李倩，楊水平，崔廣林，黃建國(guó)*，李隆云*，程玉淵

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065;3.河南省煙草公司南陽(yáng)市公司, 河南 南陽(yáng)473000)

不同種植年限條件下黃花蒿根際土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成

李倩1,3，楊水平1，崔廣林2，黃建國(guó)1*，李隆云2*，程玉淵3

(1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065;3.河南省煙草公司南陽(yáng)市公司, 河南 南陽(yáng)473000)

試驗(yàn)采集未種植、種植1年、3年和5年的黃花蒿根際土壤，采用常規(guī)分析和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，研究了土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成。結(jié)果表明，在人工種植黃花蒿的土壤中，微生物生物量碳氮減少，碳氮比例改變；脫氫酶、脲酶和蔗糖酶活性降低，酸性磷酸酶活性增強(qiáng)；說(shuō)明黃花蒿釋放的化感物質(zhì)選擇性抑制了土壤微生物生長(zhǎng)、繁殖和代謝。在不同種植年限的土壤中，主成分分析顯示代表不同種植年限土壤真菌群落的點(diǎn)在坐標(biāo)圖中分布距離較遠(yuǎn)，表明它們的群落組成發(fā)生了顯著變化(P<0.05)。此外，子囊菌門(mén)占土壤真菌的66.10%～95.28%，黃花蒿種植時(shí)間影響真菌門(mén)類(lèi)和優(yōu)勢(shì)真菌的豐富度。在前20種優(yōu)勢(shì)真菌中，有14種共存于不同種植年限的土壤中，每種土壤中存在1～3種獨(dú)有真菌，說(shuō)明土壤是決定真菌種群組成的主導(dǎo)因素，又因種植黃花蒿而改變。在栽培1～5年的黃花蒿土壤中，優(yōu)勢(shì)菌株中出現(xiàn)蒿屬的常見(jiàn)病菌——蒿白粉菌和艾菊柄銹菌，提高相應(yīng)病害的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

黃花蒿；土壤酶活性；真菌；高通量測(cè)序

重慶市是我國(guó)黃花蒿(Artemisiaannua)的主產(chǎn)區(qū)，種植面積和青蒿素產(chǎn)量分別占全國(guó)的70%和80%[1]。由于土地資源缺乏，黃花蒿連作現(xiàn)象十分普遍。但長(zhǎng)期持續(xù)連作，黃花蒿生長(zhǎng)不佳，青蒿素含量和產(chǎn)量下降；葉白粉病、莖腐病和根腐病等真菌性病害的發(fā)生率超過(guò)10%，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約黃花蒿種植業(yè)的發(fā)展[2-4]。

黃花蒿在生長(zhǎng)過(guò)程中，主要通過(guò)植株殘?bào)w腐解、根系分泌和雨水淋溶向土壤生態(tài)系統(tǒng)釋放倍半萜青蒿素類(lèi)、多甲氧基黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)和生物堿類(lèi)等物質(zhì)[5-6]。據(jù)報(bào)道，其主要化感物質(zhì)——青蒿素在土壤中的半衰期長(zhǎng)，對(duì)土壤微生物產(chǎn)生持續(xù)作用[7]，選擇性地殺抑枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、鑲刀菌(Fusariumsp.)、點(diǎn)枝頂孢菌(Elcremoniumstrictum)和黃曲霉(Aspergillasflavus)等土壤微生物[8-9]，但對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、小麥全蝕病菌(Gaeumannomycesgraminis)、禾谷絲核菌(Rhizoctoniazeae)和棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)無(wú)顯著影響[10-11]。在人工種植黃花蒿的根際土壤中，細(xì)菌、真菌和放線菌的動(dòng)態(tài)變化與青蒿素含量密切相關(guān)[12]。在野生黃花蒿生長(zhǎng)的土壤中，去氧青蒿素含量與放線菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.528**,n=24)；青蒿素含量與細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.508*和r=-0.478*,n=24)[13]。Herrmann等[5]發(fā)現(xiàn)，在種植黃花蒿的土壤中，可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量顯著低于未種植土壤。因此，種植黃花蒿可能影響土壤微生物的生長(zhǎng)、繁殖、代謝和種群結(jié)構(gòu)。

