艾 亮

參芪五味子片對阿爾茨海默小鼠的治療作用及其對小鼠血清與海馬體氧化應激水平的影響

艾 亮

目的 研究參芪五味子片對阿爾茨海默小鼠的治療作用及其對小鼠血清和海馬體氧化應激水平的影響。方法 選取50只3月齡APP小鼠，隨機平均分為模型組,陽性藥組,高、中、低劑量組；另選取10只C57BL/6小鼠作為空白組。陽性藥組每天灌胃給予多奈哌齊(10 mg/kg)，高、中、低劑量組每天分別灌胃給予1.44、0.72、0.36 g/kg參芪五味子片，空白組和模型組則灌胃給予等量生理鹽水，飼養(yǎng)時間為2個月。采用水迷宮實驗檢測各組小鼠學習與記憶能力；實驗結束后取各組血清與海馬體，檢測其超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-Aoc)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平；利用末端標記法(TUNEL法)觀察小鼠海馬區(qū)細胞凋亡的情況。結果 高、中劑量組的潛伏期明顯短于模型組，第3象限時間明顯長于模型組，SOD、T-Aoc、GSH-Px水平明顯高于模型組，MDA明顯低于模型組；TUNEL染色顯示，模型組與低劑量組小鼠出現(xiàn)較多的陽性染色的神經(jīng)元，而在高、中劑量組中僅觀察到少量的凋亡神經(jīng)元。結論 參芪五味子片對阿爾茨海默病小鼠具有較好的治療作用，可有效改善氧化應激水平，值得進行深入研究。

參芪五味子片；阿爾茨海默??；氧化應激

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s diseases，AD)又稱老年性癡呆，是臨床最為常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，該病的主要臨床表現(xiàn)為記憶力降低、人格改變、語言障礙及認知功能減退等[1]。目前，AD的具體發(fā)病機制仍不明確，其主要的病理特征為神經(jīng)元中出現(xiàn)神經(jīng)元纖維纏結、老年斑沉積及海馬體中神經(jīng)元數(shù)目降低等[2]。近年來，諸多研究結果提示，海馬體氧化應激出現(xiàn)紊亂可能是導致AD發(fā)生及發(fā)展的一類關鍵因素[3]。參芪五味子片具有寧心安神、健脾益氣的功效，常用于健忘、心悸氣短、少寐多夢及倦怠乏力等癥[4]?，F(xiàn)代藥學研究證實，該藥物具有較強的抗氧化、抗衰老及提高記憶力等活性[5]。盡管臨床針對參芪五味子片的研究較為廣泛，但對其治療AD的相關研究則較少涉及。APP小鼠(APP/V717轉基因小鼠)是藥物研究中較為成熟的AD模型[6]，本研究通過觀察參芪五味子片對APP小鼠的治療效果，為該藥物的臨床使用及AD的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗主要試劑 參芪五味子片(康縣獨一味生物制藥有限公司，國藥準字Z20103006，批號：2015020129)；多奈哌齊為本研究中陽性藥，購自美國Sigma公司，批號:98089212；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-Aoc)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測所需試劑盒均購自武漢博士德有限公司，批號:2014110313、2014122632、2015023052、2015022351；末端標記法(TUNEL法)試劑盒購自羅氏公司，批號:90082325；Western印跡抗體購于美國Sigma公司，批號:98061383。

1.2 實驗動物分組方法 50只APP小鼠，3月齡，體重(18.0±2.0)g，購于陜西省疾控中心動物中心，實驗動物合格證編號:SCXK(陜)2014-0122。根據(jù)參考文獻中相關方法，另選擇10只C57BL/6野生鼠作為本研究中空白對照小鼠，3月齡，體重范圍(18.0±2.0)g，購自陜西省疾控中心動物中心，實驗動物合格證編號:SCXK(陜)2013-1257。上述實驗動物均由西安交通大學藥學院實驗動物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為55%濕度、標準飼養(yǎng)、日常光照及自由飲水，本研究中的動物實驗操作流程均嚴格遵循《實驗動物保護條例》[7]中相關規(guī)定。10只C57BL/6野生鼠為空白組，50只APP小鼠隨機平均分為陽性藥組、模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組，每組均為10只。

