石舒瑾　崔麗麗　王金梅

【摘 要】目的：研究橡膠樹種子對3種臨床常見菌株的抗菌活性。方法：采用紙片擴(kuò)散法測定橡膠樹種子各部位浸膏的抑菌圈。結(jié)果：橡膠樹種子乙酸乙酯部位和正丁醇部位對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均>6 mm。結(jié)論：橡膠樹種子有一定的抗菌活性，且其乙酸乙酯部位和正丁醇部位在濃度為50 mg/mL抗菌活性相當(dāng)，石油醚部位則沒有抗菌活性。

【關(guān)鍵詞】橡膠樹種子 抗菌活性 紙片擴(kuò)散法

橡膠樹Hevea brasiliensis （Willd.ex A.Juss.） Muell.Arg.為大戟科橡膠樹屬植物，原產(chǎn)巴西，現(xiàn)廣泛栽培于亞洲熱帶地區(qū)，我國臺(tái)灣、福建等地均有栽培，以海南和云南種植較多，本種是最主要的天然橡膠植物[1]。橡膠樹具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是制備天然橡膠的材料，廣泛用于工業(yè)、國防、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。橡膠樹種子也有很高的應(yīng)用價(jià)值，種仁含油量高達(dá)45%～55%，主要成分有豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、肉豆蔻酸、棕櫚油酸、油酸、亞油酸等[2]。研究表明[3-5]，橡膠樹種子能夠降血脂，還能改善家兔主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病變。然而對橡膠樹的研究多集中在基因組學(xué)方面，藥學(xué)方面的研究很少[6-7]。

本試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法對橡膠樹種子的抗菌活性進(jìn)行了初步研究，以期豐富橡膠樹的研究開發(fā)。

1 儀器和材料

1.1 儀器

JJ-CJ-2FD超潔凈工作臺(tái)（吳江市凈化設(shè)備總廠）；GRP-9720恒溫隔水式培養(yǎng)箱（上海森信試驗(yàn)儀器有限公司）；ZWY-211C恒溫臥式培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZWX-201A紫外線空氣消毒器（廣東粵華醫(yī)療器械廠）；渦旋器；SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試劑

營養(yǎng)肉湯，營養(yǎng)瓊脂（北京奧博星生物技術(shù)有限公司）；青霉素G（Penicillin G.K-salt：C16H17N2O4SK），activity：156U/mg，25mg；硫酸鏈霉素（Streptomycin suifate research grade： C21H39N7O12 1.5H2SO4），activity：759U/mg，10mg（購買于SERVA公司）；DMSO，1，3-丙二醇，無水乙醇（均為分析純）。

1.3 供試菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA），耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA），產(chǎn)超光譜β-內(nèi)酰胺酶金黃色葡萄球菌（Extended spectrum β-lactamases Staphylococcus aureus，ESBLs-SA），所有菌株均為河南大學(xué)淮河醫(yī)院臨床分離菌株，經(jīng)全自動(dòng)微生物分析儀VITEK-AMS鑒定，符合率≥99%。

1.4 藥材

橡膠樹種子于2014年11月采集于海南省萬寧市興隆鎮(zhèn)，由河南大學(xué)中藥研究所李昌勤教授鑒定為大戟科橡膠樹（H. brasiliensis）的種子。標(biāo)本現(xiàn)存于河南大學(xué)中藥研究所。

2 方法

2.1 液體和固體培養(yǎng)基的配置

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制：稱取營養(yǎng)肉湯干粉18g，用1000mL蒸餾水溶解，分裝于錐形瓶中，于121℃，0.15MPa下滅菌15min，備用。

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制：分別稱取瓊脂干粉15 g和營養(yǎng)肉湯干粉18g，用1000mL蒸餾水加熱溶解，分裝于錐形瓶中，于121℃，0.15 MPa下滅菌15min后，立刻將滅菌瓊脂分裝于無菌平皿中，備用。

2.2 菌懸液的制備

將臨床分離鑒定后的SA、MRSA、ESBLs-SA進(jìn)行菌株擴(kuò)大培養(yǎng)，平板劃線法接種在瓊脂平皿中，37℃培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)取出單個(gè)菌落2個(gè)，接種在100 mL滅菌肉湯中，于120 r/min、37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對數(shù)生長期，酶標(biāo)儀測定吸光度值，用新鮮滅菌的肉湯將菌液稀釋至吸光度值為0.1，稀釋后菌液約為1×108 CFU/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3 樣品的制備

