李旭+吳松權(quán)+姜明亮+樸一龍

摘要：以軟棗獼猴桃成齡雌株、雄株葉片為試驗材料，利用SRAP分子標(biāo)記手段及SPSS軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，從初篩的80對引物中篩選出15對可穩(wěn)定擴增出多態(tài)性條帶的引物組合，19個雌、雄植株共得到77個條帶，多態(tài)性條帶為72個，多態(tài)率達(dá)到93.50%；雌株多態(tài)性比率為68.8%，雄株多態(tài)性比率為87.0%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對引物的擴增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率具有明顯差異；供試的19個植株經(jīng)聚類分析分成2組，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別?；谛詣e相關(guān)的SRAP可以有效分辨出軟棗獼猴桃雌株、雄株。

關(guān)鍵詞：軟棗獼猴桃；雌雄異株；性別鑒定；SRAP；分子標(biāo)記

中圖分類號： Q943文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0069-03

軟棗獼猴桃[Actinidia arguta （Seib.et Zucc.）Plangch.ex Miq.]是獼猴桃科獼猴桃屬中水平和垂直分布最廣泛的多年生落葉藤本果樹之一[1]，我國南北各地、朝鮮、日本、俄羅斯均有分布，以我國東三省資源最為豐富，其中，小興安嶺和長白山山區(qū)較為多見，是珍貴的抗寒果樹資源。軟棗獼猴桃果實富含維生素C、酚類物質(zhì)、類胡蘿卜素及多種礦質(zhì)元素，具有一定的藥用價值。目前，軟棗獼猴桃作為第3代獼猴桃，受到世界各國的廣泛關(guān)注，其產(chǎn)業(yè)開發(fā)正蓬勃發(fā)展。但是，軟棗獼猴桃為雌雄異株植物，以雌株產(chǎn)果實，雌株的經(jīng)濟價值明顯高于雄株，而軟棗獼獼猴桃實生苗需要5～7年才能結(jié)果，童期漫長，且實生繁殖后代出現(xiàn)雌雄比約為1 ∶[KG-*3]4的性別分離[2]，不利于生產(chǎn)需要。雌雄異株和幼苗期雌雄無法辨別給軟棗獼猴桃種質(zhì)資源的改良和育種帶來巨大困難，因此，軟棗獼猴桃的性別鑒定在生產(chǎn)和遺傳育種方面有著重要的意義。

分子標(biāo)記技術(shù)具有簡單快捷等優(yōu)點，逐漸成為植物輔助育種的重要手段。DNA 分子標(biāo)記技術(shù)被應(yīng)用于植物的性別鑒定，提高了植物性別鑒定的準(zhǔn)確性和實用性。Michelmore等提出的群體分離分析法（BSA）是一種有效的定位基因方法[3]，并據(jù)此得到了一些雌雄異株的植物性別連鎖DNA標(biāo)記；Mulcahy等在Silene latifolia中用60條隨機引物篩選到4條與性別連鎖的RAPD標(biāo)記[4]；Hormaza等通過700條引物的篩選，在Pistacia vera中找到1條單獨性別連鎖的RAPD標(biāo)記[5]。相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）是Li等發(fā)展的新型分子標(biāo)記[6]，該標(biāo)記通過獨特的引物設(shè)計對可讀框（open reading frames，ORFs）進(jìn)行特異性擴增，具有簡便、穩(wěn)定、產(chǎn)率高、標(biāo)記分布均勻、多態(tài)性強、目的片段便于克隆等特點，已被廣泛應(yīng)用于圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)、基因克隆和親緣關(guān)系等研究[7-10]，而在性別決定方面僅應(yīng)用于少數(shù)幾種植物中[11-14]。利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對軟棗獼猴桃性別的相關(guān)特異片段研究未見報道。

本研究利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對軟棗獼猴桃的雌、雄基因組DNA差異進(jìn)行研究，以期為軟棗獼猴桃幼苗期性別鑒定、軟棗獼猴桃性別相關(guān)基因的克隆提供科學(xué)依據(jù)。同時，SRAP體系的建立為利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)對軟棗獼猴桃進(jìn)行相關(guān)研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料于2014年8月取自延邊大學(xué)野生漿果資源圃（楓林），選取生長勢一致、無病蟲害的6年生野生軟棗獼猴桃雌株、雄株，分別取其成熟葉片，用冰盒保存，迅速帶回實驗室，液氮速凍。雄株取10個樣品，記為X1～X10；雌株取9個樣品，記為C1～C9。所用SRAP引物（表1），均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

