高學(xué)金+李嬌+呂昕雨+王普

摘 要 針對酶注射式葡萄糖生物傳感器在實際使用中因為標(biāo)定液與被測液的溫度不同而引起的測量結(jié)果不準確問題，提出一種基于溫度的葡萄糖濃度檢測方法。首先根據(jù)酶促反應(yīng)動力學(xué)建立目前酶注射式葡萄糖生物傳感器濃度檢測模型，之后利用阿倫尼烏斯公式建立溫度與濃度檢測動力學(xué)模型中未知參數(shù)之間的關(guān)系，并將此關(guān)系代入濃度檢測動力學(xué)模型中， 以建立基于溫度的濃度檢測新模型。此模型以溫度與酶促反應(yīng)的電流初始斜率為輸入值，以被測葡萄糖濃度為輸出值，利用此模型提出了以反應(yīng)混合液的溫度和反應(yīng)初始電流斜率推導(dǎo)被測液濃度的檢測方法。利用改進的檢測方法進行檢測，不僅能夠降低溫差的影響，提高檢測的準確性，還可以省略常規(guī)檢測中的人工標(biāo)定，避免人工標(biāo)定所需的取樣探頭拆卸步驟，更加有利于在線使用。分別在25.0， 30.0和42.0℃下檢測1.5 mg/mL和2.5 mg/mL葡萄糖溶液，利用原檢測方法與基于溫度的檢測方法進行檢測，結(jié)果表明，基于溫度的檢測方法回收率均在95.0%以上，明顯優(yōu)于原檢測方法。

關(guān)鍵詞 溫度； 葡萄糖； 生物傳感器

1 引 言

在發(fā)酵業(yè)中，葡萄糖作為發(fā)酵液的主要碳源，其用量直接影響產(chǎn)品質(zhì)量，所以對發(fā)酵液中葡萄糖濃度的檢測是十分必要的[1]。酶類生物傳感器的諸多優(yōu)點使其廣泛應(yīng)用于發(fā)酵過程中葡萄糖濃度的檢測。葡萄糖生物傳感器多為固定化酶電極[2～4]，由于發(fā)酵工藝的高溫蒸汽滅菌過程使固定化酶生物傳感器無法在線使用。本研究組在前期研究中提出了一種用“酶液”代替固定態(tài)“酶膜”的方法，并研制出采用酶注射結(jié)構(gòu)的葡萄糖生物傳感器，可基本滿足實際需求，但是還存在檢測時間過長的問題[5，6]。2015年，本研究組對此類生物傳感器進行機理建模，建立了酶注射式葡萄糖生物傳感器的機理模型，此模型表述了整個反應(yīng)的機理，同時也對檢測方法提供了機理模型[7]，為改進檢測算法、降低檢測時間提供了理論基礎(chǔ)。

酶注射式生物傳感器主要針對發(fā)酵領(lǐng)域中葡萄糖濃度的檢測，其檢測步驟為：首先利用葡萄糖標(biāo)準液進行標(biāo)定，再對發(fā)酵液中的葡萄糖濃度進行檢測。但是生物傳感器易受溫度影響[8～10]，在實際測量時，由于發(fā)酵液的溫度是變化的，且通常與室溫狀態(tài)下的標(biāo)定液溫度不同，導(dǎo)致標(biāo)定結(jié)果不準確，從而使測量結(jié)果產(chǎn)生誤差。而且每次測量都需要標(biāo)定，不僅操作繁瑣，而且也不利于實現(xiàn)在線檢測。