土壤微生物生物量碳氮和土壤酶活性可定量指示微生物數(shù)量、活性及代謝狀況[14]。真菌是土壤微生物的重要組分，具有多種多樣的生理、生化和生態(tài)功能，且多數(shù)真菌群落組成與重要病害發(fā)生密切相關(guān)。長(zhǎng)期連續(xù)種植人參(Panaxginseng)、三七(Panaxnotoginseng)、地黃(Rehmanniaglutinosa)和丹參(Salviamiltiorrhiza)等藥用植物之后，病原真菌增加，真菌病害大面積發(fā)生，造成大幅減產(chǎn)降質(zhì)[15]。在自然棲息環(huán)境中，150萬(wàn)種真菌僅有5%～10%被人類(lèi)認(rèn)識(shí)。目前采用的常規(guī)培養(yǎng)法僅能獲得土壤微生物總量的1%～3%[16]；真菌細(xì)胞膜的磷脂脂肪酸高度相似，通常只能檢測(cè)出18:1ω9c和18:3ω6c[17]；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳法(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)難于甄別單個(gè)真菌的基因序列[18]。迄今為止，對(duì)土壤真菌的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。高通量測(cè)序技術(shù)根據(jù)真菌18S rDNA的保守性，經(jīng)提取、擴(kuò)增、純化、定量和均一化真菌DNA序列，再經(jīng)測(cè)序、過(guò)濾、優(yōu)化、聚類(lèi)，對(duì)比基因庫(kù)中的已知序列，從而鑒別真菌種(屬)類(lèi)，是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所獲得微生物數(shù)量的十倍甚至數(shù)百倍，能準(zhǔn)確靈敏地檢測(cè)土壤真菌[19]。為此，本試驗(yàn)利用常規(guī)分析和Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，研究了重慶市黃花蒿主產(chǎn)區(qū)土壤中的微生物生物量、酶活性及真菌群落組成，旨在為克服黃花蒿連作障礙和保持高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)提供有益信息。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

重慶市巴南區(qū)東泉鎮(zhèn)黃花蒿栽培區(qū)位于北緯29°26′，東經(jīng)106°50′，海拔329 m。年均溫度18.7 ℃，氣溫-1～40.8 ℃；平均年降雨量1100 mm，主要集中在5-7月；霧期60～90 d，日照1100～1300 h；無(wú)霜期在300 d以上。樣地地貌平坦，土壤均勻一致，土壤類(lèi)型為三疊紀(jì)嘉陵江組石灰?guī)r發(fā)育的黃壤。土壤pH 5.91，有機(jī)質(zhì)13.14 g/kg，有效氮72.02 mg/kg，有效磷 20.13 mg/kg，有效鉀70.53 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開(kāi)始于2011年，在土壤條件均勻一致的黃花蒿種植區(qū)，選取12個(gè)小區(qū)，第一年隨機(jī)選取3塊種植黃花蒿，其余小區(qū)按照當(dāng)?shù)亓?xí)慣夏種玉米(Zeamays)，冬種油菜(Brassicacampestris)或小麥(Triticumaestivum)。在連作黃花蒿的第3年，隨機(jī)另選3個(gè)小區(qū)種植黃花蒿，以此類(lèi)推，在第5年時(shí)分別形成黃花蒿連作5年和3年，種植1年和未種黃花蒿(對(duì)照，種植玉米)的土壤，依次用Y5、Y3、Y1和Y0表示。黃花蒿品種為“渝青1號(hào)”，每年12月中旬播種育苗，次年4月上旬移栽，按照當(dāng)?shù)亓?xí)慣基施N-P2O5-K2O=25-10-5復(fù)合肥900 kg/hm2，常規(guī)管理。

1.3 樣品采集與測(cè)定

在黃花蒿現(xiàn)蕾期，每小區(qū)按“S”形隨機(jī)選取10株長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，拔出后輕輕抖落多余的土壤至每株剩50 g左右，然后用力抖動(dòng)取樣，合并土壤，揀去雜物，放入冰盒，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

將部分土壤晾干，分別用3,5-二硝基水楊酸比色法、次氯酸鈉—苯酚鈉比色法、磷酸苯二鈉比色法和TTC分光光度法測(cè)定土壤蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶和脫氫酶活性[20]。