1.3 給藥方法 參考相關文獻[8]中對于參芪五味子片小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究的一般給藥劑量，本課題中，高、中、低劑量組小鼠每天分別灌胃給予1.44、0.72、0.36 g/kg參芪五味子片；陽性藥組則每天灌胃給予10 mg/kg多奈哌齊；空白組與模型組每天灌胃給予等量生理鹽水。各組給藥時間均為2個月。

1.4 Morris水迷宮方法 采用Morris水迷宮檢測各組小鼠學習與記憶能力，將水迷宮劃分為4個象限，在第3象限(目標象限)中放置一個位于水面下0.8 cm的平臺(直徑30 cm)，實驗過程中平臺與水迷宮的位置均保持不變。

各次實驗中，將小鼠由第1、2、4象限分別放入水池，并訓練小鼠順利找到平臺，記錄小鼠找到平臺的時間(潛伏期)。若2 min內小鼠仍未找到平臺，則應引導小鼠游至平臺，且于平臺停留1 min以強化記憶。各組小鼠均連續(xù)訓練5 d，每天記錄小鼠潛伏期，在訓練的第6天撤去平臺，對各組小鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)與第3象限停留時間進行檢測。

1.5 小鼠血清及海馬體中氧化應激水平的檢測方法 水迷宮實驗完成后，利用尾靜脈取血法取各組小鼠靜脈血并分離血清，取血完成后，利用頸椎脫臼法處死小鼠，取其海馬體平均分為2份，留取一份備用，將另一份海馬體置于生理鹽水中，利用玻璃勻漿器將其制備成10%的組織勻漿，在高速離心機中離心10 min(3 000 r/min)后吸取其上清液，根據(jù)相關試劑盒說明書中方法，分別對血清及勻漿中SOD、MDA、T-Aoc、GSH-Px含量進行檢測。

1.6 小鼠海馬體細胞凋亡情況檢測 取“1.5”項中海馬體組織，固定并利用蠟塊切片，根據(jù)TUNEL法試劑盒說明書中相關方法，采用末端標記法檢測各組小鼠海馬體細胞凋亡情況，其中凋亡的神經(jīng)元細胞顯棕褐色。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，分別采用t檢驗和單因素方差分析進行兩兩相比較及組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 參芪五味子片對AD小鼠學習與記憶能力的影響 在第1天的訓練中，除空白組外，其他各組小鼠潛伏期基本一致(P>0.05)，空白組潛伏期較其余各組縮短(P<0.05)。在第2～5天的訓練中，各組潛伏期均呈降低趨勢，且陽性藥組、高劑量、中劑量及空白組小鼠的潛伏期較模型組縮短，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組水迷宮潛伏期結果比較

在第6天的訓練中，陽性藥組、高劑量組、中劑量組及空白組小鼠穿越平臺所在位置的次數(shù)均明顯多于模型組，且第3象限停留時間較模型組延長，各組分別與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠第3象限停留時間及穿越平臺次數(shù)比較

注：*與模型組比較

2.2 參芪五味子片對AD小鼠血清氧化應激水平的影響 空白組、陽性藥組、高劑量組、中劑量組小鼠血清中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明顯高于模型組，而MDA低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、表3。

2.3 參芪五味子片對AD小鼠海馬體氧化應激水平的影響 空白組、陽性藥組、高劑量組、中劑量組小鼠海馬體中SOD、GSH-PX、T-Aoc的水平均明顯高于模型組，MDA低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4、表5。

2.4 各組小鼠TUNEL染色結果 模型組及低劑量組小鼠海馬體中存在較多陽性染色的神經(jīng)元細胞，且其細胞核主要呈現(xiàn)固縮深染與棕黃色；空白組中幾乎無上述陽性染色的神經(jīng)元細胞；而在陽性藥組、高劑量組及中劑量組中存在少量的且呈散在的凋亡神經(jīng)元細胞。見圖2。

