韓龍江劉清華許 飛溫海深李 軍

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 中科院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071; 2. 中國海洋大學(xué), 青島 266009; 3. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 4. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，

海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237)

長牡蠣精子超低溫冷凍后超微結(jié)構(gòu)損傷研究

韓龍江1,2劉清華1,3,4許 飛1,3,4溫海深2李 軍1,3,4

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所, 中科院實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266071; 2. 中國海洋大學(xué), 青島 266009; 3. 海洋生態(tài)養(yǎng)殖技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 青島 266071; 4. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室，

海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266237)

采用程序降溫儀分步降溫冷凍保存長牡蠣(Crassostrea gigas)精液, 并用掃描電鏡、透射電鏡研究了精子的超微結(jié)構(gòu)損傷。超低溫冷凍保存后長牡蠣精子的運(yùn)動(dòng)率、受精率及孵化率與鮮精無顯著差異。鮮精中84.5%的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常, 凍精中73%的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子表現(xiàn)為頂體、質(zhì)膜、線粒體與鞭毛結(jié)構(gòu)完整、染色質(zhì)形狀規(guī)則, 頂體、線粒體及中心粒結(jié)構(gòu)正常, 鞭毛形態(tài)完整、微管結(jié)構(gòu)清晰; 形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的精子表現(xiàn)為頂體脫落、解體, 精子頭部質(zhì)膜膨脹、破裂、染色質(zhì)腫脹、破裂、解體, 線粒體移位、脫落、膨脹, 嵴退化或消失, 鞭毛彎折、斷裂, 微管解聚。結(jié)果顯示, 以10% DMSO為抗凍保護(hù)劑, HBSS溶液為稀釋液, 1∶4的稀釋比例, 添加海藻糖, 采用分步降溫法冷凍保存, 對(duì)長牡蠣精子具有較好的抗凍保護(hù)作用, 合適的凍存方法可以有效的保護(hù)太平洋牡蠣精子冷凍過程中結(jié)構(gòu)損傷。研究有助于長牡蠣種質(zhì)資源的收集保存及應(yīng)用。

長牡蠣; 精子; 掃描電鏡; 透射電鏡; 超微結(jié)構(gòu)

檢測(cè)精子超低溫冷凍保存前后超微結(jié)構(gòu)損傷已被應(yīng)用于真鯛(Pagrosomus major)[1]、 中華鱘(Acipenser sinensis)[2]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[3]、太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)[4]、 蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[5]、太平洋鱈(Gadus macrocephalus)[6]、香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)[7]等魚、貝類的精子質(zhì)量檢測(cè)中。研究發(fā)現(xiàn),精子超低溫冷凍保存不可避免的會(huì)造成其超微結(jié)構(gòu)的損傷, 而精子超微結(jié)構(gòu)的完整與否又直接與精子活力相聯(lián)系, 進(jìn)而影響精子的受精能力。因此,研究精子超低溫冷凍保存前后超微結(jié)構(gòu)損傷變化情況對(duì)于精子冷凍保存方法的改善具有重要意義。長牡蠣(Crassostrea gigas)主要分布于中國大陸、中國臺(tái)灣地區(qū)、韓國等, 常棲息在潮間帶及淺海的巖礁海底, 在我國養(yǎng)殖范圍十分廣泛, 經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高。最近一段時(shí)間, 隨著我國海水養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展, 長牡蠣養(yǎng)殖規(guī)模呈不斷增大趨勢(shì), 累代養(yǎng)殖與近親交配的加劇, 不可避免地造成了長牡蠣種質(zhì)退化的現(xiàn)象, 開展長牡蠣精液的超低溫冷凍保存技術(shù)的研究具有重要意義[8,9]。有關(guān)長牡蠣精子的超低溫凍存的研究已有報(bào)道, 如李赟等[10]以滲透性抗凍保護(hù)劑超低溫凍存太平洋牡蠣精子, 復(fù)蘇后得到了較高的運(yùn)動(dòng)率, 并通過電子顯微鏡初步觀察了其超微結(jié)構(gòu)的變化; Dong等[11,12]在以2%聚乙二醇(PEG)及兩種不同抗凍保護(hù)劑間的組合為抗凍劑冷凍保存太平洋牡蠣, 獲得了最高的運(yùn)動(dòng)率及受精率。但上述報(bào)道的降溫過程多以液氮面以上一定高度來控制, 穩(wěn)定性差, 復(fù)溫解凍后精子運(yùn)動(dòng)率不高, 其精子超微架構(gòu)損傷較為嚴(yán)重, 以程序降溫儀精準(zhǔn)控制降溫程序超低溫冷凍保存長牡蠣精子, 并采用掃描電鏡和透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)損傷的研究尚未見報(bào)道。本研究以無鈣HBSS為稀釋液, 10% DMSO為抗凍劑, 添加0.45 mol/L海藻糖, 程序降溫儀精準(zhǔn)控制分步降溫超低溫冷凍保存長牡蠣精子, 采用掃描電鏡、透射電鏡技術(shù)研究了長牡蠣精子凍存前后超微結(jié)構(gòu)損傷情況, 探索超低溫凍存及解凍過程對(duì)長牡蠣精子損傷情況, 以期為長牡蠣精子超低溫凍存技術(shù)的改進(jìn)及凍精質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的長牡蠣由中國科學(xué)院海洋研究所海洋貝類增養(yǎng)殖與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供, 提前一周暫養(yǎng)于水族樓循環(huán)水系統(tǒng)的水族箱中, 暫養(yǎng)期間水溫控制在16—18℃, 每天上午10時(shí)換水一次, 實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇性腺飽滿的雄性長牡蠣(殼高8.8—10.5 cm,殼寬6.1—7.0 cm)通過人工解剖取精液, 解剖過程中盡量避免性腺組織的混入, 紗網(wǎng)過濾后放入50 mL離心管里, 顯微鏡觀察精子活力良好(運(yùn)動(dòng)率≥80%)置于4℃冰箱中用作精子超低溫冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