另將部分新鮮土壤，分別測(cè)定微生物生物量碳氮和真菌ITS基因序列。土壤微生物生物量碳(microbial biomass carbon, MBC)和微生物生物量氮(microbial biomass nitrogen, MBN)采用氯仿熏蒸法:0.5 mol/L K2SO4提取，用K2Cr2O7氧化法測(cè)定提取液中的微生物生物量碳，靛酚藍(lán)比色法測(cè)定微生物生物量氮[16]。用OMEGA公司E.Z.N.A Soil DNA試劑盒抽提土壤基因組，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的大小及片段完整性，NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度，TBS-380檢測(cè)DNA濃度。用ABIGeneAmp?9700PCR儀對(duì)真菌ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為817F: 5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′和1196R: 5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′。PCR擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)，72 ℃終止延伸10 min結(jié)束。每個(gè)樣品3次重復(fù)，混合同一樣品的PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳，AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN 公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行定量。Miseq文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序均在上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeqPE300/PE250。測(cè)序結(jié)束后，對(duì)有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體等過(guò)濾處理，得到優(yōu)化序列，根據(jù)序列97%的相似性形成操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OUTs)，對(duì)比Unite庫(kù)，采用RDP classifier貝葉斯算法，得到OTUs的分類(lèi)學(xué)信息。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)基本計(jì)算，SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析，R語(yǔ)言工具和Origin 8.5作圖，單因素方差分析(one way-ANOVA)檢驗(yàn)不同種植年限處理間差異顯著性，CANOCO 4.5主成分分析(principal component analysis，PCA)不同處理間土壤微生物群落組成差異，顯著水平設(shè)置為P<0.05。真菌門(mén)的相對(duì)豐度為某門(mén)真菌18 S rDNA 讀數(shù)占真菌18 S rDNA 總讀數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同種植年限黃花蒿根際土壤微生物生物量碳氮 Fig.1 Changes of microbial biomass carbon and nitrogen in rhizospheric soils for A. annua cultivation Y0：未種植黃花蒿 Uncultivated A. annua；Y1：種植黃花蒿1年 Cultivated A. annua for 1 year；Y3：黃花蒿連作3年 Continuous cropping A. annua for 3 years；Y5：黃花蒿連作5年 Continuous cropping A. annua for 5 years.柱上方同一測(cè)定指標(biāo)有不同小寫(xiě)字母者表示差異顯著(P<0.05)，下同。Different small letters above the bars within same measurement item indicate a significant difference at P<0.05, the same below.

2.1 土壤微生物生物量碳氮

由圖1可見(jiàn)，隨黃花蒿種植年限增加，土壤微生物生物量碳氮持續(xù)降低。其中，微生物生物量碳降幅為30.04%～74.98%；微生物生物量氮降幅為38.01%～63.94%，微生物生物量碳氮比為18.88～31.80。

2.2 土壤酶活性

由表1可見(jiàn)，栽培黃花蒿不同程度地抑制土壤脲酶、脫氫酶和蔗糖酶活性。至栽培第5年，降幅依次為51.82%, 96.15%和53.76%。在種植黃花蒿前后，土壤酸性磷酸酶活性無(wú)顯著差異，但種植1年的土壤顯著低于種植3和5年的土壤。

2.3 土壤真菌

2.3.1 真菌門(mén)類(lèi) 高通量測(cè)序從Y0、Y1、Y3和Y5土壤中分別獲得了19358，23826，17385和12133個(gè)真菌ITS序列數(shù)(Reads)，依次代表96，69，98和86種真菌(OTUs)，歸屬于子囊菌門(mén)、壺菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)、球囊菌門(mén)、接合菌門(mén)和未知類(lèi)型，且豐富度因真菌門(mén)類(lèi)和種植黃花蒿而變化(圖2)。其中，子囊菌門(mén)占絕大多數(shù)，超過(guò)66.10%，在Y1土壤中的相對(duì)豐富度高達(dá)95.28%。

表1 不同種植年限黃花蒿根際土壤酶活性Table 1 Enzyme activities in rhizospheric soils with A. annua cultivated

注：在同行中，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：In each row, different small letters indicate significant differences among systems atP<0.05.

圖2 在門(mén)水平上，不同種植年限黃花蒿根際土壤中真菌群落組成Fig.2 Phyla in fungal communities in rhizospheric soils with A. annua grown for different yearsA:子囊菌門(mén)Ascomycota;B:壺菌門(mén)Chytridiomycota;C:擔(dān)子菌門(mén)Basidiomycota;D:球囊菌門(mén)Glomeromycota;E:纖毛亞門(mén)Ciliophora;F:后生動(dòng)物Metazoa;G:接合菌門(mén)Zygomycota;H:未分類(lèi)的真菌Fungi (unclassified).

