韓 偉，劉 倩，李曉敏，張曉琳

（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

袋式固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)飼用棉粕的初步研究

韓 偉，劉 倩，李曉敏，張曉琳

（國(guó)家糧食局科學(xué)研究院，北京 100037）

研究在益生菌與蛋白酶共同參與的袋式固態(tài)發(fā)酵體系中，棉粕的毒性因子、營(yíng)養(yǎng)成分及微生物等的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比原棉粕，經(jīng)過(guò)72 h的固態(tài)發(fā)酵與酶解，游離棉酚降低30.3%，酸溶蛋白提高了77.8%，粗蛋白無(wú)顯著提高；持續(xù)檢測(cè)60 d，pH降至5.5左右，枯草芽孢桿菌含量大于1.0×107cfu／g，霉菌含量小于1.0×104cfu／g。由此可見(jiàn)，袋式發(fā)酵工藝下棉籽蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值有所提高，并利于濕料儲(chǔ)存。

棉粕；袋式發(fā)酵；酶解；游離棉酚；霉菌

棉粕是畜牧業(yè)常用的飼用蛋白質(zhì)原料，粗蛋白含量35%～50%［1－2］。我國(guó)棉粕年產(chǎn)量超過(guò)600萬(wàn)t［3］，資源量大。通過(guò)微生物固態(tài)發(fā)酵法處理棉粕，可降低游離棉酚、肽鏈長(zhǎng)度，提高小肽、總氨基酸和必需氨基酸含量，顯著改變有機(jī)酸、B族維生素、游離氨基酸等含量，且能提升棉粕的飼用價(jià)值［4－7］。閆理東等［8］發(fā)現(xiàn)發(fā)酵棉粕可提高血液總蛋白、白蛋白、鈣、磷、免疫球蛋白、法氏囊指數(shù)等。李巧云等［9］用芽孢桿菌、酵母菌和鏈球菌等4種菌固態(tài)發(fā)酵棉粕，粗蛋白提高了6.1%，可溶性蛋白增加了120.3 mg／g，同時(shí)提高了必需氨基酸的含量。但固態(tài)發(fā)酵棉粕通常需要添加30%～55%的水，通過(guò)烘干法終止發(fā)酵過(guò)程并得到成品，導(dǎo)致大量的熱能消耗。據(jù)測(cè)算，烘干1 t棉粕所需要的成本約為150～300元。

動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，除選擇優(yōu)良飼料和加強(qiáng)飼養(yǎng)管理外，飼喂方法也至關(guān)重要。濕拌料是指水和飼料混合物或食品工業(yè)液體副產(chǎn)品與常規(guī)飼料原料的混合物。采用濕料飼喂豬（特別是仔豬）與采用干料相比，可以降低飼料成本、增加適口性、改善畜舍環(huán)境、改善仔豬生產(chǎn)性能，減少疾病發(fā)生。因此，濕料飼喂有較大的改善環(huán)境和降低飼養(yǎng)成本的潛力［10］。袋式發(fā)酵，一方面提供了相對(duì)密閉的、易于操作的發(fā)酵場(chǎng)所，另一方面可實(shí)現(xiàn)棉粕濕料成品的長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，避免干燥工序、便于運(yùn)輸。

本研究通過(guò)枯草芽孢桿菌、釀酒酵母與中性蛋白酶的協(xié)同作用，以呼吸袋為發(fā)酵場(chǎng)所、棉粕為主要底物進(jìn)行發(fā)酵并酶解，研究棉粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值變化，探索袋式固態(tài)發(fā)酵法應(yīng)用于微生物發(fā)酵棉粕源蛋白質(zhì)飼料的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

棉粕，新疆泰昆集團(tuán)奎屯油廠。產(chǎn)品指標(biāo)：粗蛋白50.27%，脂肪1.57%，水分8.04%，溶解度63.96%，纖維素6.71%，灰分6.47%。實(shí)驗(yàn)前粒徑要求：高于10目。

枯草芽孢桿菌GJ00141：實(shí)驗(yàn)室保藏，該菌株經(jīng)由游離棉酚標(biāo)準(zhǔn)品為唯一碳源的篩選體系證實(shí)，對(duì)游離棉酚有顯著脫除作用。釀酒酵母GJ00079：實(shí)驗(yàn)室保藏。

蛋白酶活性為25 U／g，玉米粉、葡萄糖為食品級(jí)，其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備

枯草芽孢桿菌GJ00141：取斜面菌種一環(huán)接于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃、200 r／min搖床培養(yǎng)8 h后，按0.5%比例轉(zhuǎn)接至另一同樣液體培養(yǎng)基，37℃、220 r／min搖床或發(fā)酵罐（通氧）培養(yǎng)12 h，備用。

釀酒酵母GJ00079：取斜面菌種一環(huán)接于PDA液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r／min搖床培養(yǎng)12 h后，按5%比例轉(zhuǎn)接到另一同樣液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r／min搖床或發(fā)酵罐（通氧）培養(yǎng)36 h，備用。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵與酶解工藝

