溫杰冉+黎國梅+謝永平+唐雪玲+吳文奇

[摘要]目的探討加重期和穩(wěn)定期COPD患者在YKIA0水平方面的差異。方法采用ELISA法檢測2013年1月～2014年12月在我所住院的COPD加重期（AECOPD）的患者60例，COPD穩(wěn)定期的患者59例及我所體檢中心正?；颊撸▽φ战M）50例血清中YKL-40的表達(dá)水平。分析COPD患者血清中YKL-40水平與COPD發(fā)病危險因素的相關(guān)性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在對照組、COPD組和AECOPD組血清中YKL-40水平比較中，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），AECOPD組和COPD組血清中YKL-40水平比較顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；AECOPD組血清中YKL-40水平比COPD組血清中的YKL-40水平高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。AECOPD組患者血清YKL-40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P<0.001），與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=-0.525，P=0.003）。COPD組患者血清YKL-40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601，P<0.001），與FEVI%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.466，P=0.009）。結(jié)論COPD患者患病不同時期體內(nèi)YKL40水平不一，對于臨床后續(xù)治療和相關(guān)藥物的使用具有指導(dǎo)意義，值得深入研究。

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是呼吸科較為常見的一類病種，亦稱為慢阻肺，主要能造成肺部損傷，導(dǎo)致不完全可逆的換氣障礙，影響患者自身健康的特征疾病。該疾病的發(fā)生和發(fā)展除了患者自身由于肺損傷而導(dǎo)致的進(jìn)行性疾病變化之外，還與呼吸過程中氣體有害顆粒造成的肺部炎癥有關(guān)。近年來COPD于我國的發(fā)病率呈顯著上升趨勢，而該疾病對于全身系統(tǒng)影響較大，具有較高的致殘率和死亡率。我國40歲以上的患病人群約8.2%。其死亡率在我國死亡率中排第三位，在農(nóng)村地區(qū)死亡率高居首位。目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的COPD的發(fā)生與被動吸煙、職業(yè)因素、生物燃料的燃燒、長期哮喘、營養(yǎng)吸收情況等因素都有關(guān)系。而對于那些非吸煙引發(fā)的COPD患者中，基因則對疾病的發(fā)生有重要作用。綜上所述，COPD的發(fā)生是遺傳因素和環(huán)境因素雙重作用的結(jié)果。

近些年的研究發(fā)現(xiàn)，COPD的發(fā)生還與人軟骨糖蛋白（YKL-40）這種炎癥因子有關(guān)。目前對于YKL-40的具體生物學(xué)功能的研究還不是十分的明確，也許與細(xì)胞分化、增殖等有關(guān)，它還可以對抗細(xì)胞凋亡因子的作用刺激血管生成；還可以參與細(xì)胞外組織從塑，刺激纖維母細(xì)胞生成。所以推測YKL-40是一個參與COPD慢性炎癥的炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測COPD患者急性加重期和穩(wěn)定期患者，對照組患者血清中的YKL-40的水平，進(jìn)一步探討COPD患者血清中YKL-40與病因和病程的關(guān)系。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年1月-2014年12月在我所就診的COPD穩(wěn)定期患者59例，年齡46-75歲，平均（59.3±7.5）歲，其中男26例，女33例。急性加重期（AECOPD）的共選擇60例病患，按性別分類：男31例，女29例，年齡45-72歲，平均（53.3±5.3）歲。對照組患者50例，其中男25例，女25例，年齡44-77歲，平均（59.5±7.4）歲。