2.3.2 優(yōu)勢(shì)真菌 在黃花蒿栽培前后的土壤中，前20種優(yōu)勢(shì)真菌的豐富度合計(jì)占真菌總量的93.37%以上。黃花蒿種植年限不同，其優(yōu)勢(shì)真菌種(屬)類(lèi)和豐富度也不一樣(表2)。值得注意的是，與未種植黃花蒿的土壤相比，栽培土壤中仍有14種共有真菌，它們是不可培養(yǎng)的糞殼菌、待定真菌-1、不可培養(yǎng)的皺褶球殼菌、待定糞殼菌、肉座菌目、刺盾炱目、待定子囊菌-1、格孢菌目 IRB20-2、不可培養(yǎng)球囊菌、踝節(jié)菌屬、傘菌目、待定傘菌、長(zhǎng)喙殼目和柱隔孢屬。

除上述共同存在的真菌之外，在Y0和Y1土壤中，均檢測(cè)到待定子囊菌-2；在Y0和Y3土壤中，待定纖毛菌和待定球囊菌相同；在Y0和Y5土壤中，均發(fā)現(xiàn)了待定球囊菌。在Y1、Y3和Y5土壤中，均存在待定真菌-3和蒿白粉菌；在Y3和Y5土壤中，均出現(xiàn)了待定真菌-3、蒿白粉菌、艾菊柄銹菌和待定球囊菌。

在黃花蒿栽培前后土壤中，檢測(cè)到各自1～3種獨(dú)有真菌，它們是Y0土壤中的待定壺菌、待定真菌-2和不可培養(yǎng)接合菌；Y1土壤中的待定座囊菌、座囊菌CRI7和銀耳科；Y3土壤中的待定接合菌門(mén)；Y5土壤中的不可培養(yǎng)的刺孢菌和待定球囊菌。

2.3.3 真菌群落組成主成分分析 圖3是黃花蒿種植前后，土壤真菌群落的主成分變異情況。Principal component 1和Principal component 2分別表示不同群落間65.83%和29.12%的變異度。代表Y0、Y1與Y3和Y5土壤真菌群落組成的點(diǎn)在坐標(biāo)圖中分布距離較遠(yuǎn)。其中，Y0位于象限III的左下方，Y1位于象限IV和Y軸右側(cè)的X軸上，Y3和Y5分別散落于Y軸左側(cè)的X軸上和左上方(象限Ⅱ)。

圖3 不同種植年限黃花蒿根際土壤真菌群落組成主成分分析Fig.3 Principal component analysis of fungal communities in rhizospheric soils with A. annua grown

3 討論

在人工種植黃花蒿的土壤中，微生物生物量碳氮顯著降低，種植時(shí)間愈長(zhǎng)，降幅越大，說(shuō)明長(zhǎng)期持續(xù)種植黃花蒿降低了土壤微生物數(shù)量，類(lèi)似Herrmann等[5]和劉飛等[21]的研究結(jié)果。在不同種植年限的黃花蒿根際土壤中，微生物生物量碳氮比相差1.68倍，意味著土壤微生物組成改變，其原因可能是黃花蒿釋放的青蒿素類(lèi)化合物選擇性地抑制了微生物生長(zhǎng)繁殖。據(jù)報(bào)道，土壤微生物是土壤酶的主要來(lái)源，它們的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)影響土壤酶活性[22-23]。傅慧蘭等[24]發(fā)現(xiàn)，隨種植年限增加，豆科作物根系分泌物在土壤中持續(xù)積累，作用于微生物和酶分子空間結(jié)構(gòu)，使脲酶、過(guò)氧化氫酶和轉(zhuǎn)化酶活性降低，酸性磷酸酶活性增強(qiáng)。與之類(lèi)似，在種植黃花蒿的土壤中，脲酶、脫氫酶和蔗糖酶活性降低；但連續(xù)種植3年以上則使酸性磷酸酶活性增強(qiáng)。在持續(xù)種植棉花(Gossypiumspp.)、番茄(Lycopersiconesculentum)、辣椒(Capsicumannuum)等的土壤中，土壤微生物和酶活性改變是發(fā)生連作障礙的重要原因之一[25-27]。因此，黃花蒿釋放的化感物質(zhì)影響土壤微生物生物量碳氮和酶活性，可能導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)形成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化供應(yīng)、毒物降解等生物化學(xué)過(guò)程紊亂，不利于黃花蒿生長(zhǎng)發(fā)育，使青蒿素含量和產(chǎn)量降低。

