朱 哲，王 娜，趙 敏*

·論著·

百草枯中毒早期大鼠腎組織中不規(guī)則趨化因子的表達(dá)

朱 哲1，王 娜2，趙 敏1*

目的 通過(guò)觀察不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN，又稱(chēng)CX3CLl)在百草枯(Paraquat，PQ)中毒早期腎組織中的表達(dá)，探討FKN在PQ致大鼠急性腎損傷中的作用。方法 SD大鼠80只，按隨機(jī)數(shù)字法分為染毒組(40只)和對(duì)照組(40只)。染毒組腹腔注入PQ(22 mg/kg)，對(duì)照組給予等量生理鹽水。每組分別在染毒后0.5、1、3、5 d處死大鼠。測(cè)定血清肌酐及尿素氮，HE染色觀察腎組織病理改變，免疫組化法檢測(cè)FKN的表達(dá)。結(jié)果 PQ染毒后大鼠出現(xiàn)腎功能損害，血肌酐及尿素氮同步升高，且隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)，腎功能損害逐漸加重，與同時(shí)間對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。鏡下觀察，染毒組大鼠腎組織病理改變?yōu)槟I小球體積增大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹及管腔變窄；此后隨觀察時(shí)間延長(zhǎng)，可見(jiàn)水腫滲出、壞死，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，腎小管內(nèi)蛋白管型。免疫組化發(fā)現(xiàn)：染毒組在染毒后0.5、1、3、5 d,FKN表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)(P<0.05)，且明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 FKN在PQ早期大鼠腎組織中可表達(dá)，并與急性腎損傷的發(fā)病過(guò)程緊密相關(guān)。

百草枯；中毒；不規(guī)則趨化因子；腎組織

0 引言

百草枯(Paraquat，PQ)是世界范圍內(nèi)廣泛使用的速效觸殺型除草劑[1]，毒性較強(qiáng)且無(wú)特效解毒劑，因接觸誤服或自殺等原因?qū)е碌陌俨菘葜卸静±仓鹉暝黾印Ｑ装Y反應(yīng)在百草枯中毒機(jī)制中研究比較廣泛[2]。不規(guī)則趨化因子(Fractalkine，F(xiàn)KN，又稱(chēng)CX3CLl)屬趨化因子CX3C亞族，具有促進(jìn)白細(xì)胞黏附、加快炎性因子滲出、促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生等多種生物學(xué)作用，參與了多種炎性疾病的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。但FKN與百草枯中毒的相關(guān)報(bào)道很少[3-6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PQ染毒早期不同時(shí)間點(diǎn)腎組織中FKN的表達(dá)及變化，探討FKN與PQ致大鼠急性腎損傷的關(guān)系，為研究PQ中毒急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 20%百草枯溶液(江蘇南通先正達(dá)藥業(yè))，兔抗大鼠CX3CLl多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型制作 SPF級(jí)健康成年雄性SD大白鼠80只(由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，體重(392±38)g。將80只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分成染毒組(40只)和對(duì)照組(40只)。染毒組以PQ 22 mg/kg腹腔注射染毒，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。每組按觀察時(shí)間點(diǎn)(染毒后0.5、1、3、5 d)隨機(jī)分為4個(gè)亞組，每組10只大鼠進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 標(biāo)本采集 各組大鼠在建模后第0.5、1、3、5天，按照10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈采血約5 mL放入離心管中，靜置30 min，3 500 r/min，離心15 min，留取血漿，置于-80 ℃冰箱保存。放血處死大鼠后，留取雙腎標(biāo)本行病理觀察及免疫組化染色。

1.4 腎組織病理學(xué)觀察 腎組織用4%多聚甲醛(4 ℃，PBS配制，pH 7.4)固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色后光鏡下觀察腎臟病理變化(4 μm切片)。

1.5 血Cr和BUN的測(cè)定 取各組大鼠血漿，按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清 Cr、BUN水平。

1.6 腎組織FKN免疫組化染色 采用鏈霉親和素-生物素標(biāo)記法(SABC)進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。一抗兔抗大鼠CX3CLI多克隆抗體稀釋濃度為1∶50。鏡下隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，以胞質(zhì)/胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，應(yīng)用免疫組化分析軟件(NIS-Elements Br 3.0)進(jìn)行圖像分析，分別計(jì)算每個(gè)視野陽(yáng)性染色的平均吸光度值(MOD)，取其平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物觀察 對(duì)照組大鼠觀察期內(nèi)無(wú)明顯變化，活動(dòng)敏捷，飲食正常，反應(yīng)正常，毛發(fā)光滑，體重增加或無(wú)明顯改變。染毒組大鼠染毒0.5d后開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)減少，1d后部分大鼠進(jìn)食進(jìn)水減少、呼吸不穩(wěn)，口鼻部可見(jiàn)分泌物；3d及5d后大鼠出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促，嚴(yán)重者死亡(3d染毒組死亡3例，5d染毒組死亡5例，予同數(shù)量大鼠補(bǔ)充入組)。

2.2 腎組織病理變化 對(duì)照組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小管內(nèi)無(wú)管型及顆粒(圖1A)。染毒組出現(xiàn)急性腎損傷表現(xiàn)。染毒后0.5d即可見(jiàn)腎小球體積增大，1d可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞腫脹及管腔變窄 ，3d可見(jiàn)水腫滲出、壞死，間質(zhì)可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，5d可見(jiàn)腎小管內(nèi)蛋白管型(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠腎組織的病理變化(HE,×100)

2.3 染毒組和對(duì)照組不同時(shí)點(diǎn)血Cr和BUN比較PQ染毒后，大鼠出現(xiàn)腎功能損害，血肌酐及尿素氮升高(P<0.05)，且隨染毒時(shí)間延長(zhǎng)腎功能損害加重(P<0.05)，與同時(shí)間對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)，見(jiàn)表1。

