RNA的反轉錄產物為模板，用引物（正向引物：5′-ATGCCTCAACTGGATAAATTCACTT-3′；反向引物5′-TCATCGAAATAGATCGAGGATTT-3′）對Pol CMS雄性不育基因Braraorf224進行全序列PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，36個循環(huán)；72℃ 10 min。

1.3.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR的克隆及表達模式分析 以恢復系早28總RNA的反轉錄產物為模板，用引物（正向引物：5′- ACACGAAATTATCACCAA-3′；反向引物5′- CTGAAACTTTAAGACGGA -3′）對Pol CMS 雄性不育系的恢復基因BraraPPR進行全序列PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）為：2×高保真PCR Mix（天根） 10 μL，上游引物（10 mmol/L）0.5 μL，下游引物（10 mmol/L）0.5 μL，模板cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應程序為：94℃ 3 min； 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 3 min，36個循環(huán)；72℃ 10 min。

Real-time PCR使用TaKaRa公司的SYBR green PCR master mix，儀器為IQ5 Real-Time PCR system （BIO-RAD， Hercules，CA，USA），八聯(lián)管為AXYGEN公司生產，內參基因為Actin2。擴增Actin2的正向引物為5′-AGGAAGGATCTGTACGGTAAC-3′，反向引物為5′-TTCTGTGAACGATTCCTGGAC-3′。擴增BraraPPR的正向引物為5′-CCCCACAGAGGTTTAGTCCC-3′，反向引物為5′-TCACCAACCCTTCCTACCTTACA-3′。熒光定量PCR反應采用兩步法進行： 95℃ 2 min； 95℃ 15 s，60℃ 30 s， 45 個循環(huán)，并在反應結束后制作熔解曲線，檢測是否有引物二聚體生成。

1.3.4 生物信息學分析 利用克隆得到的基因序列在GenBank中進行BLAST檢索，查找Pol CMS雄性不育基因Braraorf224及恢復基因BraraPPR在其它物種中的同源序列。利用DNAMAN 6.0軟件對來自不同物種的Pol CMS雄性不育基因及恢復基因的氨基酸序列進行比對并構建系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 大白菜Pol CMS 雄性不育系92-09A的選育及其形態(tài)特征

2.1.1 大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A及保持系 自1972年被發(fā)現(xiàn)以來，Pol CMS雄性不育源已被廣泛應用于甘藍型油菜三系配套生產制種工作中[2]。1992年，柯桂蘭等將甘藍型油菜Pol CMS雄性不育源應用于大白菜育種中，育成了以Pol CMS為不育源的大白菜核質互作雄性不育系[7]。1994年，我們以柯桂蘭饋贈的大白菜Pol CMS雄性不育KG-Pol植株為母本，以大白菜骨干親本純系92-09為輪回親本進行連續(xù)回交，歷經6年，選育獲得了大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。大白菜骨干親本92-09即為Pol CMS雄性不育系92-09A的保持系。保持系92-09是以亞蔬中心的夏陽為基礎材料經多代自交選育的穩(wěn)定大白菜自交不親和系。

利用親本92-09與另一個骨干親本早28配置組合，獲得了大白菜雜交新品種“魯白13號”（又稱“西白1號”）。由于親本92-09是Pol CMS雄性不育系92-09A的保持系，所以我們利用不育系92-09A×早28大面積生產“魯白13號”一代雜種。一代雜交種（92-09A×早28）長出的植株，花粉可育，因此大白菜親本早28即為Pol CMS雄性不育系92-09A的恢復系。

大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A、保持系92-09外葉深綠、無毛，葉柄綠色，球葉疊抱，葉球綠色，早熟，耐高溫高濕?！棒敯?3號”是山東省審定的第一個夏白菜品種，該品種外葉綠色、無毛，葉柄淺綠，球葉扣抱，葉球淺綠色，耐高溫高濕，山東地區(qū)6月起壟播種，45～50天成熟，品質優(yōu)，口感好，成熟后及時收獲[10]。

2.1.2 大白菜Pol CMS雄性不育系的花器結構特點 圖1是大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A、保持系92-09及雜種F1（92-09A×早28）花器結構、花粉粒形態(tài)的部分圖片。大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的花蕾較保持系92-09小， 但外觀看比較飽滿，無干扁的癥狀。遇低溫及生長弱等不利環(huán)境條件時，會出現(xiàn)敗蕾現(xiàn)象，但是到后期這一現(xiàn)象通過規(guī)范管理可有效地消除?；ㄆ鞔笮》矫?， 不育系92-09A植株的花瓣、萼片、雌雄蕊都比保持系92-09小（圖1A～D）。且保持系92-09的花藥飽滿，花粉充足，具有明顯的散粉現(xiàn)象（圖1A、C）；不育系92-09A雄蕊短小瘦弱，花絲短縮，緊箍在雌蕊基部，花藥錐形，內無花粉（圖1B、D）。保持系92-09、雜種F1（92-09A×早28）可以產生圓形飽滿的花粉粒（圖1F、G）；而不育系92-09A不能形成圓形飽滿有活力的成熟花粉粒（圖1E）。不育系92-09A除花藥不育、花器略微瘦小外，其它器官如子房、蜜腺等功能正常，這為利用胞質雄性不育系從事大規(guī)模制種提供了可能。

