張志利　呂海舟　郭溆　何柳　宋經(jīng)元　孫超　羅紅梅

[摘要] 該研究采用RTPCR方法對龍骨馬尾杉Phlegmarirus carinatus （Desv.） Ching 1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶[1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， HDR]基因PcHDR1的編碼區(qū)進(jìn)行克隆并利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行序列分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室已獲得的龍骨馬尾杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從中獲得1條編碼HDR的轉(zhuǎn)錄本，采用RTPCR方法獲得該基因的全長cDNA序列，所克隆的PcHDR1基因編碼區(qū)長為1 437 bp，編碼478個氨基酸殘基，GenBank登錄號為JQ957845。PcHDR1與銀杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高，達(dá)78%。生物信息學(xué)預(yù)測PcHDR1蛋白沒有跨膜區(qū)，具有LytB保守結(jié)構(gòu)域，不含信號肽。該研究克隆并獲得了龍骨馬尾杉PcHDR1基因的編碼區(qū)序列，并對其編碼的蛋白進(jìn)行了序列分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測，為進(jìn)一步研究HDR的功能奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶； 龍骨馬尾杉； 萜類生物合成

Cloning and bioinformatics analysis of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl

4diphosphate reductase（PcHDR1）gene in Phlegmarirus carinatus

ZHANG Zhili1，2， LV Haizhou1， GUO Xu1， HE Liu1， SONG Jingyuan1， SUN Chao1， LUO Hongmei1*

（1. Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Institute of Medicinal

Plants/Endangered Medicinal Breeding National Engineering Laboratory， Beijing 100193， China；

2. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

[Abstract] The open reading frame of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase （HDR） was cloned from Phlegmarirus carinatus by RTPCR method and the sequence was analyzed by bioinformatics tools. After searching the transcriptome dataset of P. carinatus， one unique sequence encoding 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase was discovered. The primers were designed according to the cDNA sequence of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from the dataset. And then， the open reading frame （ORF） of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， named as PcHDR1 （GenBank Accession number：JQ957845）， was cloned by RTPCR strategy with the template of mixed RNA extracted from roots， stem and leaf of P. carinatus. The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The ORF of PcHDR1 consisted of 1 437 base pairs （bp）， encoding one polypeptide with 478 amino acids. The sequence comparison showed that PcHDR1 is closest with GbHDR （Ginkgo biloba），and the sequence homology was up to 78%. Bioinformatics prediction and analysis indicated that PcHDR1 protein contained a conserved domain of LytB， without transmembrane region and signal peptides. This study cloned and analyzed 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from P. carinatus. The result will provide a foundation for exploring the function of PcHDR1 involved in terpene biosynthesis in P. carinatus plants.

[Key words] 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase； Phlegmarirus carinatus； terpene biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162214

龍骨馬尾杉Phlegmarirus carinatus（Desv.） Ching是石杉科馬尾杉屬的代表物種[1]。龍骨馬尾杉中含有石松生物堿（lycopodium alkaloids）、萜類（triterpenes）、有機(jī)酸（phenolic acids）和黃酮（flavones）等多種成分[23]，全草入藥，具有重要藥用價值。對風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、筋骨疼痛、跌打損傷等具有顯著療效。龍骨馬尾杉為多年生的附生植物，且生境極為特殊，導(dǎo)致龍骨馬尾杉的野生資源極為有限。因此通過分子生物學(xué)手段挖掘龍骨馬尾杉中與次生代謝相關(guān)的基因顯得尤為重要。

萜類物質(zhì)是自然界存在的一類由異戊二烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate， IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dmiethylallyl diphosphate， DMAPP）為基本骨架組成的化合物的統(tǒng)稱，也稱為類異戊二烯。該類化合物有很好的藥理活性，是中藥和天然藥物的主要有效成分，紫杉醇[4]、青蒿素[5]、銀杏內(nèi)酯[6]等都屬于萜類，因此萜類化合物的合成代謝引起了人們廣泛的關(guān)注。甲基赤蘚糖磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑[78]是一條存在于植物和細(xì)菌中的參與萜類前體物質(zhì)合成的途徑，位于質(zhì)體中。MEP途徑中最后一個限速酶是1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶[1hydroxy2methyl 2（E）butenyl 4diphosphate reductase，HDR][9]， 催化羥甲基丁烯基4磷酸（hydroxymethylbutenyl 4d iphosphate，HMBPP） 生成萜類合成的前體物質(zhì)——IPP 和DMAPP。2000年，Cunningham等通過在大腸桿菌中表達(dá)金盞花Adonis aestivalis的lytB 基因，第1次證明了該基因編碼的蛋白具有HDR蛋白的功能，并可以維持IPP和DMAPP恒定的5∶1的比例[10]。 2004年，BotellaPavía P通過在轉(zhuǎn)基因擬南芥中過表達(dá)HDR和TXS（taxadiene synthase）基因發(fā)現(xiàn)，在該轉(zhuǎn)基因植株中紫杉二烯的含量比單轉(zhuǎn)TXS的擬南芥提高13倍[11]。該基因廣泛存在于生物體中，在植物、細(xì)菌和真菌中均已發(fā)現(xiàn)。Lv等在蛇足石杉中克隆了該基因家族的2個成員——HsHDR1和HsHDR2[12]。HDR是萜類物質(zhì)生物合成中的1個限速酶，在萜類合成中行使調(diào)節(jié)萜類合成前體五碳分子庫容的重要功能，是萜類代謝工程中重要的功能蛋白，它的超量表達(dá)有利于推動代謝流向下游流動， 促進(jìn)下游相關(guān)產(chǎn)物的生物合成。因此，對研究生物代謝工程具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)獲得了大量的龍骨馬尾杉轉(zhuǎn)錄組信息，從中發(fā)現(xiàn)了大量可能參與龍骨馬尾杉萜類化合物生物合成的轉(zhuǎn)錄本[13]。本文克隆了龍骨馬尾杉PcHDR1的cDNA序列，并進(jìn)行了生物信學(xué)預(yù)測及分析，為闡明龍骨馬尾杉萜類化合物生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