采用改良的CTAB法提取軟棗獼猴桃各株基因組DNA，用紫外分光光度計分別測定DNA 在波長為260、280 nm處的D值，檢測其純度及濃度；用1.4%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的大小和完整性；稀釋成濃度為50 ng/μL的工作液，分裝，超低溫冰箱保存，備用。

1.2軟棗獼猴桃的SRAP擴增

SRAP擴增條件在參照鄧傳良等反應(yīng)體系[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，確定軟棗獼猴桃的SRAP-PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：400 ng基因組DNA，2 μmol/L的正向、反向引物1.0 μL，10×buffer 2.0 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 0.4 μL，1.25 U/μL Taq酶0.3 μL。PCR擴增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，37 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸90 s，15個循環(huán)；94 ℃變性1 min，52 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。將上下游引物進(jìn)行自由組合，從80對引物組合的擴增圖譜中篩選出帶型清晰、雌雄基因組具有明顯差異、重復(fù)性好且多態(tài)性高的引物組合。08%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結(jié)果，用500萬像素數(shù)碼相機拍照。

1.3數(shù)據(jù)處理及分析

將清晰可辨的DNA條帶進(jìn)行統(tǒng)計，弱帶中穩(wěn)定的條帶予以保留，不穩(wěn)定的條帶忽略不計，計算雌、雄性別特異的條帶數(shù)，樣品間同一遷移位置上的電泳條帶記為1，無則記為0。利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行歐氏距離平方法聚類分析，按照Ward method離差平方建立聚類分析樹狀圖。

2結(jié)果與分析

2.1軟棗獼猴桃基因組的SRAP擴增

以構(gòu)建的軟棗獼猴桃雌、雄基因池DNA為模板，從初篩的80對引物中篩選出15對可以穩(wěn)定擴增出多態(tài)性條帶的引物組合。由圖1、表2可見，多態(tài)性位點的分子量主要分布在300～1 000 bp之間，19個雌、雄植株共得到77個條帶，多態(tài)性條帶為72個，多態(tài)率達(dá)到93.50%；每對引物平均擴增出5.13個條帶，多態(tài)性條帶數(shù)為4.80個；雌株多態(tài)性比率為68.8%，雄株多態(tài)性比率為87.0%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對引物的擴增結(jié)果表現(xiàn)出雌雄株間的多態(tài)性比率差異明顯；沒有出現(xiàn)與性別相關(guān)的特異條帶，但軟棗獼猴桃雌、雄株基因組具有較為明顯的差異性。

2.2軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類分析

由圖2可見，供試的19個植株共分成2大組，組Ⅰ包括8個植株，其中含有2個雄株，編號為3、8，雌株占比為7143%，組Ⅱ包括11個植株，其中含有3個雌株，編號為 17～19，雄株占比為72.73%，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。獼猴桃為功能性雌雄異株植物，自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)能結(jié)果的雄株以來，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃在性別表達(dá)上幾乎呈現(xiàn)連續(xù)變異，至少有6種不同的性別表現(xiàn)型[1]，軟棗獼猴桃性別變異可能是造成約30%分辨不清的原因?；谛詣e相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃的雌株、雄株。

3結(jié)論與討論

SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)是對開放閱讀框進(jìn)行的特異擴增，利用該技術(shù)對基因組擴增所獲取的特異片段直接代表了基因的表達(dá)狀況，有利于對基因的表達(dá)及功能研究[15-18]。吳文珊等將SRAP分子標(biāo)記應(yīng)用于薜荔（Ficus pumila Linn.）早期性別鑒定，得到1條雌性多態(tài)性片段[19]。鄭翠芳等利用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)建立了愛玉子（Ficus awkeotsang Makino.）性別相關(guān)的DNA指紋數(shù)據(jù)庫，并獲得愛玉子的2個雄性特異片段[11]。Zhou等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得野牛草（Buchloe dactyloides）的1個雌性特異片段[13]。鄧傳良等利用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)獲得菠菜（Spinacia oleracea L.）和萚草[Humulus scandens （Lour.） Merr.]性別相關(guān)的特異條帶[12，14]。