本研究主要針對酶注射式葡萄糖生物傳感器在實際使用中因為標(biāo)定液與被測液的溫度不同而引起的測量結(jié)果不準確問題，利用熱力學(xué)與酶促反應(yīng)動力學(xué)提出一種新的檢測方法。首先利用動力學(xué)建立酶注射式葡萄糖生物傳感器濃度檢測機理模型，再利用阿倫尼烏斯公式建立溫度與動力學(xué)模型中未知參數(shù)之間的關(guān)系，并將此關(guān)系代入該模型中建立基于溫度的濃度檢測新模型，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)通過數(shù)據(jù)擬合確定了基于溫度的濃度檢測模型中的參數(shù)值，得到檢測新模型。利用新模型提出了一種以反應(yīng)混合液的溫度和反應(yīng)初始電流斜率推導(dǎo)葡萄糖濃度的檢測方法。分別利用動力學(xué)模型檢測方法與溫度模型檢測方法進行實驗，檢測結(jié)果表明，基于溫度的檢測方法在溫度變化的情況下具有更好的穩(wěn)定性，檢測準確性也優(yōu)于原檢測方法，同時改進后的檢測方法避免每次測量前人工標(biāo)定所需的拆卸步驟，更加有利于在線使用。

2 濃度檢測動力學(xué)模型建立

酶注射式生物傳感器[5]反應(yīng)池中發(fā)生酶促反應(yīng)，由米氏方程可知，葡萄糖發(fā)生酶促反應(yīng)時，首先生成中間絡(luò)合物，中間產(chǎn)物分解產(chǎn)生H2O2，H2O2在鉑電極處分解產(chǎn)生電子，其反應(yīng)機理：

E+Sk1k

該機理模型中，指數(shù)部分存在的原因是由于在反應(yīng)初始中間絡(luò)合物的逐漸形成而引起的； 但根據(jù)米氏方程，底物與酶發(fā)生反應(yīng)生成中間絡(luò)合物的可逆反應(yīng)會瞬間達到平衡，短時間內(nèi)絡(luò)合物濃度保持不變，使得H2O2的濃度增加速率是不變的，所以可省略指數(shù)部分。H2O2生成速率以線性形式增長，而電子由H2O2分解得到，即電流可表示為I=neD PEFP，其中， ne為反應(yīng)過程中交換電子數(shù)， D PE為H2O2擴散系數(shù)， F為法拉第常數(shù)[7]。故可知其電流變化初始斜率為：

本研究組前期工作中建立的酶注射式葡萄糖生物傳感器檢測方法基于公式（3）所得，稱為動力學(xué)模型檢測方法：首先利用酶注射式葡萄糖生物傳感器得到已知葡萄糖濃度為[S1]、[S2]的兩種標(biāo)準液的反應(yīng)電流初始斜率K1、K2，并利用公式（3）確定濃度檢測動力學(xué)模型中的參數(shù)C和Km； 測量待測液，得到反應(yīng)過程中電流的初始斜率K； 最后將已標(biāo)定的參數(shù)C、Km以及初始斜率K代入公式（3），得到待測液的葡萄糖濃度[S]。簡單概括為：首先利用葡萄糖標(biāo)準液標(biāo)定葡萄糖生物傳感器濃度檢測動力學(xué)模型中的參數(shù)C和Km，之后利用已知模型進行待測液的檢測。

在實際使用中，標(biāo)準液處于室溫狀態(tài)，與發(fā)酵液溫度之間存在溫差。而參數(shù)C和Km中存在反應(yīng)速率k1，k

1，k2，所以C和Km會受溫度的影響。這樣就導(dǎo)致了在存在溫差的情況下，室溫狀態(tài)下標(biāo)定的參數(shù)C和Km并不能用于待測液的檢測。本研究利用溫度改進檢測方法，消除了溫度對測量結(jié)果的影響。

3 基于溫度的濃度檢測模型研究

3.1 基于溫度的濃度檢測模型

式中a、b、lna′， lnb′均為定值，未知量為溫度T以及反應(yīng)初始電流斜率K?；诖四Ｐ停玫礁倪M后檢測方法，稱為溫度模型檢測方法：生物傳感器對待測液葡萄糖濃度進行檢測，得到反應(yīng)的初始電流斜率K′； 與此同時，通過反應(yīng)池中的溫度傳感器得到混合液的溫度T′； 之后利用公式（6）將得到的初始斜率K′與T′同時代入，以得到被測葡萄糖濃度[S′]。

