馬 莉,王詩陶,劉 征△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

電針額區(qū)對血管性癡呆大鼠行為學(xué)及腦內(nèi)cAMP-PKA-CREB信號通路的影響*

馬 莉1,王詩陶2,劉 征1△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

目的：探討電針額區(qū)對血管性癡呆(VD)大鼠腦內(nèi)海馬區(qū)cAMP-PKA-CREB信號通路的影響。方法：選取60只健康雄性老齡Wistar大鼠，隨機(jī)分成假手術(shù)組、電針組、模型組和西藥組，每組15只，共4組。動(dòng)物模型的制作方法采用2-血管阻斷法(2-VO)，待大鼠傷口愈合后給予相關(guān)治療。電針組選取VD大鼠頭部額區(qū)的穴位神庭透至囟會(huì)，同時(shí)在此穴的基礎(chǔ)上各旁開1寸及2寸(參照于致順老師頭穴分區(qū)法)給予叢刺，連接KWD-808 I型脈沖電療儀，采用疏密波，2 Hz頻率，電針20 min，之后再留針10 min，每日治療1次，共30天。西藥組給予腦復(fù)康治療，假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水灌胃治療。每組大鼠采用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)能力的檢測，并采用SABC法檢測海馬區(qū)cAMP的含量，同時(shí)采用免疫印跡法檢測海馬區(qū)PKA及CREB蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果：與模型組比較，電針額區(qū)明顯提高了VD大鼠Morris水迷宮的檢測成績，使海馬區(qū)cAMP的含量升高，并顯著增加PKA、CREB的陽性細(xì)胞數(shù)量(P<0.05);而電針組與西藥組比較各指數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：電針額區(qū)可以有效改善VD大鼠的記憶能力，提高其學(xué)習(xí)成績，調(diào)整VD大鼠海馬區(qū)cAMP-PKA-CREB信號通路的傳導(dǎo)。

電針；癡呆;血管性；Morris水迷宮；cAMP-PKA-CREB

血管性癡呆(VD)是老年期癡呆之一，是目前唯一可預(yù)防和治療的癡呆類型，以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要表現(xiàn)，其病因多為各種腦血管疾病。隨著世界人口的老齡化及中風(fēng)發(fā)病率的升高，該病已成為醫(yī)學(xué)界的重大研究課題。臨床中筆者采用本校于致順老師的頭穴分區(qū)叢刺法，并結(jié)合脈沖電療儀治療該病，療效較為顯著。為了進(jìn)一步揭示該方法的作用機(jī)理，筆者利用2-血管阻斷法(2-VO)制作VD模型[1]，觀察針刺前后VD大鼠cAMP-PKA-CREB信號傳導(dǎo)通路的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)器材

TGL-16G冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；1510石蠟切片機(jī)(德國LETIZ公司)；722光柵分光光度計(jì)(上海第二分析儀器廠)；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科學(xué)儀器研究所)；YW-90旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；無菌針灸針(貴州安迪藥械有限公司生產(chǎn))；KWD-808 I脈沖電療儀(常州市武進(jìn)長城醫(yī)療器械有限公司)；TS-1型脫色搖床(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；Morris水迷宮儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用健康雄性老齡Wistar大鼠60只，月齡為18～20，體質(zhì)量為(500±20)g。

1.3 分組和造模方法

將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、電針組、模型組和西藥組，每組大鼠15只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件1周后開始造模。造模方法采用改進(jìn)的2-VO阻斷法。各組大鼠采用10%烏拉坦(1 g/kg)進(jìn)行腹腔注射麻醉，然后頸部給予常規(guī)消毒，在頸部正中行切口，充分暴露左右頸總動(dòng)脈和神經(jīng)，將二者進(jìn)行鈍性剝離，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈10 min，之后恢復(fù)供血10 min，再夾閉10 min，最后取下無創(chuàng)動(dòng)脈夾并縫合傷口。術(shù)后每只大鼠給予20萬u青霉素肌注以預(yù)防感染。假手術(shù)組采取鈍性分離動(dòng)脈和神經(jīng)后即縫合傷口。

1.4 治療方法

待4組Wistar大鼠傷口完全愈合后分別給予相關(guān)治療。按照于致順老師頭穴分區(qū)法，電針組VD大鼠采用額區(qū)穴位給予叢刺，即從神庭透至囟會(huì)(參照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜》)及其向左、右各1寸及2寸的平行線，連接脈沖電療儀，調(diào)至2 Hz，疏密波，持續(xù)20 min，撤下電療儀，留針10 min，每日治療1次，共30天。西藥組VD大鼠給予6 ml/kg灌胃治療，藥物為腦復(fù)康(湖南迪諾制藥有限公司，批號H43020666)水溶液灌胃，其水溶液配比濃度為40 mg/ml。假手術(shù)組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。

