李建文，李 曉，孫文秀*，李 偉，鞠 倩，曲明靜*，高華援，李春雨

(1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025； 2.山東省花生研究所/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100； 3.吉林省農(nóng)科院花生研究所，吉林 長春 130124)

大灰象甲Sympiezomiasvelatus(Chevrolat)，又名大灰象、大灰象蟲、象鼻蟲，屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)斑鄂象甲亞科(Brachyrhininae)灰象屬(Sympiezomias)。主要分布于吉林、遼寧、甘肅、寧夏等地區(qū)，是花生的重要害蟲之一。大灰象甲食性雜，除花生外，該蟲還危害棉花、甜菜、玉米等多種農(nóng)作物[1-4]。2016-2017年連續(xù)兩年，該蟲在東北吉林花生產(chǎn)區(qū)均有嚴(yán)重危害，以成蟲潛入土壤土表取食嫩根、葉片，導(dǎo)致蟲洞、爛葉，缺苗斷壟以至絕收，嚴(yán)重田塊缺苗60%以上[5-9]。

昆蟲性信息素是由昆蟲某一性別個(gè)體分泌于體外，能被同種異性個(gè)體所接受，并引起異性個(gè)體產(chǎn)生一定的行為和生理反應(yīng)(如覓偶、定向求偶、交配等)的微量化學(xué)物質(zhì)，作為昆蟲交配過程中兩性相互尋找的重要紐帶和必備因素，因其專一、高效、持久、無毒、無污染、不傷害天敵等特點(diǎn)，近年來受到高度重視[10]，目前已有學(xué)者分離鑒定出多種鞘翅目昆蟲的性信息素組分[11-12]，甚至實(shí)現(xiàn)了田間應(yīng)用。然而大灰象甲的性信息素研究工作未見任何報(bào)道，防治仍以傳統(tǒng)農(nóng)藥為主，隨著昆蟲抗藥性隱患以及對(duì)環(huán)境污染的加劇，大灰象甲性信息素的研究工作迫在眉睫；同時(shí)，在國家化肥農(nóng)藥減量施用的大背景下，利用性信息素防治害蟲也呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。在昆蟲性信息分離鑒定技術(shù)中，固相微萃取技術(shù)具有操作簡便、不需溶劑、萃取速度快、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化以及易于色譜分析、需要樣品量少等特點(diǎn)，較適用于大灰象甲等性腺體不明的昆蟲類性信息素的分離鑒定。大灰象甲生活史長，在東北地區(qū)兩年發(fā)生一代，暫未實(shí)現(xiàn)人工飼養(yǎng)，因此性信息素取樣工作是在每年發(fā)生高峰期采集田間試蟲進(jìn)行抽提，帶回室內(nèi)進(jìn)行氣質(zhì)分析。為探索田間取樣方法，本研究采用直接萃取法和氣密針取樣法進(jìn)行對(duì)比研究，旨在為下一步的性信息素分離鑒定工作奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

于2016年6月大灰象甲成蟲出土初期，采自吉林省扶余市弓棚子鎮(zhèn)花生產(chǎn)區(qū)，將田間采集的大灰象甲收集起來，雌雄分開，分組飼養(yǎng)在花生植株上，試驗(yàn)時(shí)用玻璃罩隔離。

1.2 供試材料

試驗(yàn)所用的玻璃罩采用長、寬、高分別為17cm×17cm×25cm長方體玻璃罩，使用前用蒸餾水及無水乙醇分別清洗三次后置于180℃下烘烤5 h；試驗(yàn)所用的固相微萃取探針采用ZZ-SPME-06型萃取針以及DVB/CAR/PDMS型萃取頭；氣密針為潤澤流體100mL型；氣密袋采用海得科技MBT32-1型鋁塑復(fù)合氣體采樣袋。

1.3 取樣方法

1.3.1 直接萃取法

選取正在交配的大灰象甲10對(duì)，非求偶期大灰象甲10對(duì)作為對(duì)照，分別用長方體玻璃罩將其隔離起來，將固相微萃取探針懸掛于玻璃器皿內(nèi)萃取30 min后保存于冰盒內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室備用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.3.2 氣密針采集法