土壤真菌是土壤微生物的重要組分，具有多種多樣的生理、生化和生態(tài)功能，其內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列保守性極高，因此，本試驗(yàn)以此為分子標(biāo)記，鑒定黃花蒿種植土壤中的真菌種類(lèi)。結(jié)果表明，在不同黃花蒿種植年限的土壤中，真菌門(mén)類(lèi)及優(yōu)勢(shì)真菌的豐富度差異顯著；真菌群落組成主成分變異表明，種植黃花蒿改變了土壤真菌群落組成。但無(wú)論是否種植黃花蒿，在土壤前20種優(yōu)勢(shì)真菌中，仍有14種共有真菌，不同種植年限之間僅3～5種真菌不一樣，說(shuō)明土壤是決定真菌群落組成主導(dǎo)因素，但因種植黃花蒿而發(fā)生不同程度地變化。

在種植黃花蒿1年的土壤中，子囊菌門(mén)比對(duì)照顯著增加，相對(duì)豐富度高達(dá)95.28%。研究表明，多數(shù)子囊菌為植物病原真菌，可造成白術(shù)(Atractylodesmacrocephala)、地黃、三七和桔梗(Platycodongrandiflorus)等多種藥用植物發(fā)生根腐和莖腐病等[28]。隨黃花蒿種植年限增加，土壤中的球囊菌、座囊菌、接合菌和刺孢菌也逐漸成為優(yōu)勢(shì)真菌。眾所周知，座囊菌易引起香蕉和梨樹(shù)等果樹(shù)葉斑??；接合菌導(dǎo)致果蔬、食品等霉變腐爛；刺孢菌侵染蘭科作物形成炭疽病[29-30]。所以，連作黃花蒿可能提高某些作物發(fā)生真菌病害的幾率。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，新地種植黃花蒿，一般很少發(fā)生病蟲(chóng)害；短期連作黃花蒿，根腐病和莖腐病病害危害率為3%～5%，長(zhǎng)期連作病蟲(chóng)害發(fā)生率持續(xù)上升[31]。在未種植黃花蒿的土壤中，優(yōu)勢(shì)菌株中未檢測(cè)到蒿屬的特有病原真菌——蒿白粉菌和艾菊柄銹菌；但種植黃花蒿后，蒿白粉菌和艾菊柄銹菌均成為優(yōu)勢(shì)菌株。通常在連作條件下，某些植物會(huì)持續(xù)向病原微生物提供特有的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其生長(zhǎng)繁殖，造成病害大量發(fā)生[32]。Jessing等[7]發(fā)現(xiàn)，青蒿素類(lèi)物質(zhì)能夠選擇性殺抑土壤微生物，而部分微生物卻以它們?yōu)樘荚春蜖I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，連作黃花蒿持續(xù)釋放青蒿素類(lèi)物質(zhì)可能促進(jìn)蒿白粉菌和艾菊柄銹菌生長(zhǎng)繁殖，提高相應(yīng)病害的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。反之，在黃花蒿-馬鈴薯輪作體系中，由于中斷了青蒿素類(lèi)物質(zhì)進(jìn)入土壤，黃花蒿白粉病和莖腐病發(fā)生率則顯著下降[33]。

總之，人工栽培黃花蒿顯著降低土壤微生物生物量碳氮，改變土壤酶活性和真菌群落組成，選擇性增加病原菌數(shù)量。

References：

[1] Li L Y, Su S, Wu Y K. The Industrialization Production and Management of High QualityArtemisiaannua[M]. Chongqing: Chongqing Press, 2009. 李隆云, 舒抒, 吳葉寬. 優(yōu)質(zhì)青蒿產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與經(jīng)營(yíng)[M]. 重慶: 重慶出版社, 2009.

[2] Feng S X, Ma X J, Yan Z G,etal. Studies on the rotation model ofArtemisiaannua. China Journal of Chinese Meteria Medica, 2009, 34(4): 488-490. 馮世鑫, 馬小軍, 閆志剛, 等. 黃花蒿輪作模式的研究. 中國(guó)中藥雜志, 2009, 34(4): 488-490.

[3] Duke S O, Vaughn K C, Croom E M,etal. Artemisinin, a constituent of annual worm wood (Artemisiaannua), is a selective phytotoxin. Weed Science, 1987, 35(4): 499-505.