3.2 基于溫度的濃度檢測模型參數(shù)測定

3.2.1 實驗設(shè)計 為確定公式（6）中的參數(shù)a、b、lna′、lnb′，設(shè)計如下實驗：

實驗原理：利用公式（4）、（5）可以分別得到C和Km與溫度T的另一種關(guān)系表達式： lnC=b′T+lna′、lnKm=bT+lna。由此可知， lnC與lnKm分別與1T成比例關(guān)系。首先在不同溫度下利用酶注射式葡萄糖生物傳感器得到不同葡萄糖糖濃度的反應(yīng)初始斜率； 再利用公式（3）得到不同溫度下的動力學(xué)模型參數(shù)C和Km； 分別對lnC＼，lnKm與1T進行數(shù)據(jù)擬合，最終得到a、b、lna′＼，lnb′的值。

3.2.2 儀器與試劑 酶注射式葡萄糖生物傳感器（自制）； 金屬浴加熱器（一恒 TU.100C）； 不同濃度葡萄糖溶液（分析滴定用標(biāo)準溶液）； 葡萄糖氧化酶（Solarbio）； 緩沖液（山東省科學(xué)院生物研究所）。

3.2.3 實驗方法 根據(jù)北京某發(fā)酵廠數(shù)據(jù)可知，一般發(fā)酵液溫度約為30℃，其中個別發(fā)酵過程因工藝要求會出現(xiàn)溫度略高于40℃的情況。為了盡可能包含實際生產(chǎn)中多種發(fā)酵工藝的不同溫度要求，本實驗分別在25.0， 30.0， 35.0和40.0℃下利用酶注射式生物傳感器得到葡萄糖濃度為1.5， 2.5和3.0 mg/mL的反應(yīng)初始斜率： 首先利用金屬浴加熱器加熱葡萄糖溶液、葡萄糖氧化酶溶液以及緩沖液到設(shè)定的溫度，以此模擬實際反應(yīng)過程中反應(yīng)池中的溫度，利用酶注射式葡萄糖生物傳感器進行反應(yīng)過程中初始斜率的測量。

3.2.4 模型參數(shù)的測定 表1為在不同的溫度條件下由酶注射式葡萄糖生物傳感器測得的不同濃度的葡萄糖溶液的反應(yīng)斜率。從表1可知，在溫度與葡萄糖溶液濃度不變的情況下，生物傳感器得到的斜率不同，這是由于酶促反應(yīng)產(chǎn)生的電流為nA級別，易受干擾，三電極電路及放大濾波電路設(shè)計不合理造成傳感器穩(wěn)定性差，此處通過多次測量的方式使其相對偏差在3%內(nèi)，以保證檢測結(jié)果的可靠性。

根據(jù)公式（3）推導(dǎo)可得到1[S]=CKm×1K×1Km，利用此方程進行數(shù)據(jù)擬合得到不同溫度下動力學(xué)參數(shù)力學(xué)參數(shù)C（nA/S）與Km （mg/mL）的值，見表2。

4 實驗驗證

4.1 系統(tǒng)檢測流程圖

別泵入到定量環(huán)中進行定量，之后利用緩沖液將其壓入反應(yīng)池中進行反應(yīng)，三電極檢測電路檢測其反應(yīng)初始電流斜率，同時溫度傳感器檢測反應(yīng)池中混合液的溫度，最后將得到的兩參數(shù)傳遞給上位機進行濃度的計算與顯示。