選取正在交配的大灰象甲10對(duì)，非求偶期大灰象甲10對(duì)作為對(duì)照，分別用玻璃器皿將其隔離起來，每隔5 min用氣密針采集器皿內(nèi)氣體100 mL注入氣密袋，采集6次，30 min后將氣密袋帶回實(shí)驗(yàn)室，用固相微萃取探針萃取1 h，萃取探針保存于冰盒內(nèi)備用，實(shí)驗(yàn)重復(fù)8次。

1.4 GC-MS分析

將上述兩種方法保存的固相微萃取探針分別送入安捷倫7890A/5975C型氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(青島貞正分析儀器有限公司)進(jìn)行分析，進(jìn)樣口溫度為220℃不分流，柱溫升溫程序?yàn)?0℃，保持2 min，5℃/min升至100℃，再以10℃/min升至250℃，保持2 min，傳輸線為250℃，MS為35～400 m/z，解析時(shí)間為5 min。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2010和SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理及統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 7.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

從GC-MS分析結(jié)果來看，兩種方法共檢出46種化合物(表1)，保留時(shí)間集中在7.40～30.32 min之間。兩種方法均能檢測到的化合物有5種，分別為：乙苯(Ethylbenzene)、對(duì)二甲苯(p-Xylene)、苯乙烯(Styrene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2- tetrachloroethane)和苯酚(Phenol)。大多數(shù)化合物為含有雙鍵或三鍵的直鏈不飽和烯炔烴、帶環(huán)的酸酯、醇酯以及醛、酮類化合物。直接萃取法共檢出37種化合物(表2)，保留時(shí)間集中在7.78～30.32 min之間。在交配組樣本中單獨(dú)檢測到的化合物有24種，交配組和對(duì)照組中均檢出的化合物有13種。交配組含量顯著高于對(duì)照組的物質(zhì)有4種(圖1)，分別為癸醛(Decanal)、香橙烯氧化物(2)(Aromadendrene oxide-(2))、丁羥甲苯(Butylated Hydroxytoluene)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷(3-ethyl-5-(2-ethylbutyl)-octadecane)，其中癸醛、香橙烯氧化物(2)和3-乙基-5-(2-乙基丁基)-十八烷三種化合物的差異性達(dá)到極顯著水平。氣密針采集法檢出化合物14種(表3)，保留時(shí)間集中在7.40～23.68 min之間。在交配組大灰象甲的氣體樣本中單獨(dú)檢測到的化學(xué)物質(zhì)有2種，分別為壬醛(Nonanal)和2-壬烯-1-醇(2-Nonen-1-alcohol)；交配組和對(duì)照組樣品中均檢測到的化合物有12種，其中交配組含量高于對(duì)照

組的物質(zhì)有10種，其中差異性達(dá)極顯著水平的有8種，分別為乙苯(Ethylbenzene)、對(duì)二甲苯(p-Xylene)、1,1,2,2-四氯乙烷(1,1,2,2-tetrachloro-ethane)、苯酚(Phenol)、(E)-2-壬烯-1-醇( (E)-2-nonen-1-alcohol)、十四烷(Tetradecane)、4,4,5,6-四甲基四氫-1,3-惡嗪-2-硫酮(4,4,5,6-tetramethyltetrahydro-1,3-oxazin-2-thione)和癸酸癸酯(Decanoic acid decyl ester)(圖2)。