1.2 COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)

COPD組和AECOPD組患者均符合《COPD診治指南》（2010年版）的診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者年齡均在40歲以上，且具有接觸致病因素歷史（包括吸煙、重度油煙、粉塵環(huán)境工作等）；（2）所有患者臨床表征均包括氣喘、咳嗽、濃痰或出現(xiàn)短時間的呼吸困難；（3）患者使用支氣管擴(kuò)張劑后FEV1/FVC在70%以下；（4）排除其他呼吸道疾病患者包括支氣管哮喘、結(jié)核、支氣管擴(kuò)張等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清中YKL-40水平的基本原理采用EHSA法中的雙抗免疫夾心法測定血清樣本中的YKL-40的濃度。將單克隆抗體YKL-40與生物素結(jié)核后，再與酶標(biāo)板上抗生素蛋白鏈菌素進(jìn)行載體結(jié)合，最后使用標(biāo)準(zhǔn)品與YKL-40結(jié)合。多克隆抗體YKL-40實(shí)驗(yàn)步驟與上述不同，該抗體先與YKL-40蛋白結(jié)合，最后與外加底物對硝基磷酸苯脂（TMB）與堿性磷酸酶發(fā)生反應(yīng)，發(fā)生顯色反應(yīng)后，定量分析依照變色程度進(jìn)行。

1.3.2檢測步驟本次研究采用雙抗一部夾心法ELISA檢測，試劑盒來自北京中檢維康技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格按照說明書中流程進(jìn)行，操作具體如下：（1）實(shí)驗(yàn)前，酶標(biāo)板在紫外燈下照射2h，以增加實(shí)驗(yàn)過程中特異性吸附，減少非特異性吸附。（2）酶標(biāo)板中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及陰參孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔應(yīng)設(shè)置為添加不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，各50μL，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度為0、20、40、60、80、160ng/mL。（3）每孔加入50μL的樣本稀釋液（10μL待測血清+40μL小牛血清）；陰性對照孔加入50μL小牛血清。（4）在所有孔中再加入100μL的含有HRP標(biāo)記的檢測抗體，37℃溫箱孵育60min。（5）棄去液體，用平板紙將殘余的液體拍干，每孔加入200μL（TBST）洗滌液，放在洗板機(jī)上進(jìn)行洗板5min，將TBST棄去，拍干，重復(fù)洗滌4次。（6）板中加入TMB底物，100μL/孔，在37℃孵育10min，避光。（7）加入濃度8md/L的HCL終止液，每孔50μL，迅速用酶標(biāo)儀測定各孔的OD值。

1.4實(shí)驗(yàn)中注意事項(xiàng)

（1）采集血清樣品的過程要避免發(fā)生溶血，血液離心后迅速采集上層透明血清，并放入冰箱保存?zhèn)溆?。?）加樣時間應(yīng)控制在30min內(nèi)，避免產(chǎn)生漂移。（3）所有耗材使用前必須嚴(yán)格高壓消毒，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免交叉污染。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

本次研究所有患者資料及研究數(shù)據(jù)均采用Exed2007版進(jìn)行記錄和歸類，統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0版本進(jìn)行處理，計量資料采用方差分析檢驗(yàn)，計數(shù)資料以x²檢驗(yàn)，兩組的線性關(guān)系用Pearson進(jìn)行處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1三組患者一般資料比較

三組患者在性別、年齡、體重指數(shù)、男女比例等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），即三組患者具有可比性，見表1。

2.2三組患者血清中YKL-40水平比較

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、COPD組和AECOPD組血清中YKL-40水平分別為（26.32±3.54）、（40.32±8.43）和（65.32±13.74）ng/mL，三組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=138.4，P<0.01），AECOPD組和COPD組血清中YKL-40水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；AECOPD組血清中YKL-40水平比COPD組血清中的YKL-40水平高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3三組患者肺功能檢測指標(biāo)比較

比較三組患者的肺功能檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn)FEV1、FEV1/FVC、FEVI%差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而COPD組和AECOPD組患者上述指標(biāo)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。AECOPD組患者上述指標(biāo)與COPD組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.4相關(guān)性分析

AECOPD組患者血清YKL--40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P<0.001），與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=-0.525，P=0.003）。COPD組患者血清YKL-40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601，P<0.001），與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.466，P=0.009）。

