楊靜+吳慧+潘一展

摘要：為提高外源過(guò)氧化物酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)量，對(duì)甲醇畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L高鐵血紅素，每12 h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%，待酵母生長(zhǎng)量達(dá)到最大值時(shí)加入0.5 mL/L微量元素混合物。結(jié)果表明，優(yōu)化后培養(yǎng)基表達(dá)量是普通培養(yǎng)基的10.6倍，研究為后期外源蛋白進(jìn)入發(fā)酵罐生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：過(guò)氧化物酶基因；畢赤酵母；優(yōu)化培養(yǎng)基；血紅素；微量元素

中圖分類(lèi)號(hào)：Q814文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0051-02

近年來(lái)，酶工程在生物技術(shù)領(lǐng)域得到很大發(fā)展，過(guò)氧化物酶被應(yīng)用于疾病診斷及治療、農(nóng)作物品種選育及病蟲(chóng)害防治、染料中脫色劑生產(chǎn)[1]、有機(jī)物和聚合物合成[2]、農(nóng)業(yè)廢棄物處理[3]等領(lǐng)域。但是，天然酶在開(kāi)發(fā)和應(yīng)用中受到一定限制。本研究采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)酶，研究外源蘿卜過(guò)氧化物酶在甲醇畢赤酵母中的表達(dá)，旨在探討高表達(dá)量的優(yōu)化培養(yǎng)條件。

1材料與方法

1.1材料

菌株：野生型畢赤酵母GS115（GS115）及商丘學(xué)院風(fēng)景園林學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的轉(zhuǎn)蘿卜過(guò)氧化物酶基因（RsPrxl）型畢赤酵母GS115（GSRP25）均由該實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基 YPD、BMGY/BMMY組成和配制參見(jiàn) Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊(cè)。

1.2方法

1.2.1菌種活化挑取菌株 GSRP25在 YPD上進(jìn)行平板劃線(xiàn)培養(yǎng)，分離后，挑取單菌落進(jìn)行優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.2轉(zhuǎn)基因酵母的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)挑取2個(gè)GSRP25單菌落分別接種于200 mL BMGY培養(yǎng)基中，pH值7.4、26 ℃、0.5%甲醇、225 r/min條件下培養(yǎng)[4]。待D600 nm達(dá)到2～3時(shí)，靜置，收集菌體分別重懸于20 mL BMMY中和含有0.5 g/L血紅素[5]的20 mL BMMY中培養(yǎng)，每12 h補(bǔ)加甲醇至終濃度為 0.5%，80～90 h間酵母生長(zhǎng)量達(dá)到最大值，此刻向培養(yǎng)基中加入0.5 mL/L微量元素混合物（0.5 g/L MgCl2，30 g/L FeCl2·6H2O，1 g/L ZnCl2·4H2O，0.2 g/L CoCl2·6H2O，1 g/L Na2 MoO4·2H2O，0.5 g/L CaCl2·2H2O，1 g/L CuCl2和0.2 g/L H2BO3）[6]繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定每12 h取1 mL菌液，4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，取上清，測(cè)D600 nm；采用愈創(chuàng)木酚法[7]測(cè)過(guò)氧化物酶（POD）活性；采用Bradford的微量法[8]測(cè)定可溶性蛋白含量，以小牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4表達(dá)產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測(cè)POD同工酶活性電泳采用垂直板聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳方法，凝膠采用Lopes等的方法[9]制備，電泳后POD用聯(lián)苯胺染色[10]。用天能GIS-1000凝膠成像和分析系統(tǒng)拍照分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)狀態(tài)

D600 nm代表菌株生長(zhǎng)速度，由圖1可知，在2種培養(yǎng)條件下，D600 nm隨時(shí)間的延長(zhǎng)都有所增加，說(shuō)明酵母生長(zhǎng)比較穩(wěn)定；但從60 h開(kāi)始，普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母生長(zhǎng)速度緩慢，而優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母生長(zhǎng)速度開(kāi)始加快；96 h取樣檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，D600 nm達(dá)到72.3，比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母增加了近37%。

2.2POD活性的變化

由圖2可見(jiàn)，優(yōu)化培養(yǎng)基中POD的活性顯著高于普通培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)基因酵母GSRP25在普通誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，外源POD的表達(dá)量增加不明顯，在培養(yǎng)72 h后趨于穩(wěn)定。在優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基培養(yǎng)下，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，外源POD活性顯著增加，在培養(yǎng)72 h后也慢慢趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)96 h酶活性達(dá)到最大值，為 30.9 U/mL，是普通BMMY培養(yǎng)基酶活性的5.9倍；且在培養(yǎng)12 h時(shí)，酶活性為4.7 U/mL，幾乎達(dá)到普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的最大酶活量，說(shuō)明優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基對(duì)酶活性的表達(dá)有顯著提高作用。