精子的超低溫凍存及解凍將精液稀釋液即無鈣HBSS溶液[13]與抗凍劑DMSO混合配制成抗凍液(DMSO占10%), 長牡蠣精液和抗凍液按1∶4比例加入到1.8 mL凍存管中, 并添加0.45 mol/L的海藻糖, 輕輕上下顛倒數(shù)次使其充分混勻后置于4℃的冰箱中預(yù)冷20min。在此期間, 打開程序降溫儀,設(shè)定好降溫程序(0℃開始, -15℃/min降溫至-60℃,停留120s后以-20℃/min降溫至-150℃, 停留300s),待程序降溫儀運(yùn)行穩(wěn)定后, 迅速將預(yù)冷過的凍存管裝入程序降溫儀中, 開始降溫。程序運(yùn)行結(jié)束后,采用37℃水浴鍋水浴解凍, 解凍期間用鑷子輕輕搖晃凍存管使其受熱均勻, 解凍后檢測(cè)凍精活力。

鮮精與凍精的活力測(cè)定按劉清華等[14]的方法檢測(cè)新鮮精液和解凍復(fù)蘇后精子活力, 具體操作為: 載玻片上滴加40 μL混有5% BSA的新鮮過濾滅菌海水, 采用滅菌后的牙簽輕輕沾取少量精液與其混勻, 置于顯微鏡下, 通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)(Computer-assisted sperm analysis, CASA)采集6個(gè)視野的視頻圖像, 統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)率, 精液運(yùn)動(dòng)率為一個(gè)視野內(nèi)快速運(yùn)動(dòng)精子數(shù)目占全部精子數(shù)目的百分比。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

受精率和孵化率的測(cè)定分別取鮮精、冷凍保存解凍精子與新鮮解剖的長牡蠣卵子人工授精, 測(cè)定其受精率和孵化率[15], 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)。

鮮精與凍精的超微結(jié)構(gòu)觀察掃描電鏡(Scanning electron microscope, SEM)觀察: 電鏡制片與觀察在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院完成, 具體操作為: 取鮮精與剛解凍的精液, 用新鮮配制的電鏡緩沖液配成2.5%的戊二醛避光條件下固定1d (4℃), 采用磷酸緩沖液(0.2 mol/L, pH=7.4)漂洗數(shù)次后用1%新鮮配制的鋨酸溶液4℃固定2h, 經(jīng)梯度酒精脫水后采用醋酸異戊脂置換, 最后離子鍍膜制成成片, 采用日本電子株式會(huì)社(JEOL公司)的JSM-840型掃描電鏡下觀察、拍照。