3討論

COPD是可以預(yù)防治療的一種疾病，主要特點(diǎn)是不完全可逆性氣流受限，并伴有顯著的肺外效應(yīng)，是呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限，主要成因是由肺部有害的氣體和顆粒引發(fā)的炎癥異常反應(yīng)。COPD的發(fā)病目前主要認(rèn)為是與炎癥產(chǎn)生有關(guān)。在COPD炎癥過程中起主要作用的是巨噬細(xì)胞，它分泌的一些炎癥因子通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞聚集而引發(fā)炎癥發(fā)生。這些細(xì)胞因子有IL-8、蛋白分解酶及中性粒細(xì)胞趨化因子等。我們在本實(shí)驗(yàn)討論的YKL-40是巨噬細(xì)胞分泌的一種新型炎癥因子。

多年來，對于YKL-40的研究已深入到與各類疾病的相關(guān)性當(dāng)中，本次研究探討COPD與YKL-40的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)可能與疾病的炎癥過程的發(fā)生和起到重塑等有關(guān)。本次實(shí)驗(yàn)通過檢測不同進(jìn)程的COPD患者血清中YKL-40表達(dá)量，探討YKL-40在臨床中的意義。

3.1YKL-40的生物學(xué)特性

YKL-40是一種較為特殊的幾丁質(zhì)酶蛋白，多存在于哺乳類動物中，醫(yī)學(xué)又將其命名為人體軟骨糖蛋白39，縮寫YKL主要是以序列中起始的3個氨基酸（Tyrosine（Y）、Lysine（K）、Leucine（L））進(jìn)行命名。該蛋白包含有383個氨基酸，主要是由幾丁質(zhì)酶-3樣蛋白-1基因編碼的長肽蛋白物質(zhì)。該物質(zhì)在免疫反應(yīng)中發(fā)揮效益主要是通過鍵合方式。而且科學(xué)研究表明，在正常人體生理水平中存在的YKL-40的主要作用是防止炎癥反應(yīng)的發(fā)生。在人體正?；蚪M中，存在調(diào)控YKL-40表達(dá)的基因，而且在胚胎層中發(fā)現(xiàn)編碼YKL-40的mRNA蛋白的表達(dá)。當(dāng)機(jī)體發(fā)生疾病時，YKL-40會出現(xiàn)過度表達(dá)的現(xiàn)象，這種情況可能發(fā)生在分子、細(xì)胞及組織水平中。而目前局限于技術(shù)等層面，對于YKL-40的生物學(xué)功能和在人體內(nèi)的相關(guān)作用尚未有完整的解釋，但推測其可能與細(xì)胞增殖、組織重構(gòu)、對抗細(xì)胞凋亡等有關(guān)。

3.2 YKL-40與COPD@關(guān)系

有報道顯示，YKL-40參與COPD疾病發(fā)生和發(fā)展的各個過程中，該物質(zhì)與COPD進(jìn)行性發(fā)展致使全身性的炎癥反應(yīng)有關(guān)。Severine Letuve等的試驗(yàn)表明，COPD患者血清中的YKL-40含量顯著高于正?；颊?，同時對患者肺泡、支氣管活檢組織以及肺泡巨噬細(xì)胞中的YKL-40進(jìn)行檢測，均表明患者高于正常人群，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在YKL-40于血清中的含量比較時，對照組、COPD組和AECOPD組等三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），AECOPD組和COPD組血清中YKL-40水平比較顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；AECOPD組血清中YKL-40水平比COPD組血清中的YKL-40水平高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。AECOPD組患者血清YKL-40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.605，P<0.001），與FEVI%呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r=-0.525，P=0.003）。COPD組患者血清YKL-40含量與FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)（r=-0.601，P<0.01），與FEV1%呈負(fù)相關(guān)（r=-0.466，P=0.009）。

綜上所述，COPD患者患病不同時期體內(nèi)YKL40水平不一，對于臨床后續(xù)治療和相關(guān)藥物的使用具有指導(dǎo)意義，值得深入研究。