李曉娜+潘敏+王萌+楊葉+鄭服叢+朱朝華+張宇

摘 要 為探究草甘膦誘導(dǎo)橡膠樹芽接苗葉片畸變的作用機理，以巴西橡膠樹品種‘熱研7-33-97芽接苗為材料，噴施188 g a.i/hm2的草甘膦劑量，分析芽接苗不同形態(tài)葉片莽草酸和4種激素含量變化規(guī)律。結(jié)果表明：莽草酸積累量在草甘膦施藥前后呈顯著差異，當(dāng)葉片出現(xiàn)半黃半綠表型時，莽草酸積累量較未施藥前上升12.40%，而在2種再生畸形葉（葉片長度<7 cm和>7 cm）和恢復(fù)葉時分別下降75.01%、77.48%和62.69%；噴施草甘膦后各類型葉片生長素和赤霉素的含量均與未施藥前對照葉片差異不顯著，脫落酸和玉米素含量較對照差異顯著，半黃半綠葉片脫落酸含量較未施藥對照下降12.40%，玉米素較施藥前下降33.54%；2種再生畸形葉出現(xiàn)后，脫落酸含量較未施藥前分別升高30.40%和45.61%，玉米素分別升高41.48%和86.02%。說明莽草酸和植物激素共同調(diào)節(jié)著橡膠樹的生長，且影響了橡膠樹葉片畸形。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹 ；草甘膦 ；莽草酸 ；激素

中圖分類號 S794.1 文獻標(biāo)志碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.11.011

Abstract The mechanism of glyphosate spraying on the induction to the distortion of the rubber tree grafting budding seedling leaf is unclear. In this study， rubber variety CATAS 7-33-97 grafting budding seedlings leaves sprayed 188 g a.i/hm2 of glyphosate dose， were used for analysis of shikimic acid and 4 kinds of hormone contents. Results show that the accumulation of shikimic acid in leaves before and after glyphosate spraying was significantly different. When in half yellow half green leaf phenotype， shikimic acid accumulation is up 12.40% before spraying， and in two regeneration deformed leaf （less than 7 cm and more than 7 cm length） and restoring leaf fell by 75.01%， 77.48% and 75.01%， respectively. Auxin and GA3 contents in various types of leaves after glyphosate spraying show no significant differences compared with leaves before spraying， while significant difference are found in content of abscisic acid and zeatin. Abscisic acid and zeatin contents in half yellow half green leaf fell by 12.40% and 33.54 than control leaf， respectively. In two regeneration deformed leaf， abscisic acid content is increased 30.40% and 30.40%， zeatin is increased 41.48% and 86.02% than control leaf， respectively. The results showed that shikimic acid and hormones regulated the growth of rubber tree together， and affected the the leaf of rubber tree distorted.

Keywords Hevea brasiliensis Muell. Arg. ； glyphosate ； shikimic acid ； hormone

草甘膦（Glyphosate）是由孟山都公司開發(fā)的高效、廣譜的內(nèi)吸傳導(dǎo)型滅生性除草劑[1]。在使用過程中草甘膦藥液飄移往往會使作物受到藥害，甚至?xí)?dǎo)致作物死亡[2]。草甘膦抑制5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvoylshikimate-3-phosphate-synthase， EPSPS）活性，導(dǎo)致莽草酸含量大量積累，從而影響植物細胞分裂和葉綠素等生理代謝功能[3]。莽草酸積累量是草甘膦對作物生理機制影響的重要指標(biāo)[4-5]。

生長素（Auxin， IAA）、玉米素（Zeatin， ZR）、赤霉素（Gibberellin， GA3）和脫落酸（Abscisic acid， ABA）是主要的植物內(nèi)源激素，與植物的基因表達、生長發(fā)育和代謝等過程密切相關(guān)[6]。IAA調(diào)控花序、花分生組織以及花器官的發(fā)育[7]。ABA在水分脅迫下對植物氣孔運動[8-9]、種子萌發(fā)、開花時間和果實成熟等生理過程中起到重要調(diào)節(jié)作用[10-12]。GA3促進種子萌發(fā)和植物生長[13]，降低植物對逆境的抵御能力[14]，在植物的生物合成和信號傳導(dǎo)方面發(fā)揮重要的作用[15]。ZR屬于細胞分裂素的一種，能夠促進細胞分裂、分化，維持蛋白質(zhì)合成的正常機能[16]。

