李文旭，常 陽，楊 攀，王美芳，何盛蓮，吳政卿，雷振生，晁岳恩

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南鄭州450002）

鄭麥366α-醇溶蛋白基因的克隆及生物信息學(xué)分析

李文旭，常 陽，楊 攀，王美芳，何盛蓮，吳政卿，雷振生，晁岳恩*

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，河南鄭州450002）

為研究優(yōu)質(zhì)強筋小麥品種鄭麥366α-醇溶蛋白的組成，應(yīng)用簡并引物進行PCR擴增，從鄭麥366中擴增得到13條核苷酸序列，其中9條序列推導(dǎo)的氨基酸序列具有完整的開放閱讀框。進一步分析顯示，克隆的9個基因（分別命名為ZM366-1—ZM 366-9）編碼的蛋白質(zhì)均具有α-醇溶蛋白的典型結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)T-細胞毒性抗原表位數(shù)目和多聚谷氨酰胺區(qū)特征分別將ZM366-1、ZM 366-2定位到6A染色體，ZM 366-3、ZM366-4定位到6D染色體，ZM 366-5—ZM 366-9定位到6B染色體。蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，克隆的9個α-醇溶蛋白都僅含有α-螺旋結(jié)構(gòu)，其中B基因組α-醇溶蛋白的α-螺旋含量明顯高于其他基因組。同源系統(tǒng)進化樹分析表明，克隆的9個α-醇溶蛋白具有明顯的基因組特異性。

小麥；α-醇溶蛋白；克?。簧镄畔W(xué)

小麥醇溶蛋白和麥谷蛋白共同作用決定著面粉的加工品質(zhì)，其中醇溶蛋白主要影響面團的延展性和黏性［1］。根據(jù)在酸性聚丙烯酰胺凝膠中遷移率不同，小麥醇溶蛋白分為α、β、γ和ω4個組分［2］。根據(jù)N-端序列不同，小麥醇溶蛋白又可分為α-型、γ-型、ω型，其中α-和β-醇溶蛋白在氨基酸序列上極為相似，通常統(tǒng)稱為α-或α/β-醇溶蛋白，α-醇溶蛋白在種子內(nèi)最為豐富，其含量占種子總蛋白質(zhì)的15%～30%［3-4］。因此，分離小麥α-醇溶蛋白并研究其功能對于小麥優(yōu)質(zhì)育種和改良面粉加工品質(zhì)有重要意義。研究表明，α-醇溶蛋白主要由位于第6部分同源染色體短臂上的Gli-2位點編碼［5］。普通小麥中α-醇溶蛋白基因的拷貝數(shù)為25～150個，但是50%以上的基因被認為是假基因［4，6］。典型的α-醇溶蛋白包括19～20個氨基酸的信號肽和5個結(jié)構(gòu)域，蛋白質(zhì)間的差異主要來源于重復(fù)區(qū)和多聚谷氨酰胺區(qū)［7］。小麥α-醇溶蛋白基因的缺失或沉默會導(dǎo)致面筋韌性增強、延展性增加和彈性降低等［8-9］。摻粉試驗結(jié)果表明，添加典型的α-醇溶蛋白能降低面筋強度，而添加含有1個半胱氨酸的α-醇溶蛋白能夠增加面筋彈性，但是面筋強度的變化并不一致［10-11］。

乳糜瀉癥（celiac disease，CD）是患者對小麥、燕麥、大麥中的面筋蛋白產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)而引發(fā)的炎癥［12］。小麥α-醇溶蛋白內(nèi)存在多種肽段與CD誘發(fā)有關(guān)，其中T-細胞毒性抗原表位glia-α2、gliaα9、glia-a20和glia-a是已知的主要誘發(fā)因子；此外，其他多種短肽也與CD發(fā)生有關(guān)［4，13］。研究還發(fā)現(xiàn)，T-細胞毒性抗原表位分布可用于α-醇溶蛋白基因的基因組定位［13］。