透射電鏡(Transmission electron microscopy, TEM)觀察: 取鮮精與凍融精液, 用新鮮配制的電鏡緩沖液配成的2.5%的戊二醛(0.2 mol/L, pH=7.4)避光條件下進(jìn)行前固定, 然后用1%新鮮配制的鋨酸溶液4℃固定2h, 依次采用不同梯度酒精脫水, Epon-812滲透包埋, 超薄切片機(jī)切片, 醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后制成成片, 置于透射電子顯微鏡(日立H-7000)下觀察、拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進(jìn)行處理, 并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA), 顯著性水平檢驗(yàn)采用Duncan氏比較分析, 所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式進(jìn)行表示, P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 長牡蠣鮮精及凍精的運(yùn)動(dòng)率、受精率和孵化率

鮮精和解凍后長牡蠣精子運(yùn)動(dòng)率、受精率和孵化率結(jié)果見表 1。結(jié)果表明, 鮮精與解凍后精子的活力相比差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 長牡蠣鮮精及凍精的超微結(jié)構(gòu)

掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果表明, 鮮精中形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的精子占全部精子數(shù)量的15.5%, 形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子占全部精子占84.5%; 解凍后精子中形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的精子占全部精子數(shù)量的27%, 形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子占全部精子的73%。

表 1 長牡蠣鮮精及凍精的運(yùn)動(dòng)率、受精率及孵化率 (n=3, X± SD)Tab. 1 Motility, fertilization rate and hatching rate of fresh sperm and frozen-thawed sperm of Crassostrea gigas (n=3, X±SD)

長牡蠣精子冷凍前后掃描電鏡超微結(jié)構(gòu)

由圖 1可知, 長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)主要由頭部和尾部兩部分組成, 精子全長約32 μm, 頸部不明顯。頭部呈近似圓形, 前端有一突出結(jié)構(gòu)為頂體, 頭部下方線粒體緊鄰頭部很清晰, 呈圓形, 4個(gè)緊密排列,圍繞在鞭毛周圍, 精子的鞭毛細(xì)長, 近頭部較粗遠(yuǎn)端漸細(xì), 主段均勻, 尾端逐漸變細(xì)。

超低溫冷凍保存解凍后對(duì)長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)的損傷主要表現(xiàn)在鞭毛脫落、彎折(圖 2A), 頂體直接消失, 質(zhì)膜皺縮, 鞭毛脫落(圖 2B); 線粒體變形、腫脹, 移位脫落, 頭部表面膜凹凸不平(圖 2C)精子頭部細(xì)胞膜破損凹陷, 質(zhì)膜間斷破裂、脫落,線粒體外膜膨脹、破裂, 內(nèi)容物流出, 尾部鞭毛腫脹(圖 2D)。

長牡蠣精子冷凍前后透射電鏡超微結(jié)構(gòu)

由圖 3可知, 長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)主要由頭部和尾部組成。頭部結(jié)構(gòu)主要包含頂體、亞頂體腔、染色質(zhì)、囊泡、中心體及線粒體等結(jié)構(gòu), 鞭毛由質(zhì)膜及微管組成(圖 3A、圖 3B), 頭部的主要部分由染色質(zhì)組成, 中心體由近端中心粒和遠(yuǎn)端中心粒垂直排列構(gòu)成, 近端中心粒靠近染色質(zhì), 遠(yuǎn)端中心?？拷廾蚝笱由斐鲚S絲, 兩中心粒呈垂直排列, 囊泡鑲嵌于染色質(zhì)中(圖 3B), 4個(gè)線粒體呈環(huán)形排列,內(nèi)有大量致密嵴狀結(jié)構(gòu), 中心粒位于4個(gè)線粒體中間(圖 3C), 精子尾部為細(xì)長的鞭毛結(jié)構(gòu), 呈現(xiàn)典型的“9+2”微管軸絲結(jié)構(gòu), 外面包有質(zhì)膜結(jié)構(gòu), 軸絲由雙連體和中央微管組成, 9組雙連體微管均勻分布在外面, 一組中央微管位于中間, 二聯(lián)體微管致密,結(jié)構(gòu)清晰可辨(圖 3D)。電鏡觀察顯示, 鮮精形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的精子表現(xiàn)為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)完整、無破裂變形現(xiàn)象, 質(zhì)膜無膨脹破裂, 中心粒結(jié)構(gòu)正常, 線粒體形態(tài)完整、嵴較發(fā)達(dá), 鞭毛結(jié)構(gòu)完整、清晰(圖 3)。