取橡膠樹種子650g，用70%乙醇浸漬提取3次，每次3天，合并提取液，濃縮得到浸膏（68g），將浸膏用水分散，然后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮，分別得到石油醚部位（8g）、乙酸乙酯部位（18g）、正丁醇部位（10g）。分別稱取適量各部位浸膏加適量DMSO溶解，配成50mg/mL溶液，備用。

2.4 抑菌圈的測定

采用紙片擴(kuò)散法測定橡膠樹種子的抗菌活性。按照文獻(xiàn)[8]的方法，用微量加樣器吸取5μL樣品加到直徑為6mm濾紙片上，揮干溶劑后，等距貼于含菌平板上，用溶劑做空白對照，用硫酸鏈霉素和青霉素G做陽性對照（濃度為4 mg/mL），于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18h，記錄抑菌圈直徑。每份樣品均平行操作3次，結(jié)果取平均值。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

3 結(jié)果

本文章采用紙片擴(kuò)散法考察了橡膠樹種子石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位對三種金黃色葡萄球菌的抗菌活性，結(jié)果采用算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)值統(tǒng)計(jì)采用SPSS19.0軟件單因素方差分析法（One-Way ANOVA）比較其顯著性差異，具體結(jié)果見表1。

4 討論

由表1可以看出，橡膠樹種子乙酸乙酯部位和正丁醇部位在濃度為50 mg/mL對SA、MRSA、ESBLs-SA均有一定的抑制活性，與陽性對照青霉素G和硫酸鏈霉素相比，二者抗菌活性均弱于陽性對照，結(jié)果具有顯著性差異（*P≤0.5，***P≤0.001）。橡膠樹種子石油醚部位則沒有顯示抗菌活性，說明橡膠樹種子的抗菌活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

橡膠樹的應(yīng)用價(jià)值眾所周知，早在90年代，就有人預(yù)測橡膠樹可能成為未來的藥物工廠，能用于生產(chǎn)胰島素疫苗，抗血栓藥物等[9]。目前橡膠樹的研究主要集中在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等生物信息學(xué)的研究，取得了很大成就[10-12]。本文從藥學(xué)的角度對橡膠樹種子進(jìn)行研究，豐富了橡膠樹的研究內(nèi)容。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì).中國植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1982，31：202.

[2]尹桂豪，曹建華，劉春華，李春麗，張世瑞.橡膠樹種子油的超臨界提取及成分分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，19：8814-8815.

[3]劉超然，王明英，楊良，等.橡膠種子油醫(yī)用的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1980，1（1）：89-97.

[4]李運(yùn)珊，劉玉仙，李世泰.精煉橡膠種子油降血脂的臨床應(yīng)用研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006；6（2）：65-68.

[5]唐朝才，劉愛華，楊樹，等.橡膠種子油食用價(jià)值的研究[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，1981，2（1）：91-100.

[6]王靖，鄧小敏，田維敏.巴西橡膠樹乳管細(xì)胞HblMYC3互作蛋白篩選與功能分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，06：1-7.

[7]何海霞，張宇，王萌，楊葉，鄭服叢.巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）HbMlo7基因克隆與表達(dá)分析[J].植物生理學(xué)報(bào)，2016，06：917-925.

[8]康文藝，劉瑜新，宋艷麗，張麗.尼泊爾酸模α-葡萄糖苷酶抑制活性及抗菌活性研究[J].中成藥，2010，07：1249-1251.

[9]吳貴洲. 橡膠樹——未來的藥物工廠[J].熱帶作物譯叢，1992，06：21.

[10]鄧玉杰，余海洋，張宇，王萌.一個(gè)巴西橡膠樹過氧化物酶基因克隆與生物信息學(xué)分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2014，04：1-8.

[11]朱晉恒，戚繼艷，肖小虎，唐朝榮.巴西橡膠樹葡萄糖/核糖醇脫氫酶基因的克隆和表達(dá)分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，06：1-9.

[12]康桂娟，黎瑜，曾日中.巴西橡膠樹HbNAM基因克隆和表達(dá)分析[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，01：59-64.