已有研究結(jié)果表明，在噴施草甘膦后，大豆的莽草酸積累量增加會使植株死亡[17]。草甘膦誘導(dǎo)棉花花藥中生長素、赤霉素、脫落酸和玉米素含量產(chǎn)生變化導(dǎo)致花粉?；蝃18-19]。在草甘膦的作用下，生長素含量的變化引起棉花和玉米葉片扭曲[20]。草甘膦與赤霉素作用可以促進玉米生長[21]。巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）幼苗生長過程中需要進行雜草防除，草甘膦噴施過程中會因人為、環(huán)境等因素沾濺到橡膠樹葉片上，被橡膠樹吸收傳導(dǎo)，導(dǎo)致草甘膦藥害產(chǎn)生。筆者推測，在草甘膦處理下，莽草酸和激素含量的變化會影響橡膠樹葉片畸形。因此，筆者采用巴西橡膠樹‘熱研7-33-97芽接苗為材料，探析草甘膦處理后巴西橡膠樹幼苗不同形態(tài)葉片中莽草酸和激素含量的變化規(guī)律，以期更深入地了解草甘膦對巴西橡膠樹幼苗葉片畸形的原因，為研究草甘膦對巴西橡膠樹作用機制打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育的巴西橡膠樹品種‘熱研7-33-97一年生芽接苗為材料，芽接苗種植于海南大學(xué)環(huán)境與植物保護學(xué)院（儋州校區(qū)）實驗基地，草炭土與粘土體積比例為3∶1的育苗袋中。

41%草甘膦水劑，由浙江綠野農(nóng)化生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

將41%草甘膦有效劑量188 g a.i/hm2，噴施在‘熱研7-33-97芽接苗第一蓬葉，每批處理6株，每株取葉柄中間的一片葉片進行分析。以下5種形態(tài)葉片進行測定：（1）未施藥前葉片（對照）；（2）3～5 d半黃半綠葉片；（3）30 d再生<7 cm畸形葉；（4）>7 cm畸形葉；（5）36 d再生恢復(fù)葉。

1.2.2 莽草酸含量測定

莽草酸含量測定參考Gaitonde[22]、婁遠來[23]和王迪[24]等的方法，稍作改動。用液氮分別研磨未施藥前葉片、半黃半綠葉片、小于7 cm畸形葉、大于7 cm畸形葉和新生的恢復(fù)葉，各取0.2 g樣品于2.0 mL離心管，加入0.25 mol/L HCL 1.0 mL，4℃，12 000 r/min下離心30 min。然后取200 μL上清液于10 mL離心管，加入2.0 mL氧化劑溶液（1%高碘酸和1%過碘酸鈉溶液混合），室溫靜置3 h，加入 1.0 mol/L NaOH溶液2.0 mL，最后加入0.1 mol/L甘氨酸1.2 mL 混勻，靜置5 min，用紫外分光光度計在380 nm比色，以0.25 mol/L HCL為空白對照。

莽草酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取莽草酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g，溶于1 mL的0.25 mol/L HCL，混勻，分別取5、10、25、37.5、50 μL于1.5 mL離心管，加0.25 mol/L HCL溶液，定容至1.0 mL，以下步驟同莽草酸含量測定，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 4種內(nèi)源激素含量測定

