梁春梅，喻東威，吳玉秋，劉曉川，薛志清，解鑫，趙媛，許璐，扎木則仁

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司中心實驗室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

測試片法快速檢測乳品中的菌落總數(shù)

梁春梅1，喻東威1，吳玉秋1，劉曉川2，薛志清1，解鑫1，趙媛1，許璐1，扎木則仁1

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司中心實驗室，呼和浩特011500；2.北京安普生化科技有限公司北京100027）

通過用快速菌落總數(shù)測試片法與國標方法進行對比,從而對快速菌落總數(shù)測試片的準確性、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性等各項性能進行評估，并驗證了快速菌落總數(shù)測試片與國標方法（GB 4789.2-2010）檢測結(jié)果的一致性。結(jié)果表明，快速菌落總數(shù)測試片計數(shù)更簡單、操作簡便，縮短了檢測時間，24 h即可對樣品進行菌落計數(shù)。

快速菌落總數(shù)測試片;國標法;乳制品

0 引言

菌落總數(shù)測試片是美國3M公司生產(chǎn)的一預先制備好的培養(yǎng)基系統(tǒng),在食品企業(yè)中該系列產(chǎn)品作為微生物日常檢測的方法，已經(jīng)廣泛用于食品、飲料及相關(guān)行業(yè)的微生物檢測；

快速菌落總數(shù)測試片是培養(yǎng)基中含有作為載體的冷水可溶性凝膠及雙聯(lián)指示劑，使測試片中的菌落顯不同顏色。比傳統(tǒng)的方法能縮短時間（24 h即可對樣品進行菌落計數(shù)），且觀察結(jié)果更簡便，有助于提高微生物實驗質(zhì)量和提高工作效率。

本文將快速菌落總數(shù)測試片法和國標方法進行對比，考察在檢測乳制品樣品時兩種方法是否存在顯著性差異，為乳品企業(yè)更好的應用該產(chǎn)品提供有效數(shù)據(jù)。

1 實驗

1.1 材料與設(shè)備

生乳80份、奶粉90份、冰激凌10份、純牛奶（加標）份、奶酪20份、酸性產(chǎn)品（加標）20份，其中加標是指添加一定濃度的標準菌株的產(chǎn)品。

標準菌株大腸埃希氏菌（cicc0389）,金黃色葡萄球菌（cicc21600）。

3MPetrifil mTM快速菌落總數(shù)測試片，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基。

生物安全柜,恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 方法

所有樣品均以快速菌落總數(shù)測試片法和國標法同時進行試驗，其中快速菌落總數(shù)測試片法培養(yǎng)時間為24 h（奶粉除外，要求培養(yǎng)48 h），國標法為48 h。

接種標準菌株新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯中36℃培養(yǎng)18～24 h，上述培養(yǎng)物用質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水制成每1 mL含菌數(shù)為1～1 000 mL-1的菌懸液，備用。

1.3 測定方法

(1)樣品試驗,本試驗對235個樣品進行對比。按照國標GB4789.2-2010方法對樣品進行稀釋，選擇2～3個適宜稀釋度采用測試片法和國標法分別進行試驗。測試片法需36℃培養(yǎng)24 h（奶粉樣品需培養(yǎng)48 h），國標方法需36℃培養(yǎng)48 h，記錄菌落數(shù)量。

(2)重復性實驗，隨機抽取1個批次的生乳樣品采用國標法和測試片法同時檢測，分別由不同人員，在不同時間進行檢驗，分別做20組平行實驗。

(3)定量限試驗,在檢驗范圍的低限制備5份不同含菌濃度的樣品，每份不同含菌濃度的樣品分別用測試片法和國標法進行不少于5次檢驗，采用統(tǒng)計方法比較替代方法的檢驗結(jié)果與國標法結(jié)果的差異。

