劉姬欒++閔偉恩++林麗萍

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.107

摘要：為驗證熱水處理贛南臍橙預防贛南臍橙青霉病害的有效性，對熱水與臍橙皮共同處理對意大利青霉孢子致死作用進行了研究，以不加贛南臍橙皮的同樣熱水處理的意大利青霉孢子為對照，采用平板菌落計數(shù)法檢測霉菌孢子死亡率；用蝸牛酶去除霉菌孢子壁制備原生質(zhì)體，經(jīng)Hoechst 33342/PI雙熒光染色法染色，檢測霉菌孢子細胞膜損傷程度。結果顯示，55 ℃ 8 min處理組的霉菌孢子死亡率為（88±2.12）%，對照組霉菌孢子死亡率為（60±2.78）%；熒光染色結果顯示熱處理組有更多的原生質(zhì)體細胞膜受到了破壞。試驗結果說明，熱水與贛南臍橙皮成分對意大利青霉孢子有協(xié)同抑殺作用。

關鍵詞：贛南臍橙皮；熱水處理；意大利青霉孢子；致死作用

中圖分類號：TS205 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2016）10-0367-02

收稿日期：2015-11-29

基金項目：江西省教育廳青年基金（編號：GJJ14315）；江西農(nóng)業(yè)大學大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（編號：201410410043）。

作者簡介：劉姬欒（1992—），女，江西吉安人，碩士研究生，研究方向為食品科學。E-mail：349401861@qq.com。

通信作者：林麗萍，碩士，講師，主要從事食品微生物方向的教學與研究。E-mail：jialin1543@163.com。柑橘采后極易遭受意大利青霉與指狀青霉污染，引起柑橘青、綠霉病害[1]，這2種霉菌繁殖速度非?？?，正常自然條件下，它們主要靠產(chǎn)生大量的無性孢子進行繁殖。熱處理（35～55 ℃）這種物理保鮮方法，可延長采后果蔬的貨架期[2]，還可以適當調(diào)整果肉品質(zhì)，增加一定糖分[3]，因其無污染、無殘留、安全環(huán)保等特點而受到越來越廣泛的關注[4-5]。熱處理包括熱水處理、熱空氣處理和蒸汽加熱法[6]。熱水沉浸處理相較于熱空氣保鮮處理，操作更簡便，方法更易獲得，所以試驗選熱水處理為研究方法。

前期試驗結果證明熱水與贛南臍橙皮共同處理柑橘青霉孢子可降低其生活力[7]。所以，熱與橙皮共同作用可能會對霉菌孢子結構造成損傷。細胞死亡或者壞死是正常的細胞受到各種損傷或者細菌病毒的感染導致的不正常死亡，是病理性的，會有細胞壁破裂、內(nèi)含物外泄的現(xiàn)象，是由外界條件引起的。熒光Hoechst 33342/PI雙染色試劑染色法，結合了細胞膜通透低毒的Hoechst 33342染料與無法進入正常細胞膜的PI核熒光染料，可以準確判斷熱水處理是否破壞霉菌細胞膜的完整性。為去除細胞壁障礙，試驗選用具有代表性的酶用量為研究霉菌孢子去壁的條件，優(yōu)選出適合的酶用量。

本試驗以對環(huán)境耐受性更好的意大利青霉孢子為研究對象，采用熱水與贛南臍橙皮共同處理意大利青霉孢子，平板菌落計數(shù)法檢測其死亡率及Hoechst 33342/PI雙染色法檢測細胞膜的結構完整性，探究熱水與贛南臍橙皮共同處理對意大利青霉的致死作用，為揭示熱處理抑殺柑橘青霉病原菌的機制提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病原菌意大利青霉（Penicillium italicum）為江西農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室保存菌種。

1.1.2贛南臍橙紐荷爾臍橙。果實大小、成熟度均勻一致，表皮完好，無傷口。

1.1.3主要培養(yǎng)基及試劑PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，瓊脂20 g，pH值自然，121 ℃滅菌 20 min。作病原菌的活化、培養(yǎng)及計數(shù)用。