目前，在普通小麥及其近緣種中已經(jīng)克隆得到大量α-醇溶蛋白基因［14-17］，但是有關(guān)優(yōu)質(zhì)小麥α-醇溶蛋白的研究還不多，主要集中于鄭麥004、藁城8901、中優(yōu)9507［15，17］，優(yōu)質(zhì)小麥除已知的高低分子量優(yōu)質(zhì)亞基外，是否還存在優(yōu)質(zhì)醇溶蛋白尚不明確。為此，以優(yōu)質(zhì)面包專用型小麥品種鄭麥366為材料，采用同源克隆的方法分離α-醇溶蛋白基因，并對分離的基因序列進行分析，以期為α-醇溶蛋白功能研究和小麥品質(zhì)遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

小麥品種鄭麥366由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所選育保存，2015年播種于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所溫室，種子出苗2周后備用。

1.2 基因組DNA提取和α-醇溶蛋白基因的克隆

小麥基因組DNA的提取采用CTAB法［18］，基因組DNA經(jīng)過RNase處理后，將質(zhì)量濃度調(diào)整到50μg/μL，備用。參考Xie等［17］的研究報道合成1對引物gliα-F（5′-ATGAAGACCTTTCTCATCCTTG-3′）和gliα-R（5′-TCAGTTRGTACCRAAGAT GCC-3′），用于擴增α-醇溶蛋白基因。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。選用TaKaRa公司的LA Taq進行PCR擴增。擴增程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后回收，純化目的片段，隨后將目的片段克隆到pMD18-T載體（TaKaRa，大連），并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。通過藍白斑篩選陽性克隆，經(jīng)菌落PCR、酶切驗證后送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.3 序列分析、CD毒性肽識別和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

應(yīng)用FGENESH在線軟件進行基因結(jié)構(gòu)分析和氨基酸序列預(yù)測。利用Bioedit 7.0軟件將克隆的α-醇溶蛋白與鄭麥004、藁城8901、中優(yōu)9507的典型序列進行比對［15，17］。根據(jù)van Herpen等［13］的方法識別克隆基因所編碼的4種主要的T-細胞毒性抗原表位，同時分析LGQGSFRPSQQN和LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽的分布［4］。利用Phyre 2和PSIPRED在線預(yù)測軟件對α-醇溶蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載烏拉爾圖小麥（Triticum urartu，AA）、擬斯卑爾脫山羊草（Aegilops speltoides，BB）和粗山羊草（Aegilops tauschii，DD）的α-醇溶蛋白序列，采用MEGA 6.0軟件，應(yīng)用N-J法構(gòu)建本研究克隆得到的α-醇溶蛋白的系統(tǒng)進化樹，Bootstrap值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 鄭麥366α-醇溶蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

以鄭麥366基因組DNA為模板，通過PCR擴增獲得長度約1 000 bp的片段（圖1）。將目的片段連接到pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。PCR擴增和酶切鑒定后，隨機挑取30個陽性克隆進行全長測序。測序結(jié)果表明，共得到13條非重復(fù)序列，序列長度為849～903 bp。核苷酸序列比對顯示，克隆得到的13條核苷酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的α-醇溶蛋白同源性為91%～99%。通過FGENESH在線軟件預(yù)測顯示，10條序列具有完整的開放閱讀框，且不存在內(nèi)含子，推導(dǎo)的氨基酸序列長度為287～300個，其中2條序列推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同，還有3條核苷酸序列分別在103、214、352 bp處出現(xiàn)C→T的變化，提前出現(xiàn)終止密碼子，被認為是假基因。因此，共獲得9個氨基酸序列特異性α-醇溶蛋白基因，分別命名為ZM366-1—ZM366-9。