本研究從80對SRAP 引物中篩選出15對多態(tài)性較強的引物，利用瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，從19個供試材料中共得到77個條帶，多態(tài)性條帶為72個，多態(tài)率達(dá)到93.50%；每對引物平均擴增出的條帶數(shù)為5.13個，多態(tài)性條帶數(shù)為480個；雌株多態(tài)性比率為68.80%，雄株多態(tài)性比率為8700%；me2-em1、me6-em6、me7-em5、me7-em7這4對引物的擴增結(jié)果表現(xiàn)出雌株、雄株間的多態(tài)性比率差異明顯。軟棗獼猴桃性染色體的發(fā)育機制與菠菜類似[20]，但并沒有出現(xiàn)如菠菜那樣的特異條帶[14]，這說明軟棗獼猴桃雌株、雄株的基因組具有較為明顯的差異性。軟棗獼猴桃雌株、雄株聚類分析將供試的19個植株分成2大組，組Ⅰ雌株占比為7143%，組Ⅱ雄株占比為72.73%，2組中均有70%以上表現(xiàn)出相同的性別。目前，在葡萄上已經(jīng)證實，性別決定基因可能與易受環(huán)境影響的一些基因發(fā)生互作[21]。因此，本研究軟棗獼猴桃存在30%性別分辨不清的原因很可能是由軟棗獼猴桃性別變異造成的，基于性別相關(guān)的SRAP可以有效分辨軟棗獼猴桃雌株、雄株，雖不能達(dá)到100%的分辨，但這完全可以符合現(xiàn)階段軟棗獼猴桃性別鑒定工作的需要。

參考文獻(xiàn)：

[1]黃宏文. 獼猴桃屬分類、資源、馴化、栽培[M]. 北京：科學(xué)出版社，2013.

[2]Khukhunaishvili R G，Dzhokhadze D I. Electrophoretic study of the proteins from Actinidia leaves and sex identification[J]. Applied Biochemistry and Microbiology，2006，42（1）：117-120.

[3]Michelmore R W，Paran I，Kesseli R V. Identification of markers linked to disease-resistance genes by bulked segregant analysis：a rapid method to detect markers in specific genomic regions by using segregating populations[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1991，88（21）：9828-9832.

[4]Mulcahy D L，Weeden N F，Kesseli R，et al. DNA probes for the Y-chromosome of Silene latifolia，a dioecious angiosperm[J]. Sexual Plant Reproduction，1992，5（1）：86-88.

[5]Hormaza J I，Dollo L，Polito V S. Identification of a RAPD marker linked to sex determination in Pistacia vera using bulked segregant analysis[J]. Theoretical and Applied Genetics，1994，89（1）：9-13.

[6]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism （SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theoretical and Applied Genetics，2001，103（2/3）：455-461.

[7]陳暉，陳美霞，陶愛芬，等. 長果種黃麻SRAP標(biāo)記遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建及3個質(zhì)量性狀基因定位[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（12）：2422-2430.

[8]Li G，Gao M，Yang B，et al. Gene for gene alignment between the Brassica and Arabidopsis genomes by direct transcriptome mapping[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，107（1）：168-180.

[9]劉雅輝. 23個小麥抗葉銹病近等基因系的SRAP多態(tài)性分析及Lr19的SRAP標(biāo)記[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.[ZK）]

[10]李梅，侯喜林，郝日明. 基于SRAP分子標(biāo)記的桂花品種親緣關(guān)系研究[J]. 園藝學(xué)報，2009，36（11）：1667-1675.

[11]鄭翠芳，朱曉東，方麗娜，等. 愛玉子性別與品系的SRAP分析[J]. 熱帶作物學(xué)報，2009，30（12）：1740-1745.

[12]鄧傳良，任映雪，張衛(wèi)麗，等. 葎草性別相關(guān)SRAP分子標(biāo)記的鑒定[J]. 植物研究，2014，34（6）：798-802.

[13]Zhou Y J，Wang X G，Zhang X Q. Development and application of a SRAP marker for the identification of sex in Buchloe dactyloides[J]. Euphytica，2011，181（2）：261-266.

[14]鄧傳良，曹瑩，任映雪，等. 菠菜性別相關(guān)SRAP分子標(biāo)記的篩選及分析[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2013，32（4）：516-521.

[15]李媛媛，沈金雄，王同華，等. 利用SRAP、SSR和AFLP標(biāo)記構(gòu)建甘藍(lán)型油菜遺傳連鎖圖譜[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（6）：1118-1126.

[16]劉雅輝，王秀萍，魯雪林，等. 棉花耐鹽相關(guān)序列擴增多態(tài)性（SRAP）分子標(biāo)記篩選[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2015，31（3）：484-488.

[17]劉雅輝，王秀萍，魯雪林，等. 26份棉花耐鹽相關(guān)種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，30（1）：219-221.

[18]荊贊革，裴徐梨，唐征，等. 青花菜早中熟種質(zhì)資源遺傳多樣性SRAP標(biāo)記分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：41-43.

[19]吳文珊，朱曉東，陳友鈴. 與薜荔性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2008，14（5）：688-691.

[20]Janick J. Inheritance of sex in tetraploid spinach[J]. Am Soc Hort Sci，1955，66：361-363.

[21]Moore J N. Cytokinin-induced sex conversion in male clones of Vitis species[J]. Am Soc Sci，1970，95：387-393.