1.5 Morris水迷宮檢測

待各組大鼠治療結(jié)束后，利用Morris水迷宮進(jìn)行行為學(xué)能力檢測，根據(jù)其檢測成績判斷各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶力能力。該測試歷時(shí)6天，每天上、下午各進(jìn)行4次，分為定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。在定位航行試驗(yàn)中，將大鼠放入水迷宮計(jì)算其2 min內(nèi)到達(dá)平臺的時(shí)間，即為該大鼠的逃避潛伏期，如果2 min內(nèi)仍未找到平臺，其逃避潛伏期為2 min。該試驗(yàn)結(jié)束后，將平臺撤掉后開始進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，把各組大鼠從Morris水迷宮的任意入水點(diǎn)放入水中，觀察大鼠的運(yùn)行軌跡，同時(shí)計(jì)算Wistar大鼠在2 min內(nèi)在原象限平臺的跨越次數(shù)。

1.6 海馬cAMP含量及PKA、CREB蛋白的檢測

各組大鼠行為學(xué)測試后，被斷頭處死，在冰盤上迅速取雙側(cè)海馬組織，置于-70℃下液氮保存，按照cAMP試劑盒的說明采用放射免疫法對其含量進(jìn)行檢測，并利用SABC法對CREB、PKA的陽性蛋白進(jìn)行測定。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 Morris水迷宮檢測結(jié)果

見表1。模型組大鼠逃避潛伏期明顯長于假手術(shù)組，二者差異顯著(P<0.01)，空間探索試驗(yàn)中模型組大鼠跨越原象限平臺的次數(shù)少于假手術(shù)組，說明造模成功；電針組、西藥組大鼠的數(shù)據(jù)與模型組比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組大鼠的逃避潛伏期均比模型組顯著縮短，其跨越次數(shù)也較模型組明顯增多；電針組與西藥組比較，行為學(xué)統(tǒng)計(jì)無明顯差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠平均逃避潛伏期、跨越次數(shù)的比較(±s)

注:與模型組比較，△P<0.01,▲P<0.05；與電針組比較，▽P>0.05

2.2 各組大鼠cAMP含量檢測的結(jié)果

見表2。模型組大鼠與假手術(shù)組比較，其海馬區(qū)cAMP的含量明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，電針組、西藥組與模型組比較其cAMP的含量均明顯增加，差異顯著(P<0.05)，電針組與西藥組cAMP的含量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠cAMP的檢測結(jié)果(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05；與電針組比較，▽P>0.05

2.3 各組大鼠PKA、CREB陽性蛋白表達(dá)結(jié)果

見表3。光鏡下，PKA和CREB的陽性表達(dá)呈棕黃色顆粒狀物，且主要集中在海馬CA1區(qū)。假手術(shù)組PKA及CREB的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯多于模型組，二者比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；治療后，電針組與西藥組PKA及CREB陽性細(xì)胞數(shù)量均比模型組明顯增加,與模型組比較有顯著差異(P<0.01);電針組PKA及CREB與西藥組比較無差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠PKA、CREB蛋白表達(dá)的比較(±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與電針組比較，▽P>0.05

3 討論

由于VD的病位在腦髓，故臨床中治療本病以頭部腧穴為主。我校于致順老師利用“場說”將頭部劃分為7個(gè)區(qū)，來治療相關(guān)疾病，為臨床提供了簡便有效的方法。針對智能及精神類疾病，筆者通常選取頭部額區(qū)進(jìn)行針刺[2]，即神庭至囟會(huì)及其向左、向右、各1寸及2寸的平行線，該方法不僅能夠有效改善腦部神經(jīng)細(xì)胞代謝，同時(shí)還能提高VD患者的記憶力和智能狀態(tài)。

VD屬于老年期癡呆之一，因此選取的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)與人類VD的病理生理特點(diǎn)相接近。本研究中，選取老齡Wistar大鼠，采用改進(jìn)的2-VO法[3]，較好的模擬了VD的發(fā)病機(jī)制。造模前后利用Morris水迷宮[4]進(jìn)行行為學(xué)能力檢測，根據(jù)其檢測成績判斷各組大鼠的智能和記憶改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示模型組大鼠比假手術(shù)組大鼠的逃避潛伏期明顯延長，撤除平臺后，VD大鼠無法正確搜尋目標(biāo)，跨越原象限平臺的次數(shù)顯著減少，提示其空間認(rèn)知能力出現(xiàn)下降，記憶力明顯減退。電針額區(qū)治療后，VD大鼠的逃避潛伏期大大縮短，運(yùn)動(dòng)軌跡也較前清晰，原象限平臺的跨越次數(shù)明顯增加，說明電針額區(qū)能夠有效提高VD大鼠的空間認(rèn)知能力，改善VD大鼠的記憶及智能狀態(tài)。

