羅俊霞，李曉臣，范知，董素靜，趙建波

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州450006；

2.鄭州市農(nóng)業(yè)信息中心，河南鄭州450006；

3.鄭州市園藝工作站，河南鄭州450006）

膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)淺析

羅俊霞1，李曉臣1，范知2，董素靜1，趙建波3

（1.鄭州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測流通中心，河南鄭州450006；

2.鄭州市農(nóng)業(yè)信息中心，河南鄭州450006；

3.鄭州市園藝工作站，河南鄭州450006）

本文通過翻閱文獻(xiàn)資料并結(jié)合日常的檢測實(shí)際，分析膠體金免疫層析法快檢產(chǎn)品應(yīng)用于水產(chǎn)品中藥物殘留的檢測時(shí)假陽性和假陰性的風(fēng)險(xiǎn)來源及產(chǎn)生的原因，提出相應(yīng)的建議和應(yīng)采取的措施，以期提高對水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測的效果。

膠體金免疫層析類速測產(chǎn)品；藥物殘留；假陽性；假陰性；風(fēng)險(xiǎn)來源

目前膠體金免疫層析技術(shù)已經(jīng)較為廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)品中的藥物殘留（如氯霉素、磺胺類藥物、氟喹諾酮類藥物、孔雀石綠、硝基呋喃類藥物）的速測產(chǎn)品中，這類產(chǎn)品在檢測過程中具有快速、準(zhǔn)確、操作方便、定量或者半定量[1,2]的特點(diǎn)，但是在檢測過程中也存在著這樣或者那樣的問題影響著檢測結(jié)果，造成假陽性或者假陰性檢測結(jié)果的發(fā)生，嚴(yán)重影響了檢測質(zhì)量。為此筆者翻閱了大量的文獻(xiàn)資料，結(jié)合平時(shí)的檢測實(shí)際，以日常使用的水產(chǎn)品的快速檢測試劑卡為例，淺析這類產(chǎn)品在檢測過程中假陽性或假陰性發(fā)生的原因，供同行參考。

1 膠體金免疫層析法的技術(shù)特點(diǎn)

膠體金免疫層析法的優(yōu)點(diǎn)有易制備、價(jià)格低、使用方便等特點(diǎn)；金顆粒大小可以控制，可進(jìn)行雙重或者多重標(biāo)記，對組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，具有高特異性和高敏感性，既可以用于光鏡，也可以用于投射電鏡和掃描電鏡；檢測結(jié)果可以直接用顏色顯示，肉眼判斷直觀可靠，也可配合其它方法進(jìn)行定量和半定量[1,3-5]。但是該方法還存在著一些不足：（1）膠體金顆粒本身的特異性導(dǎo)致了該技術(shù)的應(yīng)用存在一定的限制，如操作過程中需要的清潔度高；（2）某些膠體金顆粒穩(wěn)定性差，存放時(shí)間短，滲透能力弱，著色不均勻等；（3）有些膠體金顆粒的檢測靈敏度不高，檢測限不能滿足監(jiān)控實(shí)際的需要[1]。

2 檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性的風(fēng)險(xiǎn)來源

2.1 試劑盒的質(zhì)量

試劑盒的質(zhì)量是影響檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵[6]，而影響試劑盒質(zhì)量的最主要的因素是抗原抗體的質(zhì)量，如果抗原抗體不具有高度特異性，則樣品里與待檢物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)則容易跟非特異性的抗原抗體發(fā)生交叉反應(yīng)導(dǎo)致假陽性的檢測結(jié)果[6-8]。膠體金試劑盒的特異性常用交叉反應(yīng)率表示，與待測藥物具有相似結(jié)構(gòu)的物質(zhì)都可能和抗原結(jié)合產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)[7]。賴年悅等[8]認(rèn)為，待檢樣品種類繁多，成分復(fù)雜，容易影響抗原抗體反應(yīng)以及膠體金顆粒與蛋白的吸附，有的抗體特異性不強(qiáng)，容易與目標(biāo)物結(jié)構(gòu)類似的物質(zhì)有交叉反應(yīng)，所以因樣品基質(zhì)不同，檢出限在一定范圍內(nèi)波動，會造成假陽性的檢測結(jié)果。用日常檢測中使用的磺胺類藥物的膠體金試劑卡對水產(chǎn)品中的磺胺類藥物進(jìn)行篩查，該產(chǎn)品可以檢測如磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺異噁唑等12種磺胺類藥物，也就是說該檢測卡所使用的抗體并沒有對這12種磺胺類藥物中的某一種具有特異性的免疫反應(yīng)，這12種磺胺類藥物均可以跟該試劑盒的抗體反應(yīng)，只是生產(chǎn)的抗體對這12種磺胺類藥物敏感的程度不同，所以該試劑盒檢測這12種磺胺類藥物的最低檢測限不一樣。所以當(dāng)陽性結(jié)果出現(xiàn)時(shí)，則說明該樣本中可能含有高于該試劑盒里說明書中標(biāo)明檢測下限的12種磺胺類藥物；或者該樣品中含有12種磺胺類藥物中的幾種藥物，只是含量未知。