4.2 實驗結(jié)果與分析

利用酶注射式葡萄糖生物傳感器測量濃度為1.5和2.5 mg/mL葡萄糖溶液，得到斜率，并分別用溫度模型檢測方法和動力學(xué)模型檢測方法進行數(shù)據(jù)分析（表3），得到檢測結(jié)果的回收率，回收率表示測量值與真值的接近程度，其計算公式為：P=1-|yi-y|y×100%， 式中，P為回收率， yi為測量得到的葡萄糖濃度值， y為實際葡萄糖濃度值。

用動力學(xué)模型檢測方法進行數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)在室溫下進行標(biāo)定，隨著反應(yīng)時混合液的溫度與標(biāo)定時的溫差增大，測量結(jié)果的回收率逐漸降低； 而用溫度模型檢測方法進行數(shù)據(jù)分析，其回收率檢測結(jié)果會維持在一定范圍內(nèi)，不會隨著溫度的改變而變化，這是由于每次檢測都會根據(jù)溫度重新計算濃度檢測動

力學(xué)模型中的C和Km，降低了溫度對檢測結(jié)果的影響。說明溫度模型檢測方法減小了由溫度變化而引起的誤差，提高了實際測量中測量結(jié)果的回收率，同時減少溫度影響，也增強了其穩(wěn)定性。

驗證結(jié)果表明，當(dāng)溫度改變時，溫度模型檢測方法能較好地維持其檢測結(jié)果的回收率，而動力學(xué)模型檢測方法由于標(biāo)定液與待測液溫度不同使得檢測的精確度受到嚴重影響，說明溫度模型檢測方法能更好地消除溫度引進的誤差，使得測量結(jié)果更加準確、可靠。

5 結(jié) 論

針對應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)中的酶注射式葡萄糖生物傳感器在實際使用時，標(biāo)定液與待測液溫度不同而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確的問題，以及為簡化反復(fù)標(biāo)定的繁瑣步驟，進行實驗研究。通過利用Arrhenius equation建立了溫度與原濃度檢測動力學(xué)模型參數(shù)的關(guān)系，并利用此關(guān)系改進了目前已有的檢測方法，避免了在發(fā)酵領(lǐng)域使用時溫度引起的誤差，同時省略標(biāo)定部分，更加有利于實現(xiàn)發(fā)酵工業(yè)中的自動化控制。通過實驗驗證可得到，基于溫度模型的檢測方法能減小溫度對檢測結(jié)果引起的誤差，同時也增強了此傳感器的穩(wěn)定性，能更好地提升傳感器的性能。將改進后的傳感器直接與發(fā)酵工業(yè)中的發(fā)酵罐相連，獨特的酶注射式結(jié)構(gòu)使得可以忽略高溫滅菌引起的酶失活問題，同時，利用新的檢測方法，更有利于在線檢測、控制補料一體化的發(fā)酵操作系統(tǒng)的實現(xiàn)。

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Abstract To avoid the inaccuracy measurement caused by the different temperature between calibration solution and test solution in actual use of enzyme injection glucose biosensor， a detection method was established for enzyme injection glucose biosensors based on temperature. Firstly， the concentration detection model of the enzyme injection glucose biosensor is established according to enzymatic reaction kinetics. Then， the relationship between the temperature and the unknown parameters in the dynamic model of concentration detection is built using Arrhenius equation， and this relationship is substituted into the original detection dynamics model to establish the new model based on temperature. In this model， the current initial slope of the enzymatic reaction and the temperature are the inputs， and the concentration of glucose is output. Based on this new model， a detection method which is derived by the temperature of the mixture and the slope of the initial current is proposed. The new detection method can not only reduce the impact of temperature difference to improve detection accuracy， but also avoid the removal procedure of sampling probe causing by the calibration before each measurement， and it is more conducive to online use. A comparison was made by detecting the glucose solution with a concentration of 1.5 mg/mL， 2.5 mg/mL at the temperature of 25， 30， and 42℃ using both the original detection method and the new detection method based on temperature. The result shows that the recovery rate of the new method is more than 95.0%， significantly better than that of the original detection method.

Keywords Temperature； Glucose； Biosensor