2.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆及序列分析

2.2.1 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的克隆 以大白菜Pol CMS不育系92-09A花、花蕾總RNA反轉錄產物為模板，對大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224進行PCR擴增，獲得669 bp的條帶。測序后通過序列比對，初步認定該基因是甘藍型油菜Pol CMS雄性不育基因Branorf224 （Accession No. EU254235）的同源基因，命名為Braraorf224。Braraorf224基因編碼222個氨基酸，編碼區(qū)內不含有內含子（圖2）。

2.2.2 大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224的生物信息學分析 通過在GenBank中的BLAST檢索，發(fā)現(xiàn)了兩個甘藍型油菜Pol CMS雄性不育基因，編碼蛋白長度分別為222個氨基酸（Accession No. YP_717120）、224個氨基酸（Accession No. EU254235），分別命名為Bran22、Bran24。在青菜、芥菜中也發(fā)現(xiàn)了Pol CMS雄性不育基因，分別為青菜Brach （Accession No. AAT42256）、芥菜BraJ （Accession No. AAO48983）。擬南芥中的Pol CMS雄性不育基因蛋白為At（Accession No. NP_085529）。對來自不同物種的Pol CMS雄性不育基因編碼的氨基酸序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)大白菜Pol CMS雄性不育基因Braraorf224（Brara）編碼的氨基酸序列與甘藍型油菜Bran22的一致性為100%，與甘藍型油菜Bran24的一致性為78%，與芥菜BraJ的一致性為73%，與青菜Brach的一致性為72%。但是，Brara與擬南芥At的一致性僅為46%，遠遠低于上述蕓薹屬物種（圖3）。從進化樹的結果來看，大白菜Brara 與油菜Bran22的親緣關系最為接近，與擬南芥At親緣關系最遠（圖4）。

2.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR的克隆及表達分析

2.3.1 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR的克隆 以大白菜Pol CMS 雄性不育恢復系早28花、花蕾總RNA的反轉錄產物為模板，對恢復基因BraraPPR進行PCR擴增，獲得2 444 bp的條帶，經測序為甘藍型油菜Pol CMS恢復基因BrnPPR1 （Accession No. XM_013841641）的同源基因，命名為BraraPPR。BraraPPR基因編碼區(qū)長1 953 bp，編碼650個氨基酸，編碼區(qū)內不含有內含子（圖5）。

2.3.2 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR的生物信息學分析 通過GenBank中的BLAST檢索，在甘藍型油菜、甘藍、亞麻薺、山葵、擬南芥中均發(fā)現(xiàn)有Pol CMS不育系恢復基因的同源基因，它們編碼的蛋白質分別為油菜BrnPPR1（Accession No. XM_013841641）、油菜BrnPPR2 （Accession No. XM_013853446）以及甘藍BroPPR （Accession No. XM_013744538 ）、亞麻薺CsPPR （Accession No. XM_010460416 ）、山葵EsPPR （Accession No. XM_006417174）、擬南芥AtPPR（Accession No. NM_101102）。利用DNAMAN軟件對上述蛋白質的氨基酸序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)大白菜BraraPPR的氨基酸序列與油菜BrnPPR1、甘藍BroPPR、油菜BrnPPR2、山葵EsPPR、亞麻薺CsPPR、擬南芥AtPPR的一致性分別為98%、77%、73%、73%、71%、70%（圖6）。從進化樹的結果來看，大白菜BraraPPR與油菜BrnPPR1的親緣關系最為接近（圖7）。

2.3.3 大白菜Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR的表達模式分析 利用不育系92-09A、恢復系早28及雜種F1（92-09A×早28）的花、花蕾提取總RNA，以反轉錄獲得的cDNA為模板，對Pol CMS 雄性不育系恢復基因BraraPPR進行qRT-PCR反應（圖8）。結果表明，恢復基因BraraPPR在雜種F1花器中的表達量最高，其次是恢復系，在不育系中的表達量最低；雜種F1、恢復系中的表達量分別是不育系的4.9倍和3.1倍。