2.4FKN在腎組織中的表達(dá)FKN在對(duì)照組中不表達(dá)或很少表達(dá)，僅見(jiàn)極少數(shù)腎小管細(xì)胞漿棕黃色淡染，各時(shí)間點(diǎn)FKN比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。染毒組在染毒后0.5、1、3、5d,FKN表達(dá)呈逐漸增高趨勢(shì)(P<0.01)，且明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)圖2、圖3。

3 討論

百草枯是一種快速滅生性除草劑，具有極強(qiáng)的觸殺作用。其對(duì)人體毒性極大，致死率高，受累的主要器官是肺臟，腎臟也是受累器官之一，且無(wú)特效解毒劑。有研究表明，針對(duì)草枯中毒患者的研究中，腎損傷的發(fā)生率高達(dá)64.9%，其中死亡患者的腎損傷發(fā)生率達(dá)到67.1%，可以看出腎損傷是影響預(yù)后的重要因素[7]。本研究成功建立PQ腹腔注射染毒大鼠動(dòng)物模型，染毒后0.5 d,大鼠出現(xiàn)不同程度的呼吸急促，口鼻及肢端出現(xiàn)血性分泌物，血肌酐及尿素氮升高，HE染色見(jiàn)腎小球體積增大，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、變性、空泡樣變、壞死，腎小管管腔變窄，間質(zhì)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示PQ中毒早期可致腎損傷。并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KN在腎組織中的表達(dá)從0.5 d以后的時(shí)間點(diǎn)呈逐漸增加趨勢(shì)，在時(shí)間上與腎組織病理?yè)p害程度相關(guān)，故認(rèn)為FKN介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)參與急性腎損傷的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。本研究顯示，PQ中毒后0.5 d即出現(xiàn)腎臟組織FKN 的表達(dá)升高，且持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，提示FKN可能參與了腎臟早期炎性損害及功能衰竭的發(fā)生。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)推測(cè)，F(xiàn)KN參與的炎癥反應(yīng)，也是PQ中毒者多臟器功能障礙或死亡的一個(gè)重要因素。

表1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)腎功能的變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 各組大鼠腎組織FKN免疫組化染色結(jié)果(SABC，×400)

圖3 各組大鼠腎組織FKN比較

FKN是趨化因子CX3C亞族的唯一成員[8-9]，主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞，是活化的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的具有黏附功能的趨化因子，具有膜結(jié)合型和可溶型兩種形式。膜結(jié)合型FKN可對(duì)白細(xì)胞上FKN受體CX3CR1起黏附作用，并支持整合素非依賴(lài)性白細(xì)胞黏連。當(dāng)膜結(jié)合型FKN被溶蛋白性裂解后以游離的形式釋放，趨化多種炎性細(xì)胞，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生。FKN是與多種細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)的活性因子。有研究表明，F(xiàn)KN與CX3CRl結(jié)合以后，可以增加NF-κB、TGF-β1的表達(dá)，從而產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)[10]。已有實(shí)驗(yàn)證明NF-κB及TGF-β1在PQ中毒中都發(fā)揮著重要作用[11-16]，F(xiàn)KN在百草枯中毒腎組織中的表達(dá)可能成為PQ中毒的新靶點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了FKN同PQ中毒腎損傷程度的相關(guān)性，但與PQ中毒相關(guān)研究仍需更多實(shí)驗(yàn)證實(shí)。FKN兼具趨化和黏附雙重功能，其受體CX3CRl的特異性在百草枯中毒的臨床治療實(shí)踐中的應(yīng)用值得深入探索。

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Expression of the Fractalkine in kidney tissue of SD rats with early paraquat poisoning

ZHU Zhe1，WANG Na2，ZHAO Min1*

(1.Department of Emergency，Shengiing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China;2.Liaoning Province Hospital for Occupational Disease Prevention and Treatment,Shenyang 110005,China)

Objective To investigate the effect of fractalkine (FKN) on acute renal injury induced by paraquat poisoning in rats by observing the expression of FKN in renal tissue.Methods A total of 80 SD rats were randomly divided into two groups: PQ group (n=40) and control group (n=40).PQ 22 mg/kg and an equal volume of normal saline were administered intraperitoneally in PQ group and control group.Rats were separately sacrificed at 0.5,1,3 and 5 d after poisoning.The serum creatinine (Cr),urea nitrogen (BUN) and the pathological changes of the renal tissue were measured by HE staining.The FKN expression was observed by immunohistochemistry method.Results After PQ poisoning,the renal failure appeared in the rats of PQ group,and the Cr and BUN increased at the same time.As poisoned time prolonged,the Cr and BUN increased more significantly,and there were significant differences in Cr and BUN between the two groups (P<0.05).The pathological changes of renal tissue in rats of PQ group,including increased glomerular volume,the swelling of tubular epithelial cells and the narrowing of the lumen were observed under the microscope.Then the edema exudation,necrosis,increased infiltration of inflammatory cells and visible protein tube in renal tubules appeared as the observation time prolonged.The results of HE staining showed that the FKN expression of rats in PQ group at 0.5,1,3 and 5 d after being poisoned increased gradually (P<0.05),and there were significant differences between the two groups (P<0.01).Conclusion FKN can be expressed in renal tissue of early PQ rats,which is closely related to the pathogenesis of acute kidney injury.

Paraquat;Poisoning;FKN;Renal tissue

2016-10-20

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110004;

2.遼寧省職業(yè)病防治院，沈陽(yáng) 110005

國(guó)家重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(衛(wèi)辦醫(yī)政函[2012]649號(hào))

10.14053/j.cnki.ppcr.201701001

*通信作者