[4] Duke S O, Dayan F E, Romagni J G,etal. Natural products as sources of herbicides: current status and future trends. Weed Research, 2000, 40(1): 99-111.

[5] Herrmann S, Jessing K K, Jorgensen N O G,etal. Distribution and ecological impact of artemisinin derived fromArtemisiaannuaL. in an agricultural ecosystem. Soil Biology & Biochemistry, 2013, 57: 164-172.

[6] Jessing K K, Cedergreen N, Mayer P,etal. Loss of artemisinin produced byArtemisiaannuaL. to the soil environment. Industrial Crops and Products, 2013, 43: 132-140.

[7] Jessing K K, Cedergreen N, Jensen J,etal. Degradation and ecotoxicity of the biomedical drug artemisinin in soil. Environmental Toxicology and Chemistry, 2009, 28(4): 701-710.

[8] Lu H, Zou W X, Meng J C,etal. New bioactive metabolites produced byColletotrichumsp., an endophytic fungus inArtemisiaannua. Plant Science, 2000, 151(1): 67-73.

[9] Dhingra V, Rao K V, Narasu M L. Current status of artemisinin and its derivatives as antimalarial drugs. Life Science, 2000, 66(4): 279-300.

[10] Tang H Q, Hu J, Yang L,etal. Terpenoids and flavonoids fromArtemisiaspecies. Planta Medica, 2000, 66(4): 391-393.

[11] Shoeb H A, Tawfik A F, Shibl A M,etal. Antimicrobial activity of artemisinin and its derivatives against anaerobic-bacteria. Journal of Chemotherapy, 1990, 2(6): 362-367.

[12] Luo S Q. Study on Correlation between Soil Microorganism and Anti-malaria-related Compouds ofArtemisiaannuaL.[D].Chongqing: Southwest University, 2013. 羅世瓊. 黃花蒿土壤微生物與抗瘧相關(guān)成分的關(guān)聯(lián)性研究[D]. 重慶： 西南大學(xué), 2013.

[13] Li Q, Yuan L, Luo S Q,etal. Artemisinin and flavonoids in wildArtemisiaannuaand surrounding soil and the influence on soil microbes. Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(11): 29-37. 李倩, 袁玲, 羅世瓊, 等. 野生黃花蒿植株和土壤中的青蒿素、黃酮含量變化及其對(duì)土壤微生物的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(11): 29-37.

[14] Lin X G, Hu J L. Scientific connotation and ecological service function of soil microbial diversity. Acta Pedologica Sinica, 2008, 45(5): 892-900. 林先貴, 胡君利. 土壤微生物多樣性的科學(xué)內(nèi)涵及其生態(tài)服務(wù)功能. 土壤學(xué)報(bào), 2008, 45(5): 892-900.

[15] Tan G Y, Yang Z L, Yuan Z L,etal. Research advances in continuous cropping obstacle in medicinal plants and its management. Journal of Northwest A & F University: Natural Science Edition, 2012, 40(4): 197-204. 檀國(guó)印, 楊志玲, 袁志林, 等. 藥用植物連作障礙及其防治途徑研究進(jìn)展. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2012, 40(4): 197-204.

[16] Lin X G. Research on the Principle and Method of Soil Microorganisms[M]. Beijing: Higher Education Press, 2010.

[17] Zhang Q F, Liu B, Lin Y Z,etal. The diversity of phospholipid fatty acid (PLFA) biomarker for the microbial community in soil. Acta Ecologica Sinica, 2009, 29(8): 4127-4137. 張秋芳, 劉波, 林營(yíng)志, 等. 土壤微生物群落磷脂脂肪酸PLFA生物標(biāo)記多樣性. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 29(8): 4127-4137.

[18] Xia W W, Jia Z J. Comparative analysis of soil microbial communities by pyrosequencing and DGGE. Acta Microbiologica Sinica, 2014, 54(12): 1489-1499. 夏圍圍, 賈仲君. 高通量測(cè)序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評(píng)價(jià). 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(12): 1489-1499.

[19] Rhodes J, Beale M A, Fisher M C. Illuminating choices for library prep: a comparison of library preparation methods for whole genome sequencing ofCryptococcusneoformansusing Illumina Hiseq. PLoS One, 2014, 9(11): e113501.

[20] Guan S Y. Soil Enzyme and Its Research Methods[M]. Beijing: Agricultural Press, 1986. 關(guān)松蔭. 土壤酶及其研究方法[M]. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1986.