表2 各組小鼠血清SOD、MDA比較

注：*與模型組比較

表3 各組小鼠血清T-Aoc、GSH-Px比較

注：*與模型組比較

表4 各組小鼠海馬體中SOD、MDA比較

注：*與模型組比較

表5 各組小鼠海馬體中T-Aoc、GSH-Px比較

注：*與模型組比較

圖2 各組小鼠TUNEL染色結果(×400)

3 討論

AD是一種多發(fā)于老年患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其起病隱襲且呈慢性進行性發(fā)展，患者主要表現(xiàn)為認知功能障礙、記憶障礙等精神神經(jīng)癥狀，嚴重影響其生活質量，最終導致患者死亡[9]。盡管AD的具體發(fā)病機制尚不明確，但有較多的研究結果顯示，該病的發(fā)生可能與機體氧化應激紊亂密切相關[10]。參芪五味子片是臨床常用的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療藥物，主要成分包括南五味子、黨參、黃芪及酸棗仁等，全方具有寧心、安神、健脾及益氣的功效，適用于健忘、失眠、心悸、氣短、多夢、乏力及自汗等癥，在臨床上被廣泛應用于神經(jīng)衰弱、焦慮及失眠等疾病的治療[11-12]?，F(xiàn)代藥學研究證實，方中南五味子、黨參及黃芪均是臨床常用的滋補藥，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)氧化應激紊亂均具有較好的調節(jié)作用，尤其是五味子及酸棗仁，可有效修復過氧化所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[13]。APP小鼠是AD研究中常用的一種模型，而其野生型C57BL/6小鼠則多作為空白對照被廣泛應用[14]。

本研究采用Morris水迷宮法考察各組小鼠的學習與記憶能力，結果顯示，與模型組相比，APP小鼠經(jīng)過高、中劑量參芪五味子片治療后，其潛伏期明顯縮短，第3象限停留時間延長，穿越平臺所在位置的次數(shù)增多，提示參芪五味子片可有效改善APP小鼠的學習與記憶能力，對AD癥狀的緩解具有重要意義。

此外，各組小鼠血清及海馬體氧化應激水平檢測結果顯示，高、中劑量組小鼠的血清及海馬體中SOD、GSH-PX及T-Aoc的水平均明顯高于模型組，MDA則明顯低于模型組，提示參芪五味子片可有效調節(jié)APP小鼠整體及海馬體中氧化應激水平，減輕由于過氧化所導致的神經(jīng)細胞損傷。

TUNEL染色能夠有效反映AD小鼠海馬體神經(jīng)元的凋亡情況[15]。本研究結果表明，模型組及低劑量組小鼠海馬體中存在較多的凋亡神經(jīng)元，而高、中劑量組小鼠則僅存在少量散在的凋亡神經(jīng)元，提示參芪五味子片可有效改善APP小鼠海馬體神經(jīng)元的凋亡情況。

本研究的局限性：首先，本文未對參芪五味子片治療AD的具體機制進行深入探討；其次，在對小鼠血清及海馬體的氧化應激水平考察中，僅選擇了部分較為典型的指標作為檢測對象，而對其他的相關酶的檢測并未開展，后續(xù)研究還應予以完善；最后，本研究給藥劑量主要參考相關文獻中推薦劑量，但該劑量是否為AD治療中的最佳給藥劑量仍需進一步探討。

綜上所述，參芪五味子片不僅可有效地改善AD小鼠的學習與記憶能力，還能夠改善其氧化應激水平，值得進行深入研究。

[1] Wang F,Gordon BA,Ryman DC,et al.Cerebral amyloidosis associated with cognitive decline in autosomal dominant Alzheimer disease [J].Neurology,2015,85(9):790-798.

[2] Naj AC,Jun G,Reitz C,et al.Effects of multiple genetic loci on age at onset in late-onset Alzheimer disease:a genome-wide association study [J].JAMA Neurol,2014,71(11):1394-1404.

[3] Tramutola A,Triplett JC,Di Domenico F,et al.Alteration of mTOR signaling occurs early in the progression of Alzheimer disease (AD):analysis of brain from subjects with pre-clinical AD,amnestic mild cognitive impairment and late-stage AD [J].J Neurochem,2015,133(5):739-749.