2.2 基質(zhì)效應(yīng)

在痕量分析的過程中，樣品或者樣品提取物中及其復(fù)雜多變的蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪、其他的小分子物質(zhì)及鹽溶液會給檢測結(jié)果帶來較大的影響，叫做基質(zhì)效應(yīng)。在氣相色譜檢測農(nóng)藥殘留方面，黃寶勇、羅俊霞等[9-12]做了大量基礎(chǔ)性的研究，王秀丹[13]認(rèn)為在免疫檢測方面也存在較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，也就是說樣品里的非目標(biāo)分析物也會引起較大的基質(zhì)干擾效應(yīng)，可能會和特異性的抗原抗體的發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。而李文玲等[14]認(rèn)為，在用膠體金免疫層析法檢測海參中的呋喃唑酮的過程中，由于其中蛋白和多糖組份的共同作用對檢測性能造成很大影響，造成檢測結(jié)果無法判定。

2.3 試劑盒的運(yùn)輸和保存

水產(chǎn)品的膠體金快速檢測試劑卡受環(huán)境條件的影響較大，確切的說是抗原抗體受環(huán)境條件（如溫度）的影響較大，不同的抗原抗體要求的貯存溫度條件略有不同，一般環(huán)境溫度需要控制在10℃左右，溫度過高或者過低對抗原抗體都有影響，如果溫度過高會使抗原抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性檢測結(jié)果的發(fā)生[6,15,16]。

2.4 結(jié)果判定

陶光燦等[17]對膠體金方法測定動物組織中的氯霉素的方法進(jìn)行了改進(jìn)，改進(jìn)后的方法在檢測過程中讓金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，增加了體系靈敏度，易于對樣本中的藥物殘留進(jìn)行分析，但是最后是通過顏色進(jìn)行結(jié)果判斷，比較主觀，可能出現(xiàn)假陽性的檢測結(jié)果。

3 檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性的風(fēng)險(xiǎn)來源

3.1 試劑盒質(zhì)量

在用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品中各種藥物殘留時(shí)，試劑盒的質(zhì)量是影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵。何華堅(jiān)[18]對國內(nèi)市場化的商品試劑盒和進(jìn)口試劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)試劑盒存在質(zhì)量不穩(wěn)定、檢測不準(zhǔn)確等缺陷，很多產(chǎn)品抗原不穩(wěn)定，如孔雀石綠抗原在產(chǎn)品保存期就失去了抗原的作用，使用這種試劑盒進(jìn)行檢測難免會出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。

3.2 基質(zhì)效應(yīng)

王秀丹[13]認(rèn)為在免疫檢測方面，樣品里的各種化學(xué)成份可能會影響到抗原抗體和目標(biāo)分析物結(jié)合，降低競爭性免疫檢測的靈敏度，靈敏度降低勢必導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果的發(fā)生。Mitchell等[19]針對不同的添加物和緩沖溶液對尿液中睪酮免疫的的影響做了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)尿液中的基質(zhì)對睪酮檢測結(jié)果有抑制作用從而導(dǎo)致檢測結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。而在基質(zhì)效應(yīng)的消除過程中很多人都采用將樣品進(jìn)行稀釋的方法，但是在對樣品進(jìn)行的稀釋的時(shí)候同時(shí)待測物質(zhì)也得到了同樣倍數(shù)的稀釋，因此也降低了檢測方法的靈敏度，引起假陰性結(jié)果的發(fā)生[13]。