原料配比見(jiàn)表1。添加順序：1）將棉粕、玉米粉、葡萄糖、無(wú)機(jī)鹽等投入呼吸袋中，攪拌均勻；2）將枯草芽孢桿菌發(fā)酵液與水（25℃≤溫度≤35℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)25.0%）混合后均勻?yàn)⑷氚l(fā)酵體系中；3）發(fā)酵24 h，將釀酒酵母發(fā)酵液與水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.43%）混合后均勻?yàn)⑷氚l(fā)酵體系中，攪拌均勻；4）發(fā)酵36 h，將蛋白酶與水（45℃≤溫度≤60℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.0%）混合后均勻?yàn)⑷氚l(fā)酵體系中，再次攪拌均勻；5）持續(xù)實(shí)驗(yàn)60 d，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定時(shí)取樣、檢測(cè)。

表1 原料配比

1.2.3 呼吸袋的制備

呼吸袋（見(jiàn)圖1），使用70%酒精擦拭內(nèi)部，紫外燈下低溫晾干或烘干使用。裝料達(dá)到呼吸袋容量的2／3，保持通氣閥通暢、不堵塞。呼吸袋口在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中始終密封。發(fā)酵料表面和中部分別放置1個(gè)微型溫濕度記錄儀，每5 min記錄一次數(shù)據(jù)，連續(xù)觀測(cè)60 d。

圖1 呼吸袋示意圖

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

粗蛋白，參照GB／T 6432—1994［11］方法；游離棉酚，參照GB／T 13086—1991［12］方法；酸溶蛋白，參照GB／T 22492—2008［13］方法；枯草芽孢桿菌活菌數(shù)，參照GB／T 4789.2—2010［14］方法；酵母和霉菌活菌數(shù)，參照GB／T 4789.15—2010［15］方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵體系溫、濕度變化

為了獲得發(fā)酵體系中必要的信息，研究中檢測(cè)了溫、濕度兩個(gè)指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)圖2，溫濕度變化的T檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

圖2 發(fā)酵體系溫度（a）和濕度（b）變化

表2 發(fā)酵體系（空氣層和發(fā)酵棉粕層）溫濕度變化的T檢驗(yàn)

由圖2和表2可見(jiàn)，投入種子、發(fā)酵起始后，溫度迅速上升，這符合芽孢桿菌的生長(zhǎng)特征；同時(shí)發(fā)酵層和空氣層的濕度趨于統(tǒng)一。結(jié)合發(fā)酵層和空氣層的溫、濕度T檢驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60 d的持續(xù)檢測(cè)過(guò)程中，發(fā)酵層和空氣層的溫度變化存在極顯著性差異（P＜0.01），且發(fā)酵層溫度變化范圍更加小，這說(shuō)明微生物代謝活動(dòng)明顯，導(dǎo)致發(fā)酵層溫度不完全隨外部環(huán)境溫度的變化而改變。發(fā)酵層和空氣層的濕度變化不存在顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)酵層和空氣層的濕度變化趨勢(shì)一致。

2.2 游離棉酚、pH和微生物的變化

按照發(fā)酵反應(yīng)池處理棉粕的經(jīng)驗(yàn)，在呼吸袋中重復(fù)了反應(yīng)條件，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵體系中pH、游離棉酚和菌數(shù)的變化

由圖3可見(jiàn)，0～72 h內(nèi)，棉粕中游離棉酚含量由810 mg／kg降低至564.7 mg／kg，降解率為30.3%，pH由6.80降至5.91，隨時(shí)間的再延長(zhǎng)逐漸穩(wěn)定至5.5左右，盡管枯草芽孢桿菌GJ00141和釀酒酵母GJ00079的活菌數(shù)沒(méi)有增長(zhǎng)趨勢(shì)，但可推測(cè)它們的代謝活動(dòng)在此期間比較活躍。跟蹤檢測(cè)微生物活菌數(shù)直至60 d，發(fā)現(xiàn)GJ00141的活菌數(shù)降低約0.8個(gè)數(shù)量級(jí)，而釀酒酵母GJ00079的活菌數(shù)緩慢降低3個(gè)數(shù)量級(jí)，直至反應(yīng)過(guò)程結(jié)束，枯草芽孢桿菌GJ00141和釀酒酵母GJ00079的活菌數(shù)分別為1.2×107cfu／g和1.04×104cfu／g。

2.3 粗蛋白和酸溶蛋白的變化

粗蛋白和酸溶蛋白是評(píng)定棉粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的兩個(gè)重要指標(biāo)。

由表3可看出，通過(guò)袋式固態(tài)發(fā)酵72 h，棉粕的粗蛋白含量并沒(méi)有顯著增長(zhǎng)（P＞0.05），而酸溶蛋白提高77.8%（P＜0.05），含量從3.6%提高至6.4%。由此推斷，所用菌種GJ00141和GJ00079的發(fā)酵過(guò)程粗蛋白總量沒(méi)有顯著影響；該體系中微生物的產(chǎn)酶量相對(duì)較少，故酸溶蛋白的提高與蛋白酶的參與直接相關(guān)。

