王哲彬

超分子化學(xué)用于葛根素分離純化的研究

王哲彬

目的 采用超分子化學(xué)原理，建立一種天然產(chǎn)物的分離純化的方法。方法 采用水提法得到葛根素粗提物，通過與糖精形成超分子復(fù)合物，再調(diào)節(jié)溶液pH值，得到葛根素結(jié)晶。結(jié)果 葛根素結(jié)晶純度為98.65%，總得率為40.13%。結(jié)論 該法操作簡單，安全環(huán)保，回收率和純度高，在天然產(chǎn)物分離純化方面具有良好的應(yīng)用前景。

葛根素；超分子；分離純化

0 引言

葛根素化學(xué)名為4,7-二羥基-8-β-d-葡萄糖基異黃酮，分子式為C21H20O9，是豆科植物野葛(Puerarialobata)或甘葛藤(Puerariathansonilbenth)的干燥根—葛根(Radixpuerariae)中的主要藥效成分，含量約為2.6%。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，葛根素具有顯著的心血管系統(tǒng)活性[1-3]、改善胰島素抵抗及降血糖作用[4-5]、抗腫瘤活性[6]、神經(jīng)保護(hù)活性[7]、免疫調(diào)節(jié)作用[8]等藥理活性。藥代動力學(xué)研究表明，葛根素體內(nèi)消除較快，難于產(chǎn)生毒副作用[9]。因此，葛根素的新藥開發(fā)越來越受到研究者的重視，葛根的分離純化也成為研究的熱點之一。

目前葛根素的分離純化主要有萃取法、鹽析法、大孔樹脂吸附法[10]、離子交換色譜[11]、配位色譜[12]等方法。但是通過上述方法得到的產(chǎn)品純度通常不高(最高約93%左右)，若要進(jìn)行新藥開發(fā)，還需進(jìn)行二次純化；上述方法不可避免地使用有機溶劑，如甲醇等，一方面增加成本，造成環(huán)境污染，另一方面也會使產(chǎn)品中有溶劑殘留，對后續(xù)開發(fā)產(chǎn)生不利影響；此外，在分離葛根素時，會造成大孔樹脂、離子交換纖維、配位色譜柱等耗材的損耗，進(jìn)一步增加成本。因此，開發(fā)一種既環(huán)保、成本低廉，還不涉及有機溶劑的方法，將會大大提升經(jīng)濟效益及應(yīng)用前景。

本研究采用超分子化學(xué)的方法，通過選擇適宜配體與葛根素形成超分子復(fù)合物，從而改變葛根素的溶解度等理化性質(zhì)，將葛根素與其他成分分離，進(jìn)而達(dá)到純化目的。此方法對于葛根素及其他天然藥物中的活性成分的分離純化具有良好的示范意義。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑 葛根(浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，批號：20151008)；葛根素對照品(含量測定用，中國食品藥品檢定研究院，批號：110752-201313)；糖精(食品級，山東天力藥業(yè)有限公司，批號：201412004)；鹽酸(天津市新華化學(xué)試劑廠)、甲醇(美國TEDIA公司)為色譜純，無水乙醇(浙江三鷹化學(xué)試劑有限公司)為分析純，所有實驗用水為純化水。

1.2 實驗儀器 LC-20AT型高效液相色譜儀，島津公司；色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，Agilent公司；AB135-S型十萬分之一電子分析天平，Mettler Toledo公司；MYP11-2型恒溫磁力攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；R-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士BUCHI公司；V-100型真空泵，瑞士BUCHI公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根粗提物制備[13]稱取葛根藥材約300 g，置于5 L三頸燒瓶中，加8倍量75%乙醇溶液，回流2 h，過濾，藥渣繼續(xù)加8倍量無水乙醇，重復(fù)回流2次。合并濾液，回收乙醇至原液體積的40%左右，趁熱加入濃鹽酸20 mL，充分?jǐn)嚢?，過濾，濾液繼續(xù)回收乙醇至成流浸膏狀，減壓干燥6 h，即得葛根粗提物。稱重，提取物重量為11.1 g，收率為3.7%。

2.2 含量分析方法

2.2.1 色譜條件 參照文獻(xiàn)[14]，色譜條件為：以甲醇-水(25∶75)為流動相，檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，運行時間30 min，進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按葛根素峰計算，不得低于4 000。