2.2 鄭麥366α-醇溶蛋白氨基酸序列和CD毒性肽分析

與已報道的鄭麥004（ZM0004）、藁城8901（GC 8901）、中優(yōu)9507（ZY9507）的α-醇溶蛋白進行多重序列比對（圖2A）發(fā)現(xiàn)，鄭麥366的9個α-醇溶蛋白均具有α-醇溶蛋白典型結(jié)構(gòu)特征：1個信號肽、1個N-端重復(fù)區(qū)、2個特征區(qū)、2個多聚谷氨酰胺區(qū)，并且每個α-醇溶蛋白都含有6個半胱氨酸。α-醇溶蛋白間的差異主要來源于多聚谷氨酰胺區(qū)和N-端重復(fù)區(qū)。在2個多聚谷氨酰胺區(qū)，其中多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)含有14～22個谷氨酰胺，多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)含有7～27個谷氨酰胺；在N-端重復(fù)區(qū)，ZM366-2存在一段氨基酸序列為SLGQQQP的短肽插入，明顯不同于其他α-醇溶蛋白。此外，ABD基因組來源的α-醇溶蛋白在N-端重復(fù)區(qū)、特征區(qū)等存在氨基酸位點的多態(tài)性（圖2A），其多態(tài)性主要來源于ABD基因組α-醇溶蛋白基因核苷酸序列的顛換和轉(zhuǎn)換（表1）。

分析CD誘發(fā)因子發(fā)現(xiàn)，克隆得到的鄭麥366的9個α-醇溶蛋白基因中，僅ZM366-1和ZM366-2編碼的蛋白質(zhì)中存在LGQGSFRPSQQN毒性肽，而LGQQQPFPPQQPYPQPQ毒性肽只出現(xiàn)在ZM366-1編碼的蛋白質(zhì)中（圖2A）。進一步分析（表2）顯示，4種T-細胞毒性抗原表位在9個α-醇溶蛋白基因中的分布存在差異，其中ZM366-1和ZM366-2編碼蛋白質(zhì)中均僅含有1個T-細胞毒性抗原表位Glia-α20，它們編碼蛋白質(zhì)的多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)谷氨酰胺數(shù)量均為19個，略高于其他基因（除ZM 366-6外），表明ZM 366-1和ZM366-2來源于6A基因組；ZM 366-5和ZM 366-6編碼蛋白質(zhì)均僅含有1個T-細胞毒性抗原表位Glia-α，而ZM 366-7、ZM 366-8和ZM 366-9編碼蛋白質(zhì)均不含有任何T-細胞毒性抗原表位，并且ZM366-5—ZM366-9的多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)谷氨酰胺數(shù)量為17～27個，明顯高于其他α-醇溶蛋白基因，表明ZM366-5—ZM366-9來源于6B基因組；ZM366-3和ZM 366-4編碼蛋白質(zhì)都含有Glia-α2、Glia-α9和Glia-α20三種T-細胞毒性抗原表位，且數(shù)量均為1，它們的多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)和多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)谷氨酰胺數(shù)量分別為15個和12個，介于其他α-醇溶蛋白基因之間，表明它們來源于6D基因組。

利用Phyre 2在線預(yù)測軟件對推導(dǎo)的α-醇溶蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，克隆得到的9個α-醇溶蛋白基因編碼蛋白質(zhì)都僅含有α-螺旋，其含量介于21%～48%，其中B基因組來源的α-醇溶蛋白α-螺旋含量明顯高于其他基因組（表2）。采用PSIPRED在線軟件分析上述α-醇溶蛋白同樣只檢測到α-螺旋。進一步分析的結(jié)果顯示，α-螺旋在α-醇溶蛋白中的分布相對保守，主要出現(xiàn)在特征區(qū)和多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)，其中B基因組α-醇溶蛋白的α-螺旋更為連續(xù)，同時其多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)谷氨酰胺數(shù)量高于其他基因組，所以其α-螺旋長度更長（圖2A、2B），這也解釋了B基因組α-醇溶蛋白的α-螺旋含量高于其他基因組的原因。