表3 粗蛋白和酸溶蛋白的變化

2.4 霉菌檢測(cè)結(jié)果

要想實(shí)現(xiàn)濕料喂養(yǎng)，首先要保證濕料的安全性，并延長(zhǎng)貨架期，這其中最重要的一點(diǎn)是，避免霉菌污染與滋生。

由表4可見(jiàn)，3～6 d，呼吸袋內(nèi)初始霉菌含量在1.0×105cfu／g左右，而在30 d和60 d時(shí)，霉菌含量已降至1.0×104cfu／g以下?？梢酝茢?，隨著發(fā)酵體系中可溶性糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少，枯草芽孢桿菌GJ00141成為優(yōu)勢(shì)菌，霉菌的生長(zhǎng)受到明顯限制。1.0×104cfu／g以下的霉菌含量符合現(xiàn)行一般飼料對(duì)霉菌上限的控制要求。

表4 霉菌菌落檢測(cè)

3 結(jié)論

本文研究了在枯草芽孢桿菌GJ00141、釀酒酵母GJ00079和中性蛋白酶等參與的袋式固態(tài)發(fā)酵體系中棉粕的毒性因子、營(yíng)養(yǎng)成分、微生物的變化。相比原棉粕，經(jīng)過(guò)72 h的固態(tài)發(fā)酵與酶解，棉粕中游離棉酚含量降低至564.7 mg／kg（降解率為30.3%），酸溶蛋白含量提高至6.4%左右（增長(zhǎng)率為77.8%）；持續(xù)檢測(cè)60 d，pH降至5.5左右。固態(tài)發(fā)酵成品的枯草芽孢桿菌GJ00141含量大于1.0×107cfu／g，而霉菌含量小于1.0×104cfu／g。

綜上所述，使用袋式固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)飼用棉粕，棉粕的游離棉酚明顯降低，營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)顯著提升，60 d檢測(cè)期內(nèi)，霉菌含量降至1.0×104cfu／g以下，棉粕濕料的儲(chǔ)存穩(wěn)定性提高。

［1］薛福連.開(kāi)發(fā)棉籽蛋白飼料［J］.飼料與畜牧，2001（1）：31－32.

［2］GB／T 21264－2007，飼料用棉粕［S］.

［3］王春芳.固態(tài)生料發(fā)酵棉粕對(duì)游離棉酚含量及豬生產(chǎn)性能的影響［D］.合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

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［7］聶存喜.酵母發(fā)酵棉粕對(duì)肉雞脂類代謝的影響及其代謝組學(xué)研究［D］.石河子：石河子大學(xué)，2015.

［8］閆理東，張文舉，聶存喜，等.發(fā)酵棉粕對(duì)黃羽肉雞血液生化指標(biāo)和免疫性能的影響［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39（10）：95－100.

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［10］王漢夫，武書(shū)庚.華南地區(qū)干、濕料兩種不同飼喂方法對(duì)肉豬生產(chǎn)性能的影響［J］.飼料工業(yè)，2008，29（21）：29－30.

［11］GB／T 6432－1994，飼料中粗蛋白測(cè)定方法［S］.

［12］GB／T 13086－1991，飼料中游離棉酚的測(cè)定方法［S］.

［13］GB／T 22492－2008，大豆肽粉［S］.

［14］GB／T 4789.2－2010，食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定［S］.

［15］GB／T 4789.15－2010，食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)霉菌和酵母計(jì)數(shù)［S］.

Preliminary study on production of feeding cottonseed meal by bagging solid－state fermentation

HAN Wei，LIU Qian，LI Xiao－min，ZHANG Xiao－lin
（Academy of State Administration of Grain，Beijing 100037）

The change of virulence factors，nutritional components and microbes in cottonseed meal was researched in the bagging solid－state fermentation system with probiotics and proteinase as main participants.The results showed that compared to the unfermented cottonseed meal，the free gossypol decreased by 30.3%，the acid soluble protein increased by 77.8%，and the crude protein was not different significantly in 72 h.In 60 d detection，pH decreased to 5.5 or so，the content ofbacillus subtiliswas more than 1.0×107cfu／g and mould content was less than 1.0×104cfu／g.Therefore，the application of bag fermentation for producing cottonseed protein，not only improves the nutrition，but also is conducive to the preservation of wet feed.

cottonseed meal；bagging fermentation；enzymatic hydrolysis；free gossypol；mould

S 816.6

A

1007－7561（2017）01－0070－04

2016－09－06

國(guó)家糧食局科學(xué)研究院自主選題科研計(jì)劃課題（ZX1505）

韓偉，1983年出生，男，助理研究員.

張曉琳，1975年出生，女，研究員.