黃博聞+劉茜+郜華僑+張陽+劉金蘭

摘要：從患有腐皮病的錦鯉（Cryprinus carpio）肝、腎、脾、血液里分離到1株優(yōu)勢菌，對該菌進行純化培養(yǎng)并經(jīng)人工感染試驗，確定該菌為病原菌。經(jīng)16S rRNA序列分析，鑒定該病原菌為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。用不同濃度福爾馬林和不同溫度滅活蠟樣芽孢桿菌，篩選其滅活效果并制得滅活疫苗。將滅活疫苗免疫健康錦鯉后測定其抗體效價變化及免疫保護率。結(jié)果表明，0.2%的福爾馬林溶液在28 ℃下滅活24 h及4 ℃滅活36 h為蠟樣芽胞桿菌的適宜滅活條件。首次免疫后第20天，免疫Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組血清抗蠟樣芽孢桿菌的抗體效價達到高峰，分別為1∶128、1∶64、1∶64、1∶32；第30天同樣劑量加強免疫后，各免疫組血清抗體效價達到更高水平，分別為1∶256、1∶256、1∶128、1∶64；免疫后第50天時攻毒，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組免疫保護率分別為66%、66%、55%、44%。

關鍵詞：蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；錦鯉（Cryprinus carpio）；滅活疫苗；抗體效價；免疫保護力

中圖分類號：S942.5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）20-5320-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.20.038

Abstract： A dominant bacteria strain was isolated from the liver，kidney，spleen and blood of diseased Cryprinus carpio and confirmed as pathogenic bacteria strain by purified culture and artificial infection. It was identified as Bacillus cereusr by 16SrRNA sequence analysis. The optimal inactivated condition for preparing the inactivated vaccine of Bacillus cereusr was determined through treated with different concentrations of formalin and temperature on bacteria. The antibody titers of serum and relative percentage of survival（RPS） were determined after immune healthy Cryprinus carpi. The results showed that the optimal inactivation conditions of Bacillus cereusr were 28 ℃ for 24 h or 4 ℃ for 36 h with the concentration of 0.2% formalin. On the 20th day after the first immunization the serum antibody titer of Cryprinus carpi against Bacillus cereus reached the peak and that of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 1∶128，1∶64，1∶64 and 1∶32，respectively. The antibody titers of all immunized groups reached a higher level when got second immunization with the same dose as the first immunization and that of groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳwere 1∶256，1∶256，1∶128 and 1∶64 on the 30th day after the first immunization，respectively. The RPS of immunized groupⅠ，Ⅱ，Ⅲ and Ⅳ were 66%，66%，55% and 44% on the 50th day after the first immunization，respectively.

Key words：Bacillus cereus； Cryprinus carpio； inactivated vaccine； antibody titres； relative percent survival（RPS）

錦鯉（Cyprinus carpio）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinid）鯉屬（Cryprinus），為大型觀賞魚類。近年來錦鯉養(yǎng)殖密度越來越大，加上水質(zhì)不易調(diào)控，導致錦鯉腐皮病發(fā)病率居高不下[1]，不僅影響了錦鯉的觀賞價值，還易引起錦鯉大量死亡。目前從魚類腐皮病上已分離到的致病菌有點狀產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas punctata Sub. punctata）、殺鮭氣單胞菌（A. salmonicida）、嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）和維氏氣單胞菌（A.veronii）[2-5]，對這些病原菌的抑制或殺滅多是采用抗生素類藥物[6，7]，但長期使用抗生素類藥物導致病原菌的耐藥性問題日趨嚴重，同時對養(yǎng)殖水體也造成一定的污染。已有研究表明水產(chǎn)疫苗對魚類具有良好的免疫保護效果，同時可增強魚體抗應激能力，且符合友好環(huán)境的要求[8]。目前水產(chǎn)動物疫苗研制集中于大規(guī)模養(yǎng)殖的食用魚疾病[2-5]，多采用注射免疫途徑，給苗不便成為制約水產(chǎn)疫苗推廣應用的關鍵因素[8]。而錦鯉養(yǎng)殖具有養(yǎng)殖水體小、養(yǎng)殖數(shù)量少、易于操作和經(jīng)濟價值高等特點，這些特點為疫苗的實施提供了可行性。本試驗旨在通過研制錦鯉腐皮病安全有效的滅活疫苗并用于臨床預防，為錦鯉腐皮病防控提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與鑒定