3 討 論

本文首次將固相微萃取技術(shù)應(yīng)用于大灰象甲性信息素分離鑒定，對(duì)取樣方法及性信息素組分進(jìn)行了探索，由于大灰象甲尚未實(shí)現(xiàn)人工飼養(yǎng)，取樣前處理較為困難。本實(shí)驗(yàn)采用直接采樣法和氣密針采樣法對(duì)大灰象甲的性信息素取樣，均能采集到一定數(shù)量的化合物，但種類與含量有較大差別。其中直接采樣法采集到37種化合物，種類較多，平均保留時(shí)間在15～30 min之間的化合物占73.0%；氣密針采樣法采集到14種化合物，平均保留時(shí)間為10～24 min的占比71.4%。兩種方法均分離到的化合物為乙苯、對(duì)二甲苯、苯乙烯、1,1,2,2-四氯乙烷和苯酚。分析兩種取樣方法導(dǎo)致化合物組分的差異，主要有以下幾個(gè)原因：其一，直接采樣法將萃取探針直接懸掛在玻璃器皿內(nèi)，萃取探針可能會(huì)吸附到土壤及花生植株釋放的氣味組分；其二，田間采樣萃取探針萃取后，探針需要在低溫環(huán)境下運(yùn)輸至室內(nèi)上樣，這個(gè)過程可能會(huì)導(dǎo)致已萃取的化合物釋放或重萃取，導(dǎo)致一些無關(guān)組分的產(chǎn)生。而氣密針采集法將氣體采集到氣密袋中帶回實(shí)驗(yàn)室萃取減少了上述可能無關(guān)化合物的干擾，因此更適于大灰象甲性信息素氣體樣本采集。此外，在花生田大背景下，無論何種方法都不能完全避免無關(guān)氣體化合物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的干擾，因此下一步試驗(yàn)應(yīng)盡量避免花生植株帶來的背景噪音。

對(duì)兩種方法分離鑒定到的性信息素組分進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，采集到的含苯環(huán)的化合物占30.43%，酯類化合物占23.91%，含醇類化合物占13.0%，酸類化合物占10.87%，其余的為長鏈烷烴以及少數(shù)醛酮類化合物。其中交配組與對(duì)照組均采集到的化合物中對(duì)二甲苯、1,1,2,2-四氯乙烷、苯酚等化合物的峰面積值較高，分析與土壤中殘留農(nóng)藥助溶劑中的甲苯、二甲苯以及含氯化合物有關(guān)[13-14]，而不是大灰象甲的性信息素組分。以往研究結(jié)果表明，昆蟲性信息素大部分是由兩種以上的化學(xué)物質(zhì)組成，鏈長一般為10～21碳，其中以12、14、16個(gè)碳原子居多，除了雙鍵外，大多數(shù)化合物一端有一個(gè)官能團(tuán)，鞘翅目昆蟲性信息素組分多含有烯烴取代基，如樹莓象甲的性信息素組分有苧烯和α-蒎烯，蔓越橘象甲對(duì)(Z)-2-(3,3-二甲基-環(huán)己亞基)乙醇、(Z)-(3,3-二甲基環(huán)己亞基)乙醛和(E)-(3,3-二甲基環(huán)己亞基)乙醛敏感以及甘薯象甲性信息素組分含有[(Z)-3-十二碳烯基(E)-2-丁烯酸酯]等[15-17]。近緣種尤其是同屬種昆蟲性信息素結(jié)構(gòu)上有較大的相似性，因此，將大灰象甲性信息素組分的排查重點(diǎn)鎖定在含烯烴取代基的醇酯類化合物中，如：雙環(huán)[4.2.0]辛-1,3,5-三烯、10,12-十八碳二烯酸、E-12-甲基-2,13-十八碳二烯-1-醇、1,3,5,7-環(huán)辛四烯、香橙烯氧化物(2)、7-甲基-Z-十四碳烯-1-醇乙酸酯、2-壬烯-1醇、(E)-2-壬烯-1醇、9-十六碳烯酸等化合物，這對(duì)后期鑒定和驗(yàn)證大灰象甲性信息素有一定的借鑒意義。

昆蟲性信息素是一類分泌極少的化學(xué)物質(zhì)，這使得微量成分的常規(guī)化學(xué)分析和檢測都很難，僅通過簡單的采集鑒定難以確定性信息素的具體成分[18-20]，要明確大灰象甲的性信息素組分還需要后期改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案、進(jìn)一步進(jìn)行電生理和風(fēng)洞等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與鑒定。

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