[4] 曹永孝,鄭建普,劉靜,等.參芪五味子膠囊的鎮(zhèn)靜、抗應激和免疫調節(jié)作用[J].中國中藥雜志,2005,30(20):1631-1633.

[5] 李立新,申建柯.參芪五味子片聯(lián)合金水寶膠囊治療中老年陽氣虛弱型失眠療效觀察[J].廣州中醫(yī)藥大學學報,2012,29(3):251-253.

[6] Donovan NJ,Wadsworth LP,Lorius N,et al.Regional cortical thinning predicts worsening apathy and hallucinations across the Alzheimer disease spectrum[J].Am J Geriatr Psychiatry,2014,22(11):1168-1179.

[7] 孫敬方.動物實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:198-201.

[8] 祝洪艷,王國麗,林海成,等.參芪五味子顆粒協(xié)同戊巴比妥鈉對小鼠睡眠及免疫器官指數(shù)的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(12):85-87.

[9] Lee JH,Byun MS,Sohn BK,et al.Functional neuroanatomical correlates of the frontal assessment battery performance inalzheimer disease:a FDG-PET study[J].J Geriatr Psychiatry Neurol,2015,28(3):184-192.

[10]Cairns NJ,Perrin RJ,Franklin EE,et al.Neuropathologic assessment of participants in two multi-center longitudinal observational studies:the Alzheimer Disease Neuroimaging Initiative (ADNI) and the Dominantly Inherited Alzheimer Network (DIAN)[J].Neuropathology,2015,35(4):390-400.

[11]徐繼森,賈玉臻.參芪五味子臨床應用綜述[J].中醫(yī)雜志,2009,50(S1):256-258.

[12]朱書強,王亞麗,夏仁福,等.參芪五味子膠囊鎮(zhèn)靜、抗應激作用研究[J].中國藥房,2008,19(15):1127-1128.

[13]江蘇新醫(yī)學院.中藥大辭典[M].上海:上海科學技術出版社,1979:387.

[14]Read A,Wright A,Abdel-Aal el-SM.In vitro bioaccessibility and monolayer uptake of lutein from wholegrain baked foods[J].Food Chem,2015,174:263-269.

[15]Domínguez RO,Pagano MA,Marschoff ER,et al.Alzheimer disease and cognitive impairment associated with diabetes mellitus type 2:associations and a hypothesis[J].Neurologia,2014,29(9):567-572.

Effect of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice

AI Liang

(Department of Pharmacy,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an 716000,China)

Objective To study the treatment effects of shenqi wuweizi tablets in the treatment of mice with Alzheimer′s diseases and its effects on the level of oxidative stress in serum and hippocampus of the mice.Methods The 3-month APP mice (n=50) were randomly divided into model group,positive control group,high,middle and low dose group.Ten C57BL/6 mice were selected as blank control group.The mice of high,middle and low dose groups were treated with 1.44,0.72 and 0.36 g/kg shenqi wuweizi tablets,while the donepezil was used in the positive control group.The mice of blank control group and model group were given the same amount of normal saline,feeding time for 2 months.Morris water maze experiment was performed to test the learning and memory ability of mice.After the experiment,the serum and hippocampus of each group were collected,and the levels of SOD,MDA,T-Aoc and GSH-Px were detected.The TUNEL method was used to observe the apoptosis of hippocampus of mice.Results In the water maze test,the incubation period of mice in high,middle and low dose groups were obviously shorter than that of model group.Compared with model group,the levels of SOD,T-Aoc and GSH-Px in high,middle dose groups were higher,and MDA level was lower.TUNEL staining of the mice of model and low dose group appeared more positive staining of neurons,and only a small number of apoptotic neurons were observed in high and middle dose groups.Conclusion Shenqi wuweizi tablets has good therapeutic effect on mice with Alzheimer′s disease,which can effectively improve the level of oxidative stress,and it is worth studying in depth.

Shenqi wuweizi tablets；Alzheimer′s diseases；Oxidative stress

2016-06-30

延安大學附屬醫(yī)院藥劑科,陜西 延安 716000

10.14053/j.cnki.ppcr.201701005