2.3可溶性蛋白含量變化

巴斯德畢赤酵母作為外源基因表達(dá)的酵母宿主，自身分泌的蛋白非常少，外源POD的表達(dá)量可以用培養(yǎng)基上清中蛋白含量來(lái)衡量。由圖3可知，在普通BMMY培養(yǎng)基條件下，外源蛋白的表達(dá)量很低，培養(yǎng)96 h后蛋白含量只有 0.018 g/mL；而優(yōu)化BMMY培養(yǎng)基培養(yǎng)的外源蛋白表達(dá)量很高，培養(yǎng)36 h后蛋白含量迅速增加，培養(yǎng)72 h后蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定，培養(yǎng)96 h時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值，為 0.18 g/mL，約是普通 BMMY 培養(yǎng)基表達(dá)量的10倍。說(shuō)明優(yōu)化BMMY培養(yǎng)基顯著提高了外源POD蛋白的表達(dá)量。

2.4SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白

已知目的蛋白的分子量約37 ku，由圖4可見(jiàn)，優(yōu)化后培養(yǎng)基培養(yǎng)目的蛋白的條帶比普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的目的蛋白條帶粗、顏色深，說(shuō)明優(yōu)化后的培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白量明顯增多。

3結(jié)論與討論

縱觀近年來(lái)的文獻(xiàn)報(bào)道，提高外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)量主要有2種途徑，一是優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間、溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、通氧量、添加微量元素等，如RsPHGPx在1%甲醇、pH值6、28 ℃條件下誘導(dǎo)60 h后得到最大表達(dá)量，產(chǎn)率約為102 mg/L[11]。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，在0.5%甲醇、pH值7.4、26 ℃、通氣面積1.5 cm2、225 r/min 條件下，有利于蘿卜過(guò)氧化物酶RsPrx1表達(dá)。二是結(jié)合外源目的蛋白自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，利用適合外源蛋白合成的某些誘導(dǎo)劑可以提高重組蛋白的表達(dá)量[12]。POD蛋白分子的活性中心含F(xiàn)e（Ⅲ）-原卟啉Ⅸ（血紅素）輔基，只有在輔基存在的條件下，酶才被稱(chēng)為全酶，具有活性。所以血紅素是組成POD分子的必需基團(tuán)，在一定程度上增加血紅素含量，有助于輔基卟啉含量的增加，從而促進(jìn)POD合成。Gu等報(bào)道，利用甲醇畢赤酵母GS115表達(dá)外源錳過(guò)氧化物酶時(shí)，在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L血紅素，錳過(guò)氧化物酶的表達(dá)量增加[5]。有報(bào)道表明，在添加0.5 g/L高鐵血紅素的培養(yǎng)基中，錳過(guò)氧化物酶在曲霉菌中的表達(dá)量增加[13]。Conesa等研究證實(shí)，用曲霉菌表達(dá)錳過(guò)氧化物酶，在培養(yǎng)基中加入0.5 g/L血紅素，過(guò)氧化物酶的產(chǎn)量達(dá)到100 mg/L[14]。以上研究為本研究中添加0.5 g/L高鐵血紅素提供一定的理論依據(jù)。另外，無(wú)機(jī)鹽或礦物質(zhì)元素在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中提供了各種重要元素，在配制酵母誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基時(shí)添加必要的微量元素，有助于酵母生長(zhǎng)。其中Fe是目的蛋白POD的分子成分，Na+維持滲透壓，Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+可以作為酶的激活劑[15]。表達(dá)系統(tǒng)中含有適量的Mg2+、K+、NH+4、Ca2+有利于降低蛋白質(zhì)合成中的錯(cuò)讀[16]。因此在本研究中，在優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了各種微量元素。結(jié)合以上理論依據(jù)，本研究從培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分入手進(jìn)行改良，結(jié)果表明，在BMMY培養(yǎng)基中添加0.5%甲醇、0.5 g/L高鐵血紅素、0.5 mL/L微量元素，獲得的酶活性達(dá)30.9 U/mL，是普通培養(yǎng)基的5.9倍，說(shuō)明優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基有效提高了外源蛋白的表達(dá)量。

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