龍骨馬尾杉P. carinatus全草采集方法同文獻(xiàn)[13]。大腸桿菌DH5α感受態(tài)購于北京全式金生物科技有限公司。植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取試劑盒購于百泰克生物公司。PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Pyrobest高保真酶、pMD19T vector、SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒均為日本寶生物公司產(chǎn)品。多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）產(chǎn)物膠回收試劑盒購于天根生物公司。本研究所用引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。其他試劑均為國產(chǎn)分析純，試劑與儀器同文獻(xiàn)[13]。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取適量龍骨馬尾杉全草，在液氮中研磨，依據(jù)百泰克生物公司的植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取試劑盒的操作步驟提取龍骨馬尾杉總RNA，RNA完整性檢測及RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈互補(bǔ)鏈DNA（cDNA）的方法同文獻(xiàn)[13]。

1.3 PcHDR1基因的擴(kuò)增及測序

以龍骨馬尾杉的cDNA為模板，按照以下體系對龍骨馬尾杉的PcHDR1基因進(jìn)行擴(kuò)增：cDNA 1.0 μL，Pyrobest酶0.2 μL，10 μmol上下游引物各1.0 μL，2 mmol·L-1 dNTP 0.5 μL，10×Pyrobest Buffer 3.0 μL，終體積為30.0 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行30個循環(huán)，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環(huán)結(jié)束后72 ℃ 7 min延伸反應(yīng)，10 ℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，對擴(kuò)增所得目的片段進(jìn)行切膠回收。引物序列見表1。

將回收產(chǎn)物與pMD19T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α菌株，在含有氨芐的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，挑取單克隆經(jīng)菌落PCR擴(kuò)增和電泳檢測后選擇陽性克隆送公司測序。

1.4 PcHDR1生物信息學(xué)分析及在線分析工具

本研究中使用的生物信息學(xué)分析工具同文獻(xiàn)[12]。采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）預(yù)測PcHDR1的理化性質(zhì)；利用在線工具ExPASy PROSITE （http：//www.expasy.ch/prosite/）和美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PcHDR1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。利用SWISSMODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。利用3DJIGSAW（http：//bmm.cancerresearchuk.org/～3djigsaw/）對PcHDR1蛋白進(jìn)行同源建模，分析其三維結(jié)構(gòu)。使用SignalP3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行分泌蛋白預(yù)測。WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 用于PcHDR1蛋白的定位信號預(yù)測。在線軟件TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用來預(yù)測PcHDR1的跨膜區(qū)。氨基酸序列比對利用NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行。通過MEGA 5.0構(gòu)建Neighborjoining系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 龍骨馬尾杉PcHDR1基因的克隆

通過搜索龍骨馬尾杉高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[13]，從中發(fā)現(xiàn)一個轉(zhuǎn)錄本（contig00710）被注釋為1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶（HDR）基因。經(jīng)分析，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄本具有一個完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。根據(jù)該開放閱讀框的序列設(shè)計基因的全長擴(kuò)增引物（PcHDR1F和PcHDR1R），以龍骨馬尾杉全草RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用RTPCR技術(shù)擴(kuò)增獲得一條長為1 437 bp的序列，對所擴(kuò)增基因命名為PcHDR1，GenBank登錄號JQ957845。經(jīng)PCR擴(kuò)增所得的PcHDR1電泳檢測情況見圖1。

2.2 PcHDR1基因編碼蛋白特性分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析 利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam對PcHDR1基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示PcHDR1的分子式為C2 358H3 722N630O737S16，編碼478個氨基酸，相對分子質(zhì)量是53.202 2 kD。等電點(diǎn)pI 5.49，帶正電殘基（Arg + Lys）為55，帶負(fù)電殘基（Asp + Glu）為67。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)（the instability index）為30.40，說明PcHDR1較穩(wěn)定。脂肪系數(shù)（aliphatic index）為82.74，親水性系數(shù)（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.333。