參考陳建華[25]和馬有寧[26]等的方法，稍作激素前處理改動：用液氮分別研磨未施藥前葉片、半黃半綠葉片、小于7 cm畸形葉、大于7 cm畸形葉和新生的恢復(fù)葉，各取0.5 g樣品于5 mL 80%冰凍色譜純甲醇（含0.1%酮試劑）里，4℃避光提取過夜，13 000 r/min ，4℃下離心10 min，濾紙過濾后，加入20 μL氨水，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上40℃加壓蒸發(fā)至水相，然后加入乙酸乙酯1 mL萃取，在35℃濃縮至近干，提前分別用10 mL色譜純甲醇和滅菌的超純水活化迪馬公司PXC小柱，處理好的樣品過PXC小柱，先用10 mL 0.1 mol/L的HCL淋洗柱子，再用10 mL色譜純甲醇洗脫，洗脫液在40℃下減壓蒸發(fā)至近干，用1 mL色譜純甲醇溶解，0.22 μm無機濾膜過濾，-80℃保存或待測。

4種內(nèi)源激素含量測定：采用酶聯(lián)免疫（ELISA）分析試劑盒法（雙抗體夾心法）測定IAA（生長素）、GA（赤霉素）、ABA（脫落酸）和ZR（玉米素）4種內(nèi)源激素，加入準(zhǔn)備好的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余步驟相同：37℃反應(yīng)30 min；洗板5次，加入酶標(biāo)試劑（避光），37℃反應(yīng)30 min；洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10 min；加入終止液，15 min內(nèi)在酶標(biāo)儀上讀OD值，最后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并帶入計算。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗測定為3次重復(fù)，采用SAS 9.1.3對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和多重比較分析，采用Excel 2013軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對芽接苗不同時間形態(tài)的影響

將草甘膦稀釋液噴施在橡膠樹幼苗第一蓬葉片上，不同時間葉片癥狀如圖1。從圖1可以看出，圖1-A為對照，草甘膦噴施3～5 d后橡膠樹幼苗葉片變黃（圖1-B），10～15 d葉片脫落。葉片脫落后，橡膠樹幼苗枝條開始分蘗、長芽，同時長出第二蓬葉。約30 d第二蓬葉片穩(wěn)定，呈細長、卷曲形（圖1-C）。約35 d第二蓬新生的葉片形狀會有所恢復(fù)，但是仍長于正常葉片（圖1-D），這說明草甘膦對橡膠樹幼苗葉片產(chǎn)生一定的影響。

2.2 對芽接苗葉片中莽草酸和4種激素含量的影響

2.2.1 對莽草酸含量的影響

草甘膦噴施橡膠樹幼苗后，按照試驗方案進行采樣，并測定莽草酸含量，數(shù)據(jù)顯示，其幼苗在不同形態(tài)葉片中莽草酸含量有一定的變化（圖2）。由圖2可知，莽草酸含量未施藥前葉片、半黃半綠葉、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和恢復(fù)葉分別為1 521.13、1 709.82、380.06、342.56和567.56 μg/g FW，呈下降趨勢。葉片出現(xiàn)半黃半綠時其莽草酸有一定積累，較未施藥前升高了12.40%，隨后畸形葉出現(xiàn)時，莽草酸積累量逐漸下降，分別比未施藥前下降75.01%和77.48%；而當(dāng)新生葉片恢復(fù)時莽草酸積累量有所升高，但相對未施藥前下降62.69%。說明草甘膦只在施藥前期中斷橡膠樹幼苗莽草酸的途徑，使其不能分解下游產(chǎn)物，橡膠樹幼苗后期莽草酸積累量減少，可能由于環(huán)境變化或植株自身代謝將草甘膦分解。