3 討論與結論

3.1 Pol CMS雄性不育的轉育及其利用

大白菜與甘藍型油菜同屬十字花科蕓薹屬，可以雜交結實。人們可以利用有性雜交將甘藍型油菜Pol CMS雄性不育基因導入大白菜中。目前大白菜中使用的Pol CMS均來自于甘藍型油菜。在本研究中，我們以柯桂蘭饋贈的大白菜Pol CMS雄性不育KG-Pol植株為母本，通過多代回交轉育，獲得了大白菜Pol CMS雄性不育純系92-09A。92-09A的花瓣、萼片和雌雄蕊都比保持系92-09小，花藥錐形干癟，不能形成有活力的成熟花粉粒。通過對大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的不育基因Braraorf224和恢復基因BraraPPR的序列分析，發(fā)現(xiàn)它們與甘藍型油菜Pol CMS雄性不育基因Bran22和恢復基因BrnPPR1的氨基酸序列一致性分別為100%、98%。系統(tǒng)進化分析表明，Braraorf224與油菜Bran22親緣關系最近， BraraPPR與油菜BrnPPR1親緣關系最近。說明我們獲得的大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A的不育基因及其恢復基因來自于甘藍型油菜。

在大白菜Pol CMS雄性不育轉育過程中，我們發(fā)現(xiàn)不育株經常出現(xiàn)嵌合型、低溫敏感型、高溫敏感型不育。實踐中常見同一株上可育/敗育并存，低溫表現(xiàn)不育， 溫度升高后又轉變?yōu)榭捎?；高溫下不育?在通過低溫影響后， 又變?yōu)榭捎Ｐ璐罅亢Y選保持系， 才能育成穩(wěn)定不育系。這與已有的報道結果相同[11，12]。因此，克服上述Pol CMS 雄性不育系的缺點是利用Pol CMS 雄性不育生產一代大白菜雜交種首先要面對的重要育種問題。為此，山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所分子育種研究室與山東登海種業(yè)股份有限公司西由種子分公司聯(lián)合攻關，力爭解決這一難題。目前，這方面的研究進展順利，已獲得了對高、低溫不敏感的大白菜Pol CMS不育系。

雖然人們選育出了許多大白菜Pol CMS雄性不育系，但是真正利用Pol CMS雄性不育系大面積生產一代雜交種的例子尚不多見。造成這種情況的原因，除前面提到的Pol CMS的花粉敗育易受溫度影響不穩(wěn)定外，還存在另外一個重要原因，就是目前人們主要利用大白菜的自交不親和性和自交系內的遲配性來生產一代雜交種[2]。該方法制種可以獲得正反交兩個方面的一代雜交種子，產量高，是不育系制種法種子產量的1.3倍以上，同時純度也可保持在95%以上。根據(jù)以上分析，我們認為綜合利用大白菜Pol CMS雄性不育系、自交不親合系、自交系（系內遲配性）選擇適宜的親本類型生產一代雜交種將是未來大白菜制種的發(fā)展方向。

3.2 大白菜Pol CMS雄性不育機理

隨著人們對大白菜、油菜、蘿卜等十字花科蔬菜線粒體、葉綠體基因組測序的完成[13-15]，對各種雄性不育機理的研究也不斷深入。到目前為止，人們對Pol CMS雄性不育機理研究結果主要有：（1）Pol CMS細胞質雄性不育直接與線粒體基因組（mtDNA）的差異、重排及其表達產物相關聯(lián)，而與葉綠體基因組無關。mtDNA重排會導致新的嵌合基因產生或下游基因的表達模式和功能的改變，從而導致不育[16，17]。（2）Pol CMS雄性不育與線粒體中orf224/apt6轉錄結果有關。orf224/apt6有不同的轉錄起始位點，轉錄受恢復基因的影響[1， 18]。（3）蛋白質水平的作用與Pol CMS雄性不育有關，其中有能量蛋白假說和毒性蛋白假說[1，19]。上述研究結果僅能解釋部分現(xiàn)象，要全面揭示Pol CMS不育機理還有更多的工作要做。比如，Pol CMS線粒體基因組全基因功能的研究及其與雄性不育性狀的關聯(lián)作用，Pol CMS線粒體基因突變及其基因工程技術研究等。

在本研究中，從大白菜Pol CMS雄性不育系92-09A中克隆得到的Braraorf224與甘藍型油菜的雄性不育基因Bran22的氨基酸序列一致性為100%，說明大白菜Pol CMS雄性不育可能是由Braraorf224引起的。92-09A與早28雜交，獲得的F1代雜交株是可育的，說明早28中攜帶有Pol CMS雄性不育的恢復基因。我們對恢復基因BraraPPR進行了克隆，并對其表達模式進行分析，結果表明，BraraPPR在恢復系早28及恢復系與雄性不育系雜交種F1中的表達量明顯高于雄性不育系92-09A，說明大白菜Pol CMS雄性不育育性的恢復可能與BraraPPR有關，其分子機理仍需進一步深入研究。

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