透射電鏡形態(tài)結(jié)構(gòu)異常的精子表現(xiàn)在質(zhì)膜、核內(nèi)部結(jié)構(gòu)、線粒體、染色質(zhì)和鞭毛等結(jié)構(gòu)。超低溫冷凍對(duì)部分長牡販精子造成了嚴(yán)重的影響, 具體表現(xiàn)為頭部染色質(zhì)的破裂變形, 核變形、核內(nèi)空泡增多, 甚至整體分解, 質(zhì)膜破裂消失, 頭部頂體處質(zhì)膜破損, 頭部核質(zhì)膜破損缺失, 核膜間斷或局部破裂、脫落, 裙皺增多且膜的連續(xù)性遭到破壞, 線粒體腫脹、大小不一(圖 4A), 頂體結(jié)構(gòu)受損傷、變松散、解體, 質(zhì)膜腫脹, 頭部質(zhì)膜與內(nèi)部間隙加大,線粒體破裂變形, 鞘外質(zhì)膜缺損, 線粒體膜不完整,內(nèi)部嵴結(jié)構(gòu)損傷、疏松, 球形的線粒體缺失、結(jié)構(gòu)松散甚至脫落, 內(nèi)容物流出, 尾部斷裂及中心粒結(jié)構(gòu)消失等(圖 4B), 長牡蠣頭部頂體內(nèi)含多種酶類,對(duì)于精子入卵具有重要作用, 頂體結(jié)構(gòu)的損傷會(huì)對(duì)精子功能產(chǎn)生一定的影響。在超低溫冷凍過程中發(fā)現(xiàn)的頂體結(jié)構(gòu)的損傷甚至缺失, 表明超低溫冷凍過程一定程度上會(huì)對(duì)對(duì)精子產(chǎn)生損傷, 進(jìn)而影響其生理功能。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn), 超低溫冷凍過程對(duì)長牡蠣精子頭部造成的損傷主要表現(xiàn)在頂體松散、變形, 染色質(zhì)缺失, 核頂變形、染色質(zhì)側(cè)面出現(xiàn)凹陷, 核表面不均勾, 內(nèi)部結(jié)構(gòu)彌散, 線粒體部分或全部脫落消失(圖 4C), 冷凍對(duì)精子尾部損傷主要表現(xiàn)為: 精子尾部腫脹變形, 形狀不規(guī)則, 變形嚴(yán)重, 二聯(lián)微管解聚、彌散(圖 4D)。

圖 1 長牡蠣鮮精掃描電鏡觀察Fig. 1 The ultrastructure of fresh spermatozoa of Crassostrea gigas by SEMA. 鮮精整體掃描電鏡照片; B、D. 單個(gè)精子掃描電鏡圖, 示精子頭部近似圓形, 頂體位于頭部前方, 部分線粒體整齊排列, 鞭毛細(xì)長; C. 示精子頭部結(jié)構(gòu), 頂體、頭部、線粒體及鞭毛依次排列; h: 頭; t: 鞭毛; a: 頂體; mi: 線粒體A. Fresh sperm of SEM; B, D. Single sperm of SEM, The sperm head approximate circular, acrosome located in the front of head, Some mitochondria ranked neatly, flagella slender; C. The structure of sperm head, head, acrosome mitochondria and flagella lined. h: head; t: flagellum; a: acrosome; mi: mitochondria

圖 2 長牡蠣凍精掃描電鏡觀察Fig. 2 The ultrastructure of cryopreserved spermatozoa of Crassostrea gigas by SEMA. 凍精整體掃描電鏡照片, 示鞭毛脫落、折斷; B. 兩個(gè)精子掃描電鏡圖, 示頭部頂體脫落, 質(zhì)膜皺縮變形; C、D. 單個(gè)精子掃描電鏡圖, 示部分線粒體脫落、破損, 質(zhì)膜皺縮, 胞膜凍裂, 細(xì)胞液外流; h: 頭; a: 頂體; t: 鞭毛; mi: 線粒體A. The whole frozen sperm of SEM, flagellum fall off, bend; B. Two frozen sperm of SEM, acrosome fall off head, plasmalemma collapse; C, D. Single frozen sperm of SEM, some of mitochon dria fall off, damaged, plasmalemma plasmolysis, cell membrane frost cleft, cytosol outflow; h: head; a: acrosome; t: flagellum; mi: mitochondria