2.3 鄭麥366α-醇溶蛋白的系統(tǒng)進化分析

為明確克隆得到的鄭麥366的α-醇溶蛋白基因與普通小麥祖先種二倍體小麥的親緣關(guān)系，在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載得到45個烏拉爾圖小麥、18個擬斯卑爾脫山羊草和49個粗山羊草α-醇溶蛋白序列。應(yīng)用MEGA 6.0軟件，采用N-J法構(gòu)建它們與本研究克隆得到的9個鄭麥366α-醇溶蛋白序列的系統(tǒng)進化樹。圖3顯示，所有的α-醇溶蛋白可分為3類，GroupⅠ主要包含烏拉爾圖小麥的α-醇溶蛋白，此外，還含有5個粗山羊草和2個擬斯卑爾脫山羊草α-醇溶蛋白；GroupⅡ主要包含粗山羊草的α-醇溶蛋白，同時還包括6個擬斯卑爾脫山羊草α-醇溶蛋白，GroupⅠ和GroupⅡ可以進一步聚為一類，這表明兩者的親緣關(guān)系更近。GroupⅢ含有10個擬斯卑爾脫山羊草、10個粗山羊草和2個烏拉爾圖小麥α-醇溶蛋白，組內(nèi)擬斯卑爾脫山羊草和粗山羊草進一步聚為多個亞類，這表明它們有緊密的遺傳進化關(guān)系。在3類中都存在擬斯卑爾脫山羊草，這表明其在進化過程中存在著廣泛的變異。ZM 366 -1、ZM366-2和ZM366-3、ZM366-4分別聚類于GroupⅠ和GroupⅡ組，具有明顯的基因組來源特異性；而ZM 366-5、ZM 366-6、ZM 366-7、ZM366-8、ZM366-9分布于GroupⅢ組，與擬斯卑爾脫山羊草聚于1個亞組。

3 討論

研究表明，α-醇溶蛋白中存在的T-細胞毒性抗原表位是誘發(fā)CD的重要原因。本研究克隆的來源于A、B、D基因組的α-醇溶蛋白分別含有1、0～1、3個T-細胞毒性抗原表位。分析藁城8901、中優(yōu)9507、鄭麥004和中國春及其代換系的α-醇溶蛋白發(fā)現(xiàn)，A、B、D基因組的α-醇溶蛋白分別含2、0、1～5個T-細胞毒性抗原表位［15-17］。van Herpen等［13］研究發(fā)現(xiàn)，A、B、D基因組的祖先種二倍體小麥分別含0～2、0～1、1～5個T-細胞毒性抗原表位。以上研究表明，α-醇溶蛋白的T-細胞毒性抗原表位在品種間存在多態(tài)性。因此，可以通過傳統(tǒng)遺傳育種或人工合成小麥等方式優(yōu)化小麥ABD基因組內(nèi)α-醇溶蛋白的組合，培育低或者缺失T-細胞毒性抗原表位的優(yōu)質(zhì)小麥，從而降低CD發(fā)生風(fēng)險。

Masci等［19］研究低分子量麥谷蛋白的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，重復(fù)區(qū)中高比例的谷氨酰胺與面團的延展性有關(guān)。本研究克隆的鄭麥366的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺數(shù)量介于7～27個，與前人研究結(jié)果類似［17］。然而，有報道顯示，二倍體小麥α-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺Ⅰ區(qū)谷氨酰胺的數(shù)量可以達到66個［15］，這可能是由于發(fā)生不等交換或者基因轉(zhuǎn)換所致［20］。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，鄭麥366 B基因組來源的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)谷氨酰胺是連續(xù)的，而藁城8901和中優(yōu)9507 B基因組來源的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺Ⅱ區(qū)存在亮氨酸、谷氨酸等的替換，這可能是由于編碼谷氨酰胺的密碼子CAA/CAG發(fā)生突變導(dǎo)致。研究發(fā)現(xiàn)，二倍體小麥的α-醇溶蛋白多聚谷氨酰胺區(qū)存在更為廣泛的氨基酸替換現(xiàn)象［21］。多聚谷氨酰胺區(qū)谷氨酰胺的氨基酸替換和數(shù)量變化對α-醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)、功能以及小麥加工品質(zhì)的影響目前還未見報道。利用X射線晶體成像技術(shù)分析富含谷氨酰胺的亨廷頓蛋白發(fā)現(xiàn)，多聚谷氨酰胺受蛋白質(zhì)側(cè)翼序列構(gòu)象、溫度和離子等因素影響會形成α-螺旋、無規(guī)則卷曲和擴展環(huán)等不同的構(gòu)象［22］。此外，有報道稱富含多聚谷氨酰胺的蛋白質(zhì)容易聚集在一起［23］，而聚集狀態(tài)的多聚谷氨酰胺通常呈β-折疊結(jié)構(gòu)［24］，這表明小麥α-醇溶蛋白的多聚谷氨酰胺區(qū)可能存在復(fù)雜的構(gòu)象變化。