3.3 反應(yīng)的條件苛刻

用膠體金免疫層析法檢測水產(chǎn)品的快速檢測產(chǎn)品的前處理一般都比較簡單，但是由于某些藥物的特殊結(jié)構(gòu)，需要將該物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硗庖环N物質(zhì)才能對其進(jìn)行檢測。例如水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物的檢測則需要將樣品在65℃的條件下進(jìn)行衍生30min，衍生成另外一種物質(zhì)后才能對其進(jìn)行檢測，如果衍生時(shí)的溫度恒溫控制不好或者衍生的時(shí)間不夠，就會引起衍生不完全，從而導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果的出現(xiàn)。

3.4 樣品的前處理過程復(fù)雜

一般在進(jìn)行微量或者痕量分析時(shí)，稱取樣品的時(shí)候，為了提高樣品中藥物的提取效果，需要將樣品粉碎成糜狀，樣品粉碎的越細(xì)，則樣品顆粒的比表面積越大，提取的效果就會越好。目前使用快速檢測卡進(jìn)行檢測時(shí)，由于樣品量或者儀器配置的原因，粉碎、處理水產(chǎn)樣品時(shí)，多數(shù)使用剪刀剪取一定量的樣品，而沒有將樣品進(jìn)行粉碎處理，這樣大塊樣品進(jìn)行提取處理，不易將樣品里的藥物提取出來，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。其次，在對樣本進(jìn)行藥物的提取的過程中，往往進(jìn)行均質(zhì)或者渦旋，均質(zhì)或者渦旋的目的也是將樣本進(jìn)行充分粉碎或者使有機(jī)溶劑和樣本顆粒進(jìn)行充分而有效的接觸，從而提高提取的效果，假如這一步?jīng)]有進(jìn)行充分而有效的處理則樣本中的藥物就有可能不會完全提取出來，從而導(dǎo)致假陰性檢測結(jié)果的發(fā)生。另外，在進(jìn)行樣品的濃縮之前，需要吸取一定體積的樣品提取液，如果稱取樣品的時(shí)候使用的離心管體積較大（如50mL），因?yàn)樵撾x心管較粗，往往在吸取的時(shí)候就取不夠說明書上所需要的體積或者在吸取的時(shí)候吸到了水相，造成所濃縮的樣本里藥物的含量比實(shí)際樣品中的含量低，從而導(dǎo)致假陰性的檢測結(jié)果發(fā)生。最后在氮吹的時(shí)候氮?dú)忾_的過大或者水浴鍋的溫度設(shè)的過高，則會導(dǎo)致目標(biāo)藥物隨著有機(jī)溶劑的揮發(fā)而揮發(fā)，引起樣本里目標(biāo)檢測物的含量降低，造成假陰性檢測結(jié)果的出現(xiàn)；氮吹后需要用有機(jī)溶劑對試管壁進(jìn)行充分的清洗和溶解，如果溶解不充分，也會造成樣本里的目標(biāo)藥物損失，導(dǎo)致假陰性樣本的發(fā)生。

4 檢測過程中的注意事項(xiàng)

4.1 選用質(zhì)量好的試劑盒

試劑盒質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響檢測結(jié)果的質(zhì)量，所以，在檢測過程中選用質(zhì)量較優(yōu)的試劑盒是必須的，必要時(shí)還應(yīng)適時(shí)對試劑盒的質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)證、把關(guān)。劉歡等[20-22]對孔雀石綠、硝基呋喃類代謝物、氯霉素等三類藥物多種產(chǎn)品的質(zhì)量進(jìn)行了比較和評價(jià)，認(rèn)為孔雀石綠殘留的膠體金快檢產(chǎn)品穩(wěn)定性較差，建議在用膠體金類快檢產(chǎn)品應(yīng)用于水產(chǎn)品的質(zhì)量安全監(jiān)管之前，有必要全面考察產(chǎn)品的質(zhì)量，包括產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

4.2 加強(qiáng)研究，降低基質(zhì)效應(yīng)帶來的檢測風(fēng)險(xiǎn)