2.2.2 樣液制備 對照品溶液制備：取葛根素對照品適量，精密稱定，加30%乙醇制成每1 mL含80 mg的溶液，即得；供試品溶液制備(粗提物、葛根素晶體折算葛根素質(zhì)量后，參照藥材方法)：取本品粉末(過三號篩)約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 線性關(guān)系考察 以進(jìn)樣量(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測定峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以最小二乘法計算得回歸方程：Y=0.684 5 X+1.006 8，R2=0.999 8，結(jié)果顯示，進(jìn)樣量在6.25～62.5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.4 精密度試驗 按“2.2.1”項色譜條件，取對照品溶液10 μL注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果葛根素峰面積的RSD值為0.16%(n=6)，說明此條件下精密度良好。

2.2.5 準(zhǔn)確性試驗 精密量取已知含量葛根藥材0.1 g，共6份，按“2.2.2”項下供試品制備方法制備供試液，向供試液中加入適量葛根素對照品。在“2.2.1”項色譜條件下，分別進(jìn)樣10μL，進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果葛根素的平均加樣回收率為98.9%，RSD為1.96%(n=6)，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在0、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積，結(jié)果葛根素峰面積的RSD值為1.50%(n=6)，說明在25 h內(nèi)，供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批葛根藥材，同時制備5份供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，進(jìn)樣測定，計算得葛根素平均含量為2.61%，RSD為1.25%(n=5)，表明方法重復(fù)性良好。

按上述方法測定，葛根素對照品、葛根藥材、葛根提取物HPLC含量測定圖譜見圖1。采用外標(biāo)法分別計算葛根及葛根提取物中葛根素的含量，結(jié)果顯示，葛根素含量為2.65%，葛根提取物中葛根素含量為42.16%，轉(zhuǎn)移率為58.87%。

圖1 HPLC圖譜

2.3 葛根素的分離純化 葛根素的空間結(jié)構(gòu)見圖2a，由圖可知，葛根素含有多個羥基氧原子，是形成氫鍵的理想電子供體，其中酚羥基氧原子電負(fù)性大，且周圍無大型基團，空間位阻小，利于氫鍵的形成。因此，認(rèn)為葛根素可與適合的配體形成超分子復(fù)合物。糖精化學(xué)名為鄰苯甲酰磺酰亞胺，空間結(jié)構(gòu)見圖2b。根據(jù)文獻(xiàn)[15]，糖精是一種優(yōu)良的共晶形成物(Cocrystal Former，CCF)，易與適宜電子供體形成氫鍵，從而大大改善活性藥物成分(Active pharmaceutical ingredients，API)的溶解性。因此，我們選擇糖精與葛根素形成超分子復(fù)合物，改變葛根素的溶解度，使之在水中易溶；再通過改變?nèi)芤簆H值，破壞氫鍵，使葛根素從復(fù)合態(tài)變?yōu)橛坞x態(tài)，控制析晶條件使之析出，達(dá)到純化目的。

圖2 空間結(jié)構(gòu)圖

將葛根粗提物粉碎，加100 mL水，于磁力攪拌器上攪拌10 min。根據(jù)葛根素含量，計算糖精量，使葛根素與糖精化學(xué)計量比為1∶1，加入溶液中，繼續(xù)攪拌10 min，過濾。濾液加熱至65 ℃，向濾液中緩緩加入0.1 mol/L的鹽酸溶液，至pH為4，室溫下冷卻并靜置12 h，轉(zhuǎn)移至4～10 ℃處，冷藏4 h析晶。過濾，產(chǎn)生的晶體(顯微照片見圖3)即為葛根素，濾液為母液。結(jié)晶用冷水洗滌2～3次，干燥，稱重。最后得到葛根素結(jié)晶共3.19 g，收率為68.15%，總得率為40.13%。

圖3 葛根素晶體顯微照片

2.4 葛根素結(jié)晶及母液含量分析 取“2.3”項下所得結(jié)晶及母液，分別按“2.2”項下含量測定分析方法，制備供試液并測定其中葛根素及糖精含量，HPLC圖譜見圖4，其中圖4a為葛根素晶體HPLC圖，圖4b為母液HPLC圖?？芍鸶鼐w中葛根素含量高于98.65%(面積歸一化法)；母液中葛根素含量過低，低于線性范圍(<6.25 μg/mL)，不做計算，說明母液中葛根素殘留量小，損失率很低；糖精含量為18.63 mg/mL，回收率約為93.95%。