[21] Liu F, Wu X L, Cui G L,etal. Study on the relationship between the number of rhizosphere microorganisms and artemisinin content ofArtemisiaannua. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2010, 21(1): 37-38. 劉飛, 伍曉麗, 崔廣林, 等. 青蒿根際微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)及其與青蒿素含量的關(guān)系研究. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2010, 21(1): 37-38.

[22] Yang X J, Wang Y S, Duan L D,etal. Changes of soil microbial biomass and enzymatic activities among restoration stages of Langshan Forest Park, Hunan Province. Acta Prataculturae Sinica, 2014, 23(1): 142-148. 楊賢均, 王業(yè)社, 段林東, 等. 湖南崀山森林公園不同植被條件下土壤微生物量及酶活性研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2014, 23(1): 142-148.

[23] Sui Y Y, Jiao X G, Gao C S,etal. The relationship among organic matter content and soil microbial biomass and soil enzyme activities. Chinese Journal of Soil Science, 2009, 40(5): 1036-1039. 隋躍宇, 焦曉光, 高崇生, 等. 土壤有機(jī)質(zhì)含量與土壤微生物量及土壤酶活性關(guān)系的研究. 土壤通報(bào), 2009, 40(5): 1036-1039.

[24] Fu H L, Yang Z M. Effect of soybean continuous cropping on soil enzyme activity. Journal of Plant Nutrition and Fertilizer, 1996, (4): 374-377. 傅慧蘭, 楊振明. 大豆連作對(duì)土壤酶活性的影響. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào), 1996, (4): 374-377.

[25] Liu J G, Zhang W, Li Y B,etal. Effects of long-term continuous cropping system of cotton on soil physical-chemical properties and activities of soil enzyme in oasis in Xinjiang. Scientia Agricultura Sinica, 2009, 42(2): 725-733. 劉建國(guó)， 張偉， 李彥斌, 等. 新疆綠洲棉花長(zhǎng)期連作對(duì)土壤理化性狀與土壤酶活性的影響. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(2): 725-733.

[26] Sun Y Y, Jiang G Y, Liu J G,etal. Effects of continuous cropping tomato for processing on soil enzyme activities and microbial flora. Acta Ecologica Sinica, 2010, 30(13): 3599-3607. 孫艷艷, 蔣桂英, 劉建國(guó), 等. 加工番茄連作對(duì)農(nóng)田土壤酶活性及微生物區(qū)系的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2010, 30(13): 3599-3607.

[27] Liu L, Huang B J, Sun J,etal. Relationship between soil microbial quantity, enzyme activity and soil fertility in hot pepper greenhouse soils of different continuous cropping years. Soils and Fertilizers Sciences in China, 2013, (2): 5-10. 劉來(lái), 黃保健, 孫錦, 等. 大棚辣椒連作土壤微生物數(shù)量、酶活性與土壤肥力的關(guān)系. 中國(guó)土壤與肥料, 2013, (2): 5-10.

[28] Kang Z S. Current status and development strategy for research on plant fungal diseases in China. Plant Protection, 2010, 36(3): 9-12. 康振生. 我國(guó)植物真菌病害的研究現(xiàn)狀及發(fā)展策略. 植物保護(hù), 2010, 36(3): 9-12.

[29] Wang G F, Huang J S, Xie Y X,etal. Advances in research on sigatoka disease of banana. Journal of Fruit Science, 2006, 23(1): 96-101. 王國(guó)芬, 黃俊生, 謝藝賢, 等. 香蕉葉斑病的研究進(jìn)展. 果樹(shù)學(xué)報(bào), 2006, 23(1): 96-101.

[30] Li J H, Zhang L H. Study on appearance-character and comprehensive prevention ofOrchidanthracnose. Northern Horticulture, 2013, 18(18): 108-110. 李景蕻， 張麗華. 蘭花炭疽病的發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治. 北方園藝, 2013, 18(18): 108-110.

[31] Jiang Y S, Qi X X, Chen Z Y,etal. Main problems and strategy of artificial plantingArtemisiaannua. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2007, 18(9): 2184-2185. 蔣運(yùn)生, 漆小雪, 陳宗游, 等. 黃花蒿人工栽培種中存在的主要問(wèn)題及對(duì)策. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2007, 18(9): 2184-2185.

[32] Ehlers B K. Soil microorganisms alleviate the allelochemical effects of a thyme monoterpene on the performance of an associated grass species. PLoS One, 2011, 6(11): 1-5.