2.2.2 對4種激素含量的影響

為了探求葉片扭曲對植物內(nèi)源激素的影響，測定5種不同葉片形態(tài)下ABA（脫落酸）、GA3（赤霉素）、IAA（生長素）、ZR（玉米素）4種激素含量（圖3）。由圖3可以看出，未施藥前葉片、施藥后半黃半綠葉片、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和新生的恢復(fù)葉IAA含量分別為25.79、22.74 、24.31、25.60和27.04 pmol/L；GA3含量分別為69.0、139.60、159.92、167.26和196.45 pg/mL。橡膠苗從施藥到長出恢復(fù)葉的過程中，IAA和GA3含量都呈現(xiàn)緩慢上升，與對照差異不明顯。未施藥前葉片、施藥后半黃半綠葉片、<7 cm畸形葉、>7 cm畸形葉和新生的恢復(fù)葉ABA含量分別為100.82、88.32、131.47、146.80和124.84 μg/L，葉片處于半黃半綠時ABA含量較對照下降12.40%，而在畸形葉和恢復(fù)葉中ABA含量分別較未施藥前升高30.40%、45.61%和23.82%。橡膠苗從施藥到長出恢復(fù)葉的過程中，ZR含量分別為146.23、97.19、206.89、272.02和123.42 ng/L，葉片處于半黃半綠和恢復(fù)葉時，ZR含量較對照分別下降33.54%和15.60%，而在畸形葉中ZR含量分別較未施藥前升高41.48%、86.02%，說明草甘膦影響橡膠樹生長過程中激素含量的運輸及分布。

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著勞動力成本的增加，草甘膦的用量不斷上升，已成為市面上應(yīng)用最廣的除草劑品種[27]。草甘膦在施藥過程中，地面或航空噴霧的飄移對作物造成的藥害已成為生產(chǎn)中急需解決的問題[28-30]。

草甘膦競爭性抑制莽草酸合成途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的活性，因此，提高EPSPS活性，可以將植物體內(nèi)多余的莽草酸代謝掉，保證芳香族氨基酸的正常代謝[31]。國內(nèi)外研究結(jié)果表明：在噴施草甘膦后，正常植物體內(nèi)莽草酸含量上升，植物EPSPS酶活性受到抑制。在大豆實驗中，被草甘膦處理的常規(guī)大豆中莽草酸含量隨藥害天數(shù)逐漸增加，最終導(dǎo)致植株死亡[32]。對比研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)草甘膦處理后不同形態(tài)橡膠樹葉片的莽草酸含量較對照組反而下降。說明橡膠樹可能受外界因素或是自身代謝作用的影響，導(dǎo)致本研究結(jié)果與大豆實驗不同。另有研究結(jié)果表明，草甘膦可以降低棉花花粉活性，產(chǎn)生畸形花，可能是棉花受到草甘膦脅迫產(chǎn)生了抗性基因，具有抗性基因的EPSPS酶將莽草酸轉(zhuǎn)化為EPSP[33]，使莽草酸含量沒有積累。

植物激素既可以調(diào)節(jié)植物生長，也可以在逆境中維持植物的生長[34]。有研究結(jié)果表明，IAA、GA、ZR的含量不足會導(dǎo)致花藥在減數(shù)分裂時期得不到足夠的底物和能量。在劉吉燾等[18]的棉花實驗中，草甘膦作用下，棉花花粉敗育，植株體內(nèi)IAA、GA、ZR的含量低于正常植株，ABA的含量則高于正常植株。在本研究中，草甘膦處理下，橡膠樹不同形態(tài)葉片中IAA和GA3含量都呈緩慢上升，但較對照無明顯差異。說明橡膠樹在草甘膦作用下，IAA和GA3含量變化影響不大。ABA和ZR在橡膠樹畸形葉中含量顯著升高，ABA含量高，會抑制細胞生長和促進細胞衰老死亡[18]。ABA和ZR在草甘膦作用下，能夠抑制橡膠樹葉片中細胞生長，橡膠樹葉片畸形可能是其在逆境中所表現(xiàn)的一種應(yīng)激反應(yīng)。

本實驗通過對巴西橡膠樹葉片中莽草酸含量和4種激素含量的分析發(fā)現(xiàn)，草甘膦導(dǎo)致橡膠樹葉片畸形時，莽草酸含量顯著降低。脫落酸和玉米素含量顯著升高，說明莽草酸和植物激素共同調(diào)節(jié)著橡膠樹的生長，且影響了橡膠樹葉片畸形。

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