3 討論

根據(jù)超分子化學(xué)原理，API與CCF形成超分子是一個自發(fā)過程，形成自組裝系統(tǒng)[15]。因此，反應(yīng)過程無需額外供能(如加熱等)，僅需攪拌即可。但要求API與CCF的空間結(jié)構(gòu)能夠契合，否則即使含有適宜形成氫鍵的基團也無法形成超分子復(fù)合物。

圖4 葛根素結(jié)晶及母液HPLC圖譜

通過形成超分子復(fù)合物，可以極大地改變API的理化性質(zhì)，尤其是溶解度；再通過調(diào)節(jié)pH破壞氫鍵，使API變成游離態(tài)，從而析出，得到純品。該法操作簡便，制備過程中只涉及毒性極低的乙醇，不涉及其他有機溶劑，無需加熱供能，更為綠色環(huán)保。并且通過分析，母液中還有大量的糖精(收率為93.95%)，因此，母液可重新用于后續(xù)葛根素的純化，進(jìn)一步降低成本。此部分工藝需后續(xù)研究。

[1] 栗鳳,林安曉,喬東方,等.葛根素減輕大鼠心肌缺血-再灌注損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2015,35(6):836-837.

[2] 曾躍華,陳云龍.葛根素治療冠心病及對活化血小板的影響[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2011,27(6):997.

[3] 孫佳琳,龐磊,王帥,等.基于微流控芯片技術(shù)建立缺血再灌注心肌損傷模型[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2014,45(6):710-714.

[4] 徐婷,褚江洪,丁萍英,等.葛根素對α-葡萄糖苷酶抑制作用機理的探討[J].中國生化藥物雜志，2015,35(1):43-48.

[5] 張益群,張麗敏.葛根素對糖尿病視網(wǎng)膜病變血流動力學(xué)及流變學(xué)的影響[J].國際眼科雜志,2013,13(10):2057-2059.

[6] 王麗娟,孫蕾,王振東.葛根素對U14宮頸癌小鼠免疫和氧化功能的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2011,34(4):42-43.

[7] 陳放,劉開揚,徐珊,等.葛根素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)及對NF-κB表達(dá)的抑制[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2011,25(3):296-300.

[8] 夏白娟,崔淑琴.葛根素對慢性乙醇中毒小鼠胃竇黏膜胃泌素、生長抑素表達(dá)的影響[J].山東醫(yī)藥,2013,53(29):36-38.

[9] 潘瑩.葛根素在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(5):2666-2667.

[10]李適,岳明珠,李銀花,等.正交試驗優(yōu)化葛根素的大孔樹脂純化工藝[J].食品科學(xué),2013,34(16):89-92.

[11]劉廷岳,聶素雙,潘子惟.離子交換纖維分離純化葛根素的研究[J].中國新藥雜志,2008,17(18):1604-1606.

[12]潘見,袁傳勛,戴郁青.配位色譜法從葛根素浸膏中分離純化葛根素[J].色譜,2006,24(5):483-485.

[13]韓劍,曹偉,尹華,等.正交試驗法優(yōu)選葛根素提取工藝[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2007,27(3):332-333.

[14]任少偉,張文成,李兵,等.HPLC法測定葛根超細(xì)粉中葛根素含量[J].包裝與食品機械,2014,32(3):67-69.

[15]高緣,祖卉,張建軍.藥物共晶研究進(jìn)展[J].化學(xué)進(jìn)展,2010,5:829-836.

Supramolecular chemistry used in purification of puerarin

WANG Zhe-bin

(Xiaoshan Hospital of Zhejiang,Hangzhou 311202,China)

Objective To build a method for purification of natur products by supramolecular chemistry.Methods Crude extract of puerarin was prepared through water extraction.Puerarin crystal was purified through forming supramolecular complex with saccharin and adjusting pH of the solution.Results The purification of puerarin crystal was 98.65%,and total yield was 40.13%.Conclusion This method is simple and environmentally with highryield and puri and has extensive prospects on nature products purification.

Puerarin;Supramolecular;Purification

2016-04-09

浙江蕭山醫(yī)院，杭州 蕭山 311202

10.14053/j.cnki.ppcr.201701021