蛋白激酶A(Protein kinase A，PKA)信號通路即cAMP-PKA-CREB通路參與人體內(nèi)多種能量代謝過程[5]，且與學(xué)習(xí)記憶尤其是海馬依賴長時(shí)程記憶增強(qiáng)關(guān)系密切。PKA是作用在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要調(diào)控因子之一，該通路對神經(jīng)突觸的可塑性及神經(jīng)活性物質(zhì)的合成代謝均發(fā)揮著重要作用，此外也影響基因的表達(dá)調(diào)控。Byers等[6]通過研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP數(shù)量不論增加或減少均可使動(dòng)物產(chǎn)生不同程度的記憶力減退。此外還有人發(fā)現(xiàn)應(yīng)用PKA抑制劑不僅能阻斷動(dòng)物腦內(nèi)的信號通路傳導(dǎo)[7]，還會(huì)對大腦的長時(shí)程記憶造成嚴(yán)重?fù)p傷。多數(shù)學(xué)者經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)[8-9]，VD大鼠的海馬區(qū)神經(jīng)元在急性腦缺血時(shí)會(huì)導(dǎo)致離子泵功能障礙，大量自由基過度內(nèi)流，cAMP的生成數(shù)量下降，PKA的激活明顯減少，進(jìn)而抑制CREB產(chǎn)生磷酸化，阻礙CREB與cAMP反應(yīng)元件的進(jìn)一步結(jié)合，無法啟動(dòng)和調(diào)控下游轉(zhuǎn)錄因子，使其產(chǎn)生新的神經(jīng)突觸聯(lián)系，最終導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶障礙。筆者在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，VD大鼠經(jīng)電針額區(qū)治療后，腦內(nèi)cAMP數(shù)量明顯升高,PKA及CREB陽性蛋白表達(dá)增加，行為學(xué)有所改善，證實(shí)三者的含量與大鼠的學(xué)習(xí)記憶成績呈正相關(guān)，該信號通路的弱化直接參與了VD的形成，而電針額區(qū)能夠激活該信號通路的傳導(dǎo)，提高VD大鼠的認(rèn)知記憶能力，最終改善動(dòng)物的整體智能狀態(tài)。

[1] Samdani A,Danson TM,Dawson VL,et al.Nitric oxide synthase in model of focal ischemia[J].Stroke,1997,28:1283-1288

[2] 王薇，周國濱，于致順.于致順主任醫(yī)師頭針治療經(jīng)驗(yàn)[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2003，33(6)：28-31

[3] 王蕊.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進(jìn)[J].中國病理生理雜志，2000，16(10)：914-916

[4] Morris R.Development of a water-maze Procedure for studying spatial learning in the rat[J].J Neurosci Methods,1984,11(1)47-60

[5] Nishiyama M,Hoshino A,Tsai L,et al.Cyclic AMP /GMP-dependent modulation of Ca2+channels sets the polarity of nerve growth-cone turning[J].J Nature,2003,423(6943):990-995

[6] Byers D,Davis RL,Kiger JA.Defect in cyclic AMP phos-phodiesterase due to the dunce mutation of learning in dro-sophila melanogaster[J]. Nature,1981,289(5793):79-81

[7] 銀杰,南娟,楊一鳴,等.斷乳后慢性鋁暴露對大鼠海馬長時(shí)程增強(qiáng)及蛋白激酶A表達(dá)的影響[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志,2009,18(6):529-531

[8] Andrea M,Dario B,Chiara A,et al.Protein Kinase A-Me-diated Synapsin phosphorylation is a centralModulator of Ca2+-Dependent Synaptic Activity[J].J Neuroscience,2006,26(45):11670-11681

[9] Niu L,Zhou J,Huang Y,et al.db-Cyclic adenosine mono-phosphate promotes axon regeneration and motor function re-covery in cerebral ischemia-reperfusion rats[J].Neurol India,2010,58(2):195-200

Effect of Electric Acupuncture on the Behavior of Vascular Dementia Rats and Activity of cAMP-PKA-CREB in Hippocampus

MA Li1,WANG Shi-tao2,LIU Zheng1△

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China; 2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective：To research the possible mechanism of electric acupuncture on frontal area of vascular dementia (VD) rats and to study the effect on cAMP-PKA-CREB signal pathways in hippocampus.Methods：60 male aging Wistar rats were randomly divided into a control group,a model group,an electric acupuncture group and a medicine group. In the experiment,we adopted 2-VO to duplicate VD models and used electric acupuncture treatment on the frontal area of rats’ heads for 30 days according to professor YU Zhi-shun’s treatment.By the end of the study,we examined the memory ability of rats according to Morris test and cAMP-PKA-CREB expressions were detected by western blot method.SPSS 16.0 software was applied to the available data for analysis and process.Results：Compared with model group,electric acupuncture treatment could obviously increase the scores of VD rats in Morris test.The treatment could significantly increase the number of cAMP and improve the expression of PKA-CREB.Conclusion：Electric acupuncture treatment can effectively improve the memory ability of VD rats,and adjust the cAMP-PKA-CREB signal pathway in the hippocampus of VD rats.

Electric acupuncture;Dementia;Vascular;Morris water maze;cAMP-PKA-CREB

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目，編號:12531654。

馬莉(1972-),女，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，從事針灸臨床與科研工作。

△通訊作者：劉征(1978-),男，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，從事針灸臨床工作。

R246.6

A

1005-0779(2017)01-0050-03

2016-06-22