蝸牛消化酶（90 U/g，上海研域生物科技有限公司）；Hoechst33342/PI雙染色試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.1.4主要儀器自動立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-40B型，上海申安醫(yī)療器械廠）；生化培養(yǎng)箱（SHP-160型，上海三發(fā)科學儀器有限公司）；水浴恒溫振蕩器（SHY-2型，金壇市精達儀器制造廠）；數(shù)顯恒溫循環(huán)水浴鍋（HH-6型，國華電器有限公司）；漩渦混合器（Vortex-Genie2型，上海琪特分析儀器有限公司）；高速冷凍離心機（HC-2518R型，安徽中科中佳學儀器有限公司）；熒光顯微鏡（ZEISS Ver.A1型，德國卡爾蔡司光學儀器公司）；數(shù)碼生物顯微鏡（BK5000型，重慶奧特光學儀器有限責任公司）。

1.2試驗方法

1.2.1意大利青霉孢子懸液制備刮取經(jīng)過活化復壯[8-9]的意大利青霉菌，轉(zhuǎn)入加有玻璃珠和50 mL無菌水的250 mL三角瓶中，充分振蕩，菌懸液經(jīng)2～3層的無菌擦鏡紙過濾于另一個無菌三角瓶中，得到霉菌孢子懸液，用血球計數(shù)板直接計數(shù)，對孢子懸浮液進行適當?shù)奶荻认♂專ＷC懸液孢子濃度為n×108個/mL（n<10）。

1.2.2意大利青霉孢子熱水處理方法用涼開水清洗新鮮橙子，用次氯酸對其表面消毒并清洗。橙子瀝干水后，用 3 mm 無菌打孔器獲得大小均勻的橙皮。處理組：將20片臍橙皮加入到新制備的10 mL霉菌孢子懸液中，將加橙皮的菌懸液放入不同溫度水浴鍋，同時做溫度指示，待溫度指示達到處理溫度，開始計時，然后移出至冰浴，使溫度降至10 ℃以下。不加贛南臍橙皮的同樣熱水處理的意大利青霉孢子為對照組，檢測霉菌孢子死亡率并進行熒光染色。

1.2.3意大利青霉孢子去壁條件研究取未加臍橙皮熱水處理后的霉菌孢子懸液5 mL，8 000 r/min離心8 min，去除上清液，加入滲透壓穩(wěn)定劑（0.1 mol /L pH值5.5～6.0磷酸緩沖液配制0.7 mol/L NaCl）5 mL，分別加蝸牛酶液（10 mg/mL，以滲透壓穩(wěn)定劑配制）15、35、55、75 μL，置恒溫振蕩器50～60 r/min、33 ℃振蕩酶解3 h[10]。觀察酶解后孢子形態(tài)的變化，并記錄。以未進行熱處理的霉菌孢子懸液為對照組。

1.2.4熱水與臍橙皮處理的意大利青霉孢子死亡率將熱水處理后的霉菌孢子懸液做梯度稀釋，用移液槍分別取菌懸液200 μL于PDA平板上，涂勻，放入30 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h左右，待霉菌長至清晰可見時，觀察并記錄霉菌孢子菌落數(shù)，計算其死亡率。

死亡率 = （未熱處理平板菌落數(shù)-熱處理平板菌落數(shù)）/未熱處理平板菌落數(shù)×100%（相同稀釋倍數(shù)下）

1.2.5熱水與臍橙皮處理的意大利青霉孢子原生質(zhì)體熒光染色取熱水處理的霉菌孢子懸液，加入一定量的蝸牛酶液，放置于恒溫振蕩器50～60 r/min、33 ℃振蕩酶解3 h。按Hoechst 33342/PI雙熒光染色試劑盒步驟對原生質(zhì)體染色，取1滴染色后的原生質(zhì)體懸液于載玻片，熒光顯微鏡觀察。

2結果與分析

2.1霉菌孢子去壁條件的研究

由圖1可見，當蝸牛酶液用量為35 μL時，開始產(chǎn)生一定量的原生質(zhì)體，蝸牛酶液用量達到55 μL時，產(chǎn)生大量原生質(zhì)體，蝸牛酶液用量為75 μL時，出現(xiàn)了酶解過度現(xiàn)象，產(chǎn)生了很多變形增大的原生質(zhì)體。熱處理與未熱處理對照組，蝸牛酶去壁效果沒有顯著性差異，說明熱處理對于蝸牛酶解條件沒有影響，所以后續(xù)試驗霉菌孢子去壁蝸牛酶用量選擇 55 μL。

2.2熱水與臍橙皮對意大利青霉孢子死亡率的影響

由圖2可見，加了臍橙皮熱水處理組的意大利青霉孢子死亡率明顯高于對照組孢子死亡率。55 ℃、8 min處理霉菌孢子死亡率最高，處理組孢子死亡率為（88±2.12）%，對照組孢子死亡率為（60±2.78）%。