3 討論

3.1 長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

電子顯微鏡觀察長牡蠣精子冷凍前后的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn), 長牡蠣精子主要由頭部、中段和尾部組成。頭部近似圓形, 與大多數(shù)魚類和貝類精子相似[11,16]。頭部頂端有頂體, 向后依次為亞頂體腔、染色質(zhì)、線粒體、中心粒和鞭毛。精子中段不明顯, 由4個(gè)線粒體圍繞中心粒組成, 與香港牡蠣等精子的超微結(jié)構(gòu)相似[7]。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn), 牡蠣精子尾部鞭毛結(jié)構(gòu)細(xì)長, 其長度與幾種常見貝類精子長度基本相似, 但與鳥類、魚類和哺乳類精子鞭毛長度相差較大[17,18]。鞭毛軸絲呈典型的“9+2”結(jié)構(gòu), 與香港巨牡蠣、皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)和蝦夷扇貝等精子相同[5,7,19], 解凍后精子中有一定比例的精子形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的損傷,主要損傷表現(xiàn)為頂體全部或部分消失, 染色質(zhì)破裂損傷, 甚至整體分解, 核變形、質(zhì)膜破裂損傷, 線粒體結(jié)構(gòu)彌散, 內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)破裂, 膜內(nèi)物質(zhì)外流, 嵴疏松變形, 甚至脫落。鞭毛腫脹、彎折, 精子鞭毛中間位置膨脹、斷裂, 二聯(lián)微管解聚等。掃描電鏡和透射電鏡能從精子超微結(jié)構(gòu)的變化程度來表示超低溫冷凍前后精子結(jié)構(gòu)上的變化。長牡蠣精子凍融后超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)部分精子頂體結(jié)構(gòu)破裂甚至缺失、精子細(xì)胞膜腫脹甚至破裂; 線粒體破裂, 體內(nèi)嵴結(jié)構(gòu)變形, 膜結(jié)構(gòu)破損腫脹變形, 內(nèi)容物流出;鞭毛彎折、斷裂[18]。與其他海洋動(dòng)物精子超低溫冷凍過程中超微結(jié)構(gòu)的損傷基本一致。

圖 3 長牡蠣鮮精透射電鏡觀察Fig. 3 The ultrastructure of fresh spermatozoa of Crassostrea gigas by TEMA. 鮮精縱切, 示單個(gè)精子整體縱切; B. 鮮精頭部縱切, 示鮮精頭部超微結(jié)構(gòu); C. 鮮精橫切, 示線粒體超微結(jié)構(gòu); D. 鮮精鞭毛橫切, 示鞭毛典型“9+2”結(jié)構(gòu); a: 頂體; b: 亞頂體腔; c: 中心體; t:鞭毛; cm:中央微管; dm: 雙連體; pm: 質(zhì)膜; mi: 線粒體; nu: 核A. Fresh sperm rip cutting; B. Fresh sperm head rip cutting, show ultrastructure; C. Fresh sperm rip cutting, show mitochondria ultrastructure; D. Fresh sperm flagellum crosscut, show “9+2”structure. a: acrosome; b: cavity; c: centrosome; t: flagellum; cm: central microtubules; dm: double conjoined; pm: plasma membrane; mi: mitochondria; nu: nucleus

圖 4 長牡蠣凍精透射電鏡觀察Fig. 4 The ultrastructure of fresh spermatozoa of Crassostrea gigas by TEMA. 凍精縱切, 示胞膜破裂, 染色質(zhì)破損、變形, 鞭毛脫落; B. 凍精斜切, 示質(zhì)膜腫脹, 頂體解體, 線粒體損傷; C. 鮮精縱切, 示線粒體脫落, 染色質(zhì)破損; D. 凍精鞭毛橫切, 下部鞭毛示精子典型“9+2”, 上部鞭毛示微管解聚, 膜皺縮變形; a: 頂體; b: 亞頂體腔; c: 中心體; t: 鞭毛; cm: 中央微管; dm: 雙連體; pm: 質(zhì)膜; mi: 線粒體; nu: 核A. Frozen sperm rip cutting show membrane rupture, chromatin damaged, flagellum fall off; B. Frozen sperm bevel, show plasma membrane swollen, disintegration of acrosome, mitochondria damage; C. Frozen sperm rip cutting, show mitochondrial loss, chromatin damaged; D. Frozen sperm flagellum crosscut, show“9+2” structure. a: acrosome; b: cavity; c: centrosome; t: flagellum; cm: central microtubules; dm: double conjoined; pm: plasma membrane; mi: mitochondria; nu: nucleus