[33] Feng S X, Ma X J, Yan Z G,etal. Effects of crop rotation ofArtemisiaannuaand autumn species such as potatoes and other. Southwest China Journal of Agricultural Sciences, 2013, 26(1): 79-83. 馮世鑫, 馬小軍, 閆志剛, 等. 黃花蒿與馬鈴薯等秋種作物輪作的效應(yīng)分析. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 26(1): 79-83.

Microbial biomass, enzyme activity and composition of the fungal community in rhizospheric soil cropped with Artemisia annua for several years

LI Qian1,3, YANG Shui-Ping1, CUI Guang-Lin2, HUANG Jian-Guo1*, LI Long-Yun2*, CHENG Yu-Yuan3

1.CollegeofResourceandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 2.InstituteofChongqingChineseMedicine,Chongqing400065,China; 3.HenanNanyangTobaccoCompany,Nanyang473000,China

Artemisiaannua(Qinghao, Asteraceae) is widely grown in Chongqing, China, for extracting the antimalarial drug, artemisinin. Many research studies focus on the release of allelochemicals into soils via leaching with rainfall percolation, on root exudation, and on decomposition of dead plant residues in the growing process ofA.annuaand on the inhibition of the growth and development of adjacent and subsequent crops by these allelochemicals, particularly artemisinin. Soil microbes play roles in nutrient transformation, organic matter recycling, toxicant decomposition, and hormone efflux, among others. However, little is known about the influence of continuous cultivation of this medicinal plant on soil microorganism populations. Therefore, rhizospheric soils cropped withA.annuafor 1, 3, and 5 years were collected and analyzed by routine methods and Illumina MiSeq pyrosequencing to study microbial biomass, enzyme activity and fungal community components. Microbial biomass carbon (C) and nitrogen (N), and enzyme activities (dehydrogenase, urease and invertase) decreased, while C∶N in microbes varied, and acid phosphatase activity increased in soils with this medicinal plant compared that in the soil without this plant. These results suggest that allelochemicals released fromA.annuainto the rhizosphere inhibited the metabolism, growth and reproduction of microorganisms. Principal component coefficients of fungal communities in soils varied significantly, indicating great changes of fungal community structures. In soil fungal communities, Ascomycota was the largest group, accounting for 66.10%-95.28% of the total taxa detected, and there was a significant change in the abundance of both fungal phyla and the top species duringA.annuacultivation. Among the predominant fungi, 14 species were found in all soils, and only 1-3 unique species existed in each soil, suggesting that the soil was the most important factor governing the composition of the fungal community, but that community structure is also changed byA.annuacultivation.ErysipheartemisiaeandPucciniatanaceti, two pathogenic fungi which only infectA.annua, were found in the soils cropped withA.annua. The presence of these two pathogenic fungi in soils would increase the risk of disease incidence inA.annua. Therefore, rotation is advisable when croppingA.annua. Although our study provided some information about fungal community composition and diversity in the soil cropped withA.annua, a large number of microorganisms detected remain unidentified, and the functions of microbes classified is also not clear. The results confirm that the understanding of soil microbial communities remains very poor. Further study should focus on determining the identity and function of bacterial members of the microbial community, as these could be important in maintaining soil quality and function in cropping systems.Key words:Artemisiaannua; soil enzyme activity; fungi; high throughput sequencing

10.11686/cyxb2016091

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-03-08；改回日期：2016-05-11

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目(2013CB127405)，國(guó)家科技惠民計(jì)劃項(xiàng)目(2013GS 500102)，重慶市科技研發(fā)基地項(xiàng)目(cstc 2014ptyjd10001)，重慶市自然科學(xué)基金(cstc2011jjA 0861)和中央高?；?SWU113094)資助。

李倩(1987-)，女，河南鄭州人，博士。E-mail:qianqingzi@qq.com*通信作者Corresponding author. E-mail: huang99@swu.edu.cn, lilongyun8@163.co

李倩, 楊水平, 崔廣林, 黃建國(guó), 李隆云, 程玉淵. 不同種植年限條件下黃花蒿根際土壤微生物生物量、酶活性及真菌群落組成. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(1): 34-42.

LI Qian, YANG Shui-Ping, CUI Guang-Lin, HUANG Jian-Guo, LI Long-Yun, CHENG Yu-Yuan. Microbial biomass, enzyme activity and composition of the fungal community in rhizospheric soil cropped withArtemisiaannuafor several years. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(1): 34-42.