1.1.1 病原菌分離 患病錦鯉取自北京市某錦鯉養(yǎng)殖場，體長15.2～18.5 cm，體重105.7～130.6 g。臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚軀干部和鰭基部等部位伴有充血、出血、鱗片脫落、肌肉外露等潰瘍灶。在超凈工作臺解剖有典型病癥的患病錦鯉，取病魚的肝、脾、腎、血液組織劃線接種于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。挑取單個優(yōu)勢菌落重復劃線于普通固體培養(yǎng)基上，獲得的純化菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1.1.2 人工感染 將分離到的細菌接種于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用0.8%無菌生理鹽水洗脫平板菌苔，制成濃度為1×108 CFU/mL的菌懸液備用。試驗魚由天津市鯉魚良種場提供，養(yǎng)殖于圓形水泥池（直徑為1.2 m、高1.0 m），池水預消毒曝氣5 d。將20尾健康錦鯉（體重101.3～122.1 g，體長13.5～16.7 cm）分兩組，每組10尾，暫養(yǎng)5 d后一組腹腔注射0.2 mL/尾菌懸液（1×108 CFU/mL），另一組腹腔注射無菌生理鹽水（0.2 mL/尾）。飼養(yǎng)過程中24 h氣泵增氧，三日換水量為1/3，正常投喂配合飼料，記錄魚體發(fā)病及死亡情況。取感染致死的錦鯉內(nèi)臟組織和血液進行細菌再分離。

1.1.3 病原菌鑒定 16S rRNA序列分析：使用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取細菌DNA，作為PCR反應模板備用。引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGG-3′）、1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）（北京生工生物工程有限公司合成）。將引物稀釋至5 μmol/L，-20 ℃存儲備用。PCR反應體系25 μL：正反引物各1 μL，模板2 μL， MgCl2 2 μL，dNTP 0.5 μL，PCR buffer 2.5 μL，Taq聚合酶0.3 μL，用ddH2O補足。PCR反應條件：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性50 s；50 ℃退火50 s；72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列測定，將序列與GenBank中序列進行比對分析，用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 疫苗的制備

1.2.1 疫苗制備及條件的確定 用無菌蒸餾水將福爾馬林配制成梯度濃度0.2%、0.4%、1.0%、2.0%、3.0%，分別與濃度為2×109 CFU/mL的菌懸液等體積混合，每梯度設3個平行。將混合液置于28 ℃恒溫搖床（80 r/min）滅活48 h；用同樣方法配制福爾馬林和細菌混合液置于4 ℃滅活。以上滅活過程中每12 h取0.2 mL菌液均勻涂布于普通固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并記錄是否有菌長出。將濃度為1×109 CFU/mL的菌懸液分別置于60 ℃與72 ℃恒溫水浴鍋熱滅活12 h，每隔2 h取樣檢測細菌滅活情況。

將最佳滅活條件滅活的菌液4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體，生理鹽水洗滌3次，并重懸菌體，使?jié)舛燃s為1×109 CFU/mL與4×109 CFU/mL，4 ℃儲存待用。

1.2.2 疫苗的安全性檢測 將待用疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，每組3個平行，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察有無菌長出。用待用疫苗腹腔注射10尾健康錦鯉，每尾0.2 mL，持續(xù)10 d觀察魚的攝食情況、發(fā)病癥狀及死亡情況并記錄。

1.3 錦鯉的免疫

試驗錦鯉來自天津市鯉魚良種培育場，魚體體長12.8～17.7 cm，體重100.5～123.3 g，試驗在該場水泥池中進行，正常飼喂配合飼料，24 h氣泵增氧，三日換水量為1/3。試驗分為免疫組與對照組，免疫組設四個處理水平，記為Ⅰ組（28 ℃條件下濃度為4×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅱ組（28 ℃條件下濃度為1×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅲ組（4 ℃條件下濃度為4×109 CFU/mL滅活疫苗組）、Ⅳ組（4 ℃條件下濃度為1×109 CFU/mL滅活疫苗組），每處理水平設3個平行，每平行各10尾錦鯉。每尾錦鯉腹腔注射0.2 mL疫苗。對照組注射0.8%無菌生理鹽水，每尾0.2 mL。第一次免疫30 d后，采用相同的方法與劑量加強免疫。

1.4 抗體效價測定

采用96孔血凝板法測定血清抗體效價。首次免疫后每隔5 d從免疫組各處理水平與對照組中隨機取5尾魚，尾部靜脈取血；加強免疫后每隔10 d采用相同方法采血。血樣室溫靜置2 h，然后放置于4 ℃冰箱5 h，4 ℃條件下5 000 r/min離心10 min，收集上層血清。以濃度為4×109 CFU/mL的蠟樣芽孢桿菌菌懸液為抗原檢測血清抗體效價。

1.5 免疫保護率測定

首次免疫60 d后，隨機從免疫組與對照組中各取10尾試驗魚，分別向腹腔注射0.2 mL的1×108 CFU/mL蠟樣芽孢桿菌活菌，連續(xù)觀察10 d，記錄各組死亡情況，解剖檢查并記錄死亡魚體表及各組織器官病變情況。按下列公式計算免疫保護率（RPS）：

免疫保護率=（對照組死亡率-試驗組死亡率）/對照組死亡率×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