3.2 精子結(jié)構(gòu)損傷與精子功能之間的關(guān)系

一般認(rèn)為, 凍精結(jié)構(gòu)改變的主要原因是細(xì)胞內(nèi)冰晶造成的損傷[20,21]。雖然抗凍保護(hù)劑對(duì)精子超低溫冷凍過程具有一定的保護(hù)作用, 在一定程度上能夠有效避免精子超微結(jié)構(gòu)的損傷, 但仍有部分精不可避免的會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化, 影響其生理功能,最終體現(xiàn)為影響精卵識(shí)別與受精[22]。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)精子超微結(jié)構(gòu)的變化主要有: 精子內(nèi)部染色質(zhì)的變化, 如染色質(zhì)彌散或腫脹[23,24]; 細(xì)胞器的損傷, 如線粒體消失、破損或內(nèi)嵴損傷[25]; 精子質(zhì)膜的變化, 如破裂、消失或腫脹; 鞭毛結(jié)構(gòu)的損傷, 如鞭毛腫脹、軸絲斷裂、微管解聚等[26]。牡蠣精子的向前運(yùn)動(dòng)主要是由尾部鞭毛的擺動(dòng)完成, 而精子鞭毛完成這一功能是由線粒體來提供能量的, 線粒體是大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞主要的的供能細(xì)胞器。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn), 解凍后精子中有部分精子線粒體受損傷, 其生理功能降低甚至喪失, 表現(xiàn)為精子活力下降甚至完全失活, 長牡蠣精子線粒體及鞭毛是精子完成運(yùn)動(dòng)功能主要結(jié)構(gòu), 它們的損傷不可避免地會(huì)造成精子功能的下降, 進(jìn)而影響精子入卵[27]。精子內(nèi)部存在眾多由膜包被而成的細(xì)胞器, 發(fā)揮著重要的生理功能, 由于精子內(nèi)部膜結(jié)構(gòu)主要有磷脂雙分子層和鑲嵌在其中的蛋白質(zhì)組成, 其結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性也決定了其對(duì)外界溫度變化比較敏感, 加之冷凍、復(fù)溫過程中冰晶的產(chǎn)生, 致使其在超低溫冷凍保存過程中極易受到損傷, 精子冷凍及復(fù)溫過程中細(xì)胞膜的損傷, 破壞了精子正常的生理結(jié)構(gòu), 不可避免地造成精子功能的紊亂。與之相反的, 精子的非膜性結(jié)構(gòu)和細(xì)胞核染色質(zhì)等結(jié)構(gòu)在超低溫冷凍過程中抗凍能力較強(qiáng)。目前大部分精子超低溫冷凍保存研究, 不同學(xué)者在研究不同物種精子凍存過程中采用了不同的凍存方法, 但超低溫凍存過程對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)損傷主要集中在精子相對(duì)脆弱的膜系統(tǒng)上[28]。章龍珍等[29]在鱘魚精子超低溫凍存研究中發(fā)現(xiàn), 超低溫凍存對(duì)精子超微結(jié)構(gòu)的損傷主要集中在精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破損, 從而改變了精子細(xì)胞內(nèi)部特有的相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境, 精子細(xì)胞膜上膜脂發(fā)生晶格化的一種現(xiàn)象, 影響了精子細(xì)胞的功能,最終影響了精子活力, 致使其受精能力的下降。