2.3熱水與臍橙皮處理對意大利青霉孢子細胞膜的影響

試驗以熱致死效率最高的55 ℃、8 min熱處理條件，進一步研究熱水與臍橙皮對意大利青霉孢子細胞膜的影響。對熱處理后的意大利青霉孢子原生質(zhì)體熒光雙染色后，從結果可以看出，對照組的原生質(zhì)體熒光染色中有大量藍色熒光（圖3-A），說明霉菌孢子原生質(zhì)體還保持一定活性或逐漸走向凋亡；處理組的原生質(zhì)體出現(xiàn)大量紅色熒光（圖3-B），說明經(jīng)過熱處理霉菌孢子多數(shù)已經(jīng)走向死亡，成壞死細胞。綜合霉菌孢子死亡率結果，說明熱水與贛南臍橙皮對意大利孢子有協(xié)同抑殺作用。

3結論與討論

現(xiàn)有文獻對于霉菌去壁研究大多是針對霉菌營養(yǎng)體的，而本試驗所用孢子材料與營養(yǎng)體不同。蝸牛酶的用量是去壁條件的決定性因素，所以優(yōu)選這個條件作為去壁依據(jù)。而優(yōu)化霉菌孢子去壁條件，除了本試驗考慮蝸牛酶液量，還可以從霉菌的菌齡、酶解時間、酶解溫度、酶解菌量等因素考慮，結合這些因素得到更完整的去壁最優(yōu)條件，值得后期繼續(xù)探索。

熒光染料Hoechst 33342能少許進入正常細胞膜，使其染上淺藍色，而凋亡細胞膜通透性增加，因此進入凋亡細胞的Hoechst 33342比正常細胞多，熒光強度要比正常細胞高。而PI染料不能進入細胞膜完整的正常細胞和凋亡細胞中，即活細胞對PI拒染，而壞死細胞由于膜完整性在早期即已被破壞，可被PI染料染色。根據(jù)這些特點，用Hoechst 33342結合

PI染料對凋亡細胞雙染色，可以進一步借助于流式細胞儀的散點圖將正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞進行定量。

本試驗在沒有流式細胞儀的情況下，采用了簡便易行的定量方法——平板菌落計數(shù)法，測定熱處理后霉菌孢子的死亡率，結合熒光染色結果，充分證明了熱水與臍橙皮共同處理破壞了霉菌孢子的細胞膜結構，徹底造成了大部分霉菌孢子死亡。后續(xù)將進一步研究該熱處理條件對贛南臍橙品質(zhì)的影響，深入研究熱處理抑制意大利青霉的具體機制，期望能夠更全面地了解贛南臍橙熱處理保鮮機制。

參考文獻：

[1]Brown G E，Dezman D J. Uptake of imazalil by cirus fruit after postharvest application and the effect of residue distribution on sporulation of Penicillium digitatum[J]. Plant Disease，1990，74：927-930.

[2]孔祥佳，鄭峻峰，林河通，等. 熱處理對果蔬貯藏品質(zhì)和采后生理的影響及應用[J]. 包裝與食品機械，2011，29（3）：34-39.

[3]王貴元，夏仁學，曾祥國，等. 不同溫度儲藏紅肉臍橙果肉主要色素和糖含量的變化及其相關性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學報，2007，16（3）：180-183.

[4]Yehoshua S B. Environmentally friendly technologies for agricultural produce quality[M]. Flordia，US：CRC Press，2005：11-34.

[5]呂紀增. 水果熱處理保鮮正被關注[J]. 北京農(nóng)業(yè)，2005（11）：28-29.

[6]王青云，龔吉軍，鐘海雁. 柑橘果實采后熱處理研究進展[J]. 食品科學，2010，31（11）：316-319.

[7]林麗萍，陳于隴，朱麗琴，等. 熱處理對柑橘霉菌生活力和致病力的影響[J]. 現(xiàn)代食品科技，2015，31（4）：42-45.

[8]劉慧. 現(xiàn)代食品微生物學實驗技術[M]. 中國輕工業(yè)出版社，2013：30-36.

[9]王公坤. 不同條件對產(chǎn)黃青霉菌原生質(zhì)體制備率與再生率的影響[J]. 科技資訊，2013（10）：123.

[10]張延新，劉開啟，夏振遠，等. 淡紫擬青霉菌IPC菌株原生質(zhì)體形成和再生條件[J]. 植物學報，2005，31（5）：42-45.