從患病錦鯉體表病灶處及實質(zhì)器官中分離獲得一株疑似致病菌，命名為J1。普通固體培養(yǎng)基上菌落為圓形、中央隆起、邊緣波狀、白色。細菌革蘭氏染色呈陽性，長桿狀，有芽孢。

通過對分離菌株J1的16S rDNA進行PCR擴增得到大小約為1 500 bp的片段，測序后得到長度為1 300 bp 16S rRNA基因序列（圖1）。將獲得的J1測序序列在NCBI上進行同源性比較，使用Mega 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，J1菌株與蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）聚為一類（圖2）。

2.2 人工感染試驗

攻毒錦鯉10尾，9尾發(fā)病，主要癥狀為體表黏液減少、局部充血、潰爛，發(fā)病癥狀與自然死亡錦鯉相同，第九天死亡率達90%，對照組沒有出現(xiàn)臨床病癥及死亡，由此判斷蠟樣芽孢桿菌為錦鯉腐皮病的致病菌。

2.3 細菌滅活及疫苗制備

在4 ℃條件下，當福爾馬林終濃度為0.1%時，需48 h完全滅活，其他濃度組在36 h內(nèi)完全滅活；在28 ℃條件下，病原菌在各濃度梯度福爾馬林溶液里36 h內(nèi)即完全滅活，福爾馬林終濃度越高，滅活所需時間越短（表1）。而在60 ℃與72 ℃條件下，滅活24 h后均有細菌存活。綜合考慮福爾馬林濃度和滅活時間，選擇終濃度0.2%的福爾馬林4 ℃滅活36 h和28 ℃滅活24 h為蠟樣芽孢桿菌疫苗制備條件。

2.4 滅活疫苗安全性檢測

將試驗疫苗涂布于普通固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d后平板上無菌落生長，即判斷為病原菌完全滅活。將疫苗腹腔注射健康錦鯉（0.2 mL/尾），10 d后所有魚均存活，攝食良好，表明疫苗安全。

2.5 抗體效價與免疫保護率

以蠟樣芽孢桿菌為抗原檢測免疫錦鯉的血清抗體效價。結(jié)果（圖3）表明，錦鯉經(jīng)免疫后抗體效價水平有上升趨勢。在首次免疫5 d后可以檢測到抗體產(chǎn)生，20 d后達到高峰，Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組抗體效價分別為1∶128、1∶64、1∶64、1∶32，之后各免疫組抗體效價水平開始緩慢下降，免疫后第30天時，各免疫組抗體效價水平回落至1∶16；第30天加強免疫后免疫組血清抗體效價水平快速提升，于50 d后達到最高值，分別為1∶256、1∶256、1∶128、1∶64，60 d時抗體效價水平仍維持在較高水平，對照組均不超過1∶4。

首次免疫后第60天腹腔注射1×108 CFU/mL蠟樣芽孢桿菌懸液攻毒錦鯉，對照組在攻毒第三天部分魚體表出現(xiàn)黏液減少、部分組織充血、出血；第六天時出現(xiàn)死亡，第九天時死亡率達到90%。而免疫組在攻毒后第八天開始死亡，10 d后無繼續(xù)死亡。Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組免疫保護率分別為66%、66%、55%、44%（表2）。

3 小結(jié)與討論

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于各種環(huán)境中，是一種具有發(fā)展前景的益生菌，并在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應用[9，10]。本試驗發(fā)現(xiàn)蠟樣芽孢桿菌可引起錦鯉腐皮病，駱藝文等[11]也從患有腐皮病綜合征的刺參上分離到該菌，通過人工回感試驗證明其具有致病性。因此，蠟樣芽孢桿菌作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的安全性有待進一步論證。

一般認為，較溫和的滅活條件，如較低的溫度與較低的福爾馬林濃度或較短的福爾馬林作用時間，有利于抗原得到保護[12-14]。但在本試驗中，4 ℃條件下使用終濃度為0.2%的福爾馬林滅活36 h，抗體效價水平明顯低于28 ℃條件下滅活的疫苗，這與楊先樂等[13]的報道相近。血清抗體效價和相對免疫保護力是評價疫苗免疫效果的重要參數(shù)。本試驗結(jié)果表明，在適合條件下完全滅活的蠟樣芽孢桿菌疫苗免疫健康錦鯉后，血清抗體效價最高達1∶256，并能持續(xù)較長時間，同時受免魚用蠟樣芽胞桿菌攻毒后，免疫保護率最高達66%，表明錦鯉對蠟樣芽孢桿菌滅活疫苗能產(chǎn)生較強的免疫應答反應，并可有效抵擋蠟樣芽孢桿菌的感染。該疫苗制備操作簡單，滅活時間短，所需滅活劑濃度低，且在錦鯉上注射免疫易操作，筆者認為該滅活疫苗對錦鯉腐皮病防控具有較好的應用價值。

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