由于小麥醇溶蛋白結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和無序性，對其結(jié)構(gòu)的了解還十分有限。通過小角度X射線散射對小麥醇溶蛋白進行研究發(fā)現(xiàn)，它們?yōu)闄E圓形結(jié)構(gòu)［25］。采用傅里葉變換紅外光譜法分析顯示，正常條件下小麥醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)富含α-螺旋，但是在高溫和添加化學(xué)伴侶甘油的條件下其α-螺旋和β-折疊數(shù)量顯著增加；通過小角度X射線散射分析表明，其四級結(jié)構(gòu)為六方密堆積結(jié)構(gòu)［26］。Xie等［17］應(yīng)用PSIPRED軟件預(yù)測普通小麥和二倍體小麥α-醇溶蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋和β-折疊普遍存在于α-醇溶蛋白中，其含量分別為16.5%～29.4%和3.4%～9.7%。Li等［15］同樣采用PSIPRED軟件分析198個α-醇溶蛋白發(fā)現(xiàn)，約68%的α-醇溶蛋白同時含有α-螺旋和β-折疊，且β-折疊的數(shù)量為1～2個，低于Xie等［17］的研究結(jié)果（2～8個），其他α-醇溶蛋白僅含有α-螺旋。本研究利用Phyre 2和PSIPRED在線預(yù)測軟件對α-醇溶蛋白進行二級結(jié)構(gòu)分析，得出與Li等［15］類似的結(jié)論，克隆的9個α-醇溶蛋白都僅含有α-螺旋，其含量介于30%～48%。對α-醇溶蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果不同的可能原因一方面是軟件程序算法不同，另一方面是由于α-醇溶蛋白難以獲得晶體結(jié)構(gòu)，因此，僅能根據(jù)其他蛋白質(zhì)或肽段結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，導(dǎo)致結(jié)果可信度不高。

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Cloning and Bioinformatic Analysis ofα-gliadin Genes in Zhengmai366

LIWenxu，CHANG Yang，YANG Pan，WANG Meifang，HE Shenglian，WU Zhengqing，LEI Zhensheng，CHAO Yueen*
（Institute ofWheat Research，Henan Academ y of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China）

To reveal the composition ofα-gliadin protein in high quality and strong gluten wheat variety Zhengmai 366，the PCR amp lification were app lied to cloneα-gliadin genes in Zhengmai 366 with degenerate primers.In total，13 nucleotide sequences were amp lified，while the deduced amino acid sequences of nine encoded comp lete open reading frames.Further analysis showed that the cloned genes（named as ZM 366-1—ZM366-9 respectively）had the typical characteristics ofα-gliadin.According to the number of T cell stimulatory toxic epitopes and the characteristics of polyglutamine domain，ZM366-1 and ZM366-2，ZM 366-3 and ZM 366-4 and ZM366-5—ZM 366-9 were localized to the 6A，6D and 6B chromosome respectively.Secondary structure prediction showed that all the nineα-gliadin cloned in the present study only containedα-helix structure，and the content ofα-helix was significantly higher inα-gliadin of B genome than that of others.Phylogenetic tree analysis showed that the clonedα-gliadin of present study had obvious genomic specificity.

wheat；α-gliadin；cloning；bioinformatic analysis

S512

A

1004-3268（2017）01-0013-07

2016-09-28

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（31501382）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年基金項目（2013YQ02）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新基金項目（2016ZC07）

李文旭（1982-），男，內(nèi)蒙古赤峰人，助理研究員，博士，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：tinbingye@163.com

*通訊作者：晁岳恩（1974-），男，河南濮陽人，副研究員，博士，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail：nkychaoyueen@153.com