程順等[3]以Cortland溶液為稀釋液, 10% DMSO為抗凍劑冷凍大黃魚精子過程中發(fā)現(xiàn), 大黃魚精子超低溫冷凍及水浴復(fù)溫過程中, 鞭毛軸絲內(nèi)結(jié)構(gòu)并未發(fā)生明顯改變, 精子冷凍保存過程并未對(duì)軸絲結(jié)構(gòu)產(chǎn)生大的影響。張蓮蕾等[1]對(duì)真鯛精子冷凍的研究中發(fā)現(xiàn), 復(fù)蘇后的凍融精子中, 超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)70%以上的精子具有相對(duì)完整的線粒體結(jié)構(gòu)和完整且均勻的精子細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 剩余精子細(xì)胞不同程度上存在結(jié)構(gòu)的變化和損傷, 并指出真鯛精子超微結(jié)構(gòu)的受損, 尤其是相關(guān)功能蛋白結(jié)構(gòu)的變化時(shí)導(dǎo)致精子活力及生理機(jī)能變化的重要原因。李赟等[10]以10% DMSO為抗凍劑, 采用距液氮面以上不同高度的方法控制降溫速率冷凍保存太平洋牡蠣精子,并采用電子顯微鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)損傷情況, 研究表明, 在解凍后的精子中有一部分超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了不同程度的變化, 超低溫冷凍和升溫解凍, 對(duì)牡蠣部分精子的膜結(jié)構(gòu)損傷嚴(yán)重, 導(dǎo)致精子活力和受精能力下降。超低溫冷凍保存也會(huì)對(duì)鞭毛造成一些不可逆的傷害, 破壞了許多功能蛋白的作用, 對(duì)精子尾部的損傷造成軸絲結(jié)構(gòu)破壞, 從引起精子運(yùn)動(dòng)功能的喪失, 線粒體和鞭毛在精子運(yùn)動(dòng)過程中主要起著供能和提供向前動(dòng)力的作用, 線粒體通過消耗精子細(xì)胞內(nèi)部的ATP為鞭毛擺動(dòng)提供能量, 鞭毛擺動(dòng)給精子提供了一種向前的動(dòng)力[30]。研究表明, 大部分魚類精子在性腺中是不運(yùn)動(dòng)的, 只有當(dāng)精子收到外界(滲透壓、離子、蛋白質(zhì))的刺激后, 精子才能激活, 鞭毛開始擺動(dòng)并提供一種向前的動(dòng)力[31]。于海濤等[32]以10% DMSO為抗凍劑, 分段冷凍法保存紅鰭東方鲀[Fugu rubripes (Temminck et Schlegel)]精子, 電鏡觀察發(fā)現(xiàn)鞭毛斷裂或被膜膨脹脫落, 導(dǎo)致了精子活力下降。因此在精子超低溫冷凍保存過程中, 我們多選擇那些毒性低、滲透性較好的抗凍保護(hù)劑來保護(hù)精子凍存過程中的損傷[33,34]。韓龍江等[6]在超低溫冷凍太平洋鱈精子時(shí)發(fā)現(xiàn), 超低溫冷凍及復(fù)溫過程對(duì)精子鞭毛結(jié)構(gòu)的損傷多集中于精子鞭毛中段, 并指出這可能是因?yàn)楸廾卸翁厥饨Y(jié)構(gòu)造成的, 膜結(jié)構(gòu)的脆弱使其在冷凍過程中更易受到損傷。朱豪磊等[7]在香港牡蠣精子冷凍過程中發(fā)現(xiàn), 精子膜的損傷對(duì)保存精子的活力影響很大,精子超微結(jié)構(gòu)異常主要表現(xiàn)為精子細(xì)胞膜及核膜的破損腫脹, 線粒體缺失或破損, 鞭毛彎折、斷裂甚至脫落, 染色質(zhì)彌散解體等, 與本研究觀察到的的長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)冷凍損傷情況基本一致。

4 小結(jié)