2.2.2 PcHDR1二級結(jié)構(gòu)分析及結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用在線工具（http：//www.predictprotein.org/）預(yù)測PcHDR1的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其二級結(jié)構(gòu)中α螺旋（Alpha helix）占35.77%，β折疊（beta turn）占16.53%，無規(guī)卷曲（random coil）占47.70%，見圖2。InterProScan的保守結(jié)構(gòu)域在線預(yù)測結(jié)果表明，PcHDR1在122～463位含有LytB保守結(jié)構(gòu)域。

2.2.3 PcHDR1三維結(jié)構(gòu)建模 在SWISSMODEL依據(jù)保守結(jié)構(gòu)域作圖工具中，預(yù)測了PcHDR1蛋白的三維結(jié)構(gòu)。對PcHDR1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)果見圖3。

2.2.4 PcHDR1信號肽、亞細(xì)胞定位及跨膜區(qū)預(yù)測分析 利用SignalP3.0Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù)測PcHDR1蛋白不具有信號肽。在線工具WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 預(yù)測該蛋白的亞細(xì)胞定位情況，結(jié)果葉綠體的定位系數(shù)為8.0（chlo：8.0）；液泡的定位系數(shù)為2.0（vacu：2.0）；細(xì)胞核的定位系數(shù)為1.0（nucl：1.0）；細(xì)胞質(zhì)的定位系數(shù)為1.0（cyto：1.0）；質(zhì)體的定位系數(shù)為1.0（plas：1.0）。因此，PcHDR1最可能定位于葉綠體中。利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 預(yù)測PcHDR1的跨膜區(qū)。結(jié)果顯示該蛋白沒有跨膜區(qū)。

2.2.5 PcHDR1的氨基酸序列比對及進(jìn)化分析 將PcHDR1的氨基酸序列提交到美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫（http：//

blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）進(jìn)行BLASTP搜索相似性序列，結(jié)果顯示，PcHDR1與銀杏（Ginkgo biloba）的HDR序列同源性最高，達(dá)78%。為了分析PcHDR1的進(jìn)化情況，從NCBI的Nr數(shù)據(jù)庫中選取了8個物種10條HDR序列繪制進(jìn)化樹。 這些序列包括銀杏G. biloba的HDR（gi|82492442|），赤松Pinus densiflora的HDR（gi|183206805|），火炬松P. taeda的HDR（gi|126697262|），紫杉Taxus x media的HDR（gi|156068994|），艾菊Tanacetum parthenium的HDR（gi|353453158|），黃花蒿Artemisia annua的HDR（gi|289157416|），煙草Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae的HDR（gi|157042741|）和蛇足石杉Huperzia serrata中的2個HDR（gi|827048597| 和gi|827048599|）。進(jìn)化樹見圖4，PcHDR1與蛇足石杉中的HDR（gi|126697262|）親緣關(guān)系較近。序列同源性分析表明，PcHDR1與蛇足石杉中的2個HsHDR同源性高達(dá)92.76%，見圖5。

3 討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究是快速發(fā)現(xiàn)基因的有效手段。得益于生物信息學(xué)、 比較基因組學(xué)等學(xué)科與實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段的快速發(fā)展，本課題組已運(yùn)用高通量測序結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)對多種非模式藥用植物的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，并挖掘出大量參與植物次生代謝的候選基因，課題組已完成蛇足石杉[14]、人參[15]、三七[16]、銀杏[17]、西洋參[18]、喜樹[19]、丹參[20]等多個物種的高通量轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)了大量的參與藥用植物次生代謝途徑及生長發(fā)育、抗病抗逆等相關(guān)基因，為后續(xù)研究藥用植物次生代謝工程及優(yōu)良品種選育奠定基礎(chǔ)。

本研究在已有龍骨馬尾杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，克隆獲得了編碼龍骨馬尾杉 HDR 的PcHDR1基因。與Lv等[12]報道的蛇足石杉中的HDR基因家族中的2個HDRs基因（HsHDR1和HsHDR2）相比，它們編碼的蛋白質(zhì)的大小相當(dāng)，均在476～478 aa。對其編碼的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測與分析，結(jié)果顯示PcHDR1具有典型的 HDR 催化活性位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位預(yù)測其定位于葉綠體，這與HsHDR1和HsHDR2預(yù)測定位于葉綠體的報道一致[12]，與MEP途徑存在于質(zhì)體中相一致。同來源于其他植物的HDR蛋白同源性較高，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上，PcHDR1與來源于蛇足石杉的2個HDRs蛋白同源性高達(dá)92.76%，尤其與HsHDR1的親緣關(guān)系最近，推測這2個HDR可能具有相似的功能。以上研究結(jié)果將為后續(xù)開展PcHDR1的功能驗(yàn)證及龍骨馬尾杉萜類化合物的生物合成途徑的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]