膠體金免疫檢測中的基質(zhì)效應(yīng)是一個(gè)棘手的問題，目前國內(nèi)外這方面的文獻(xiàn)還較少，因此加大這方面的科研很重要。如果能夠找到引起這種效應(yīng)存在的根本原因，同時(shí)開發(fā)出有效、簡便的消除基質(zhì)效應(yīng)的方法，將是膠體金免疫快檢產(chǎn)品的重大突破。隨著研究的不斷進(jìn)行，有望能夠減小乃至消除膠體金免疫檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng)，使該產(chǎn)品真正實(shí)現(xiàn)在水產(chǎn)品安全品質(zhì)監(jiān)管方面的作用。

4.3 加強(qiáng)試劑盒在運(yùn)輸和貯存中的管理

因?yàn)槟z體金快速檢測卡有存放時(shí)間短的缺點(diǎn)，所以在試劑盒的運(yùn)輸和貯存過程中如果冷藏不好或者日常工作中反復(fù)凍融則會降低抗原抗體的特異性，導(dǎo)致試劑盒的靈敏度降低。因此在貯運(yùn)過程中加強(qiáng)管理，或者減少試劑盒的流通中轉(zhuǎn)環(huán)節(jié)，盡可能的減少試劑盒的庫存量，從而提高抗原抗體的壽命，以減少假陽性或者假陰性檢測結(jié)果的發(fā)生。

4.4 加強(qiáng)學(xué)習(xí)，提高檢測人員的檢測水平

快速檢測工作看似簡單，但是卻細(xì)致而繁瑣，不僅要求檢測人員有一定的學(xué)歷作為鋪墊，而且要求檢測人員應(yīng)該具有化學(xué)分析的專業(yè)基礎(chǔ)，經(jīng)過培訓(xùn)考核，操作熟練規(guī)范，同時(shí)要求檢測人員在檢測工作中要細(xì)致認(rèn)真，在工作中能夠發(fā)現(xiàn)問題、分析問題、解決問題。所以，在日常工作中加強(qiáng)學(xué)習(xí)，提高檢測人員的檢測水平很重要。

4.5 在檢測過程中做好質(zhì)量控制，提高檢測質(zhì)量

對于在最后判定上面出現(xiàn)的檢測誤差，建議在檢測過程中制備選取陰性樣品，用陰性樣品制備一定濃度的陽性樣品，了解該產(chǎn)品陰性樣品和陽性樣品最終的檢測效果，不僅對整個(gè)檢測過程進(jìn)行質(zhì)量控制，也對最后結(jié)果的判定進(jìn)行統(tǒng)一，提高最終的檢測質(zhì)量。

5 小結(jié)

隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測方面的產(chǎn)品得到了長足的發(fā)展，以膠體金為代表的方法被全球很多先進(jìn)的國家廣泛使用，建立適合我國、快速、簡便、特異性強(qiáng)、敏感度高，同時(shí)又準(zhǔn)確可靠的水產(chǎn)品中藥物殘留的快速檢測產(chǎn)品尤為重要。加強(qiáng)科學(xué)研究，提高檢測結(jié)果的可靠性是檢測領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急，這對加強(qiáng)水產(chǎn)品的安全品質(zhì)，提高人民群眾的身體健康、促進(jìn)社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展、維護(hù)社會的穩(wěn)定有著重要的意義。

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Risk Analysis of Drug Residues in Aquatic Product by Colloidal Gold Immunoassay

LUO Jun-xia1,LI Xiao-chen1,FAN Zhi2,DONG Su-jing1,ZHAO Jian-bo3
（1.Agricultural Products Quality Inspection Center,Zhengzhou 450006,China;
2.Agricultural Information Center,Zhengzhou 450006,China;
3.Horticultural Workstation,Zhengzhou 450006,China）

Pass through document,find inform,combined with routine testing,the risk sources and causes of false positive and false negative were analyzed by using colloidal gold immunoassay for rapid detection of drugs in aquatic products，and corresponding suggestions and measures was taken.Expect to improve the effect of the rapid detection of drug residues in aquatic products.

aquatic product of colloidal gold immunoassay;drug residues;false positive;false negative;risk sources

X835

A

1005-3832（2017）02-0046-04

2016-09-21

羅俊霞（1972-），女，高級農(nóng)藝師，學(xué)士，從事農(nóng)產(chǎn)品安全品質(zhì)檢測研究.E-mail:71819@163.com

趙建波（1971-），高級農(nóng)藝師.