本研究表明長牡蠣精子冷凍保存前后運(yùn)動(dòng)率差異不顯著, 其受精能力亦無顯著差異, 解凍后長牡蠣精子超微結(jié)構(gòu)形態(tài)正常的占84.5%, 說明以10% DMSO作為抗凍保護(hù)劑, 添加海藻糖HBSS作為稀釋液, 對(duì)長牡蠣精子超低溫冷凍保存具有較好的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)組凍融后精子受精率、孵化率高于鮮精。我們猜測(cè)一方面可能是由于在精子冷凍過程中, 質(zhì)量差的精子被凍死, 質(zhì)量好的精子存活了下來, 存活下來的優(yōu)質(zhì)精子提高了精子的受精率及孵化率。另一方面, 在長牡蠣受精實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn), 過多或者過少的精子圍繞在卵子周圍均對(duì)卵子的受精及孵化產(chǎn)生一定的影響, 鮮精精子密度不可避免的會(huì)高于凍精。因此, 在本實(shí)驗(yàn)中, 可能由于活力差、運(yùn)動(dòng)速率慢的精子死亡, 存活下來的精子質(zhì)量提高及圍繞在卵子周圍精子數(shù)量更加適合卵子的受精導(dǎo)致了精子受精率、孵化率略高于鮮精, 但二者之間差異不顯著。電子顯微鏡技術(shù),可以用于探索長牡蠣精子超低溫保存及復(fù)溫過程中冷凍損傷情況, 有助于篩選更加有效的精子凍存方法, 推動(dòng)精子超低溫冷凍損傷機(jī)理的研究。今后可以采用流式細(xì)胞儀、單細(xì)胞凝膠電泳及高效色譜技術(shù)繼續(xù)深入分析長牡蠣精子冷凍前后膜結(jié)構(gòu)、染色質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)各生化成分的變化, 以便探討超低溫凍存精子細(xì)胞性結(jié)構(gòu)損傷的機(jī)制。

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STUDY ON ULTRASTRUCTURE OBSERVATION OF FRESH AND CRYOPRESERVATED SPERM IN CRASSOSTREA GIGAS

HAN Long-Jiang1,2, LIU Qing-Hua1,3,4, XU Fei1,3,4, WEN Hai-Shen2and LI Jun1,3,4
(1. Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266009, China; 3. National & Local Joint Engineering Laboratory of Ecological Mariculture, Qingdao 266071, China; 4. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China)

A step-wise cooling schemes was employed to cryopreserve Crassostrea gigas sperm, and the sperm ultrastructure was observed by scanning electron microscopy and transmission electron microscopy. The results showed that there were no significant differences between frozen-thawed sperm and fresh sperm in the motility, fertilization rate and hatching rate. Both the fresh sperm and cryopreserved sperm had ultrastructural damages. The normal rates of the fresh and cryopreservated sperms were 84.5% and 73%, respectively. The cryopreserved sperm without damage had normal morphology in the plasma membrane, mitochondria and nuclear, the acrosome, and centriole, and the mitochondrion obtained integrity with well-developed cristae. The sperm cryodamages with damages had swelled or disrupted plasma and nuclear membrane, partially damaged nucleus and swelled, dislocated or disarticulated mitochondrion with degenerated or vanished cristae. The results showed that HBSS with at 1∶4 dilution trehalose and 10% DMSO is the best condition for extender and cryoprotecant and for protecting the frozen-thawed C. gigas sperm, which will benefit the preservation of C. gigas and application of sperm cryopreservation skills.

Crassostrea gigas; Sperm; Cryopreservation; Vitality; Ultrastructure

S917

A

1000-3207(2017)01-0220-08

10.7541/2017.28

2016-02-19;

2016-06-21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2012AA10A402); 海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展區(qū)域示范項(xiàng)目(12PYY001SF08); 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(2010CB126401); 鰲山科技創(chuàng)新計(jì)劃(2015ASKJ02，2015ASKJ02-03-03)水產(chǎn)種質(zhì)資源平臺(tái)運(yùn)行服務(wù)項(xiàng)目; 中國科學(xué)院青促會(huì)項(xiàng)目資助 [Supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) No (2012AA10A4020); Regional Demonstration Project of Marine Economic Innovation and Development (12PYY001SF08); National Basic Research Program of China (2010CB126401); Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology (No.2015ASKJ02, 2015ASKJ02-03-03); Aquatic Germplasm Resources Platform Running Services; Youth Innovation Promotion Association CAS]

韓龍江(1989—), 男, 山東濰坊人; 理學(xué)碩士; 主要從事海洋動(dòng)物種質(zhì)資源保藏與海水魚類繁殖生理研究。E-mail: hanlong jiang1989@163.com; 劉清華為并列第一作者

溫海深, wenhaishen@ouc.edu.cn; 李軍, 研究員, 主要從事魚類繁育研究。E-mail: junli@qdio.ac.cn