(4)線性試驗,選擇5個濃度的樣品，每個濃度至少測定5次。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，以檢驗結(jié)果為因變量，以樣品中微生物的預期數(shù)量為自變量進行線性回歸分析，計算相關(guān)系數(shù)r。替代方法的相關(guān)系數(shù)不得低于0.95。

1.4 統(tǒng)計分析

將菌落計數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成常用對數(shù)值后，對每類樣品進行統(tǒng)計學分析。對對數(shù)平均偏差進行配對t檢驗以確定不同方法之間微生物菌落總數(shù)是否有顯著性差異。重復性試驗用相對標準偏差進行分析，也可用F檢驗計算得出不同方法的重復性差異。對線性試驗結(jié)果進行線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品實驗

本研究采用試片法和國標方法對6種乳制品產(chǎn)品，共235個樣品進行菌落總數(shù)測定比對，結(jié)果分別采用spss軟件對樣品菌落總數(shù)結(jié)果進行配對T檢驗分析如下：

分析結(jié)果可知兩種方法檢測生乳、奶粉、冰激凌、純牛奶、奶酪等樣品相關(guān)性分別為：0.963、0.955、0.98、0.984、0.994、0.989；兩種方法檢測結(jié)果具有良好的相關(guān)性，且方法之間無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 精密度實驗

取1個純牛奶樣品分裝試管，用其稀釋活化好的標準菌株（大腸埃希氏菌）稀釋至適宜范圍，分別用國標方法和測試片法進行計數(shù)，此適宜稀釋度做20個重復實驗。

圖1 兩種方法精密度實驗對比結(jié)果

AD判定標準：99%置信水平下AD<1.035，或95%置信水平下AD<0.752,則說明系統(tǒng)服從正態(tài)性分布。

圖2 精密度實驗正態(tài)性檢驗

測試片法精密度試驗結(jié)果顯示，相對標準偏差（RSD%）為7.06%，國標方法檢測結(jié)果計算相對標準偏差（RSD）為7.82%,兩種方法相對標準偏差均符合要求（RSD%<15%）。從圖1可知測試片法重復檢測結(jié)果與國標方法保持很好的一致性。

對檢測數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗分析（如圖2）得到AD=0.604，小于臨界值0.725（95%置信區(qū)間），系統(tǒng)服從正態(tài)分布，數(shù)據(jù)處于受控狀態(tài)。再對其兩組數(shù)據(jù)進行F檢驗和T檢驗分析如下：

F檢驗分析得出F計=0.751，F(xiàn)表（0.05，19，19）= 2.168，F(xiàn)計

t檢驗分析得出t計=1.500，查表得出t表（0.05，38）= 2.024因t計

2.3 定量限實驗

原奶樣品和奶粉樣品按照10倍梯度進行稀釋，選取0 mL-1的樣品,1 mL-1的樣品,10 mL-1的樣品,20 mL-1的樣品,50 mL-1的樣品,采用測試片法和國標方法分別進行計數(shù)。且對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果如表1所示。

表1 成對樣本統(tǒng)計量

采用spss軟件對數(shù)據(jù)進行配對T檢驗分析如下：

由表1可知，采用不同方法對不同菌濃度的純牛奶樣品進行檢測，共得到90組數(shù)據(jù)，其中測試片法測得平均菌落總數(shù)對數(shù)值為0.8424，標準差為0.73612，標準誤差為0.14722；國標方法測得平均菌落總數(shù)對數(shù)值為 0.8700，標準差為 0.70881，標準誤差為0.14176。

表2 成對樣本相關(guān)系數(shù)

由表2和表3可知，采用不同方法對樣品進行檢測，其相關(guān)性為0.990，P>0.05,即不同菌濃度的純牛奶樣品用測試片法和國家標準法測得菌落總數(shù)結(jié)果無顯著性差異，說明測試片法的定量限檢測結(jié)果符合要求。

表3 成對樣本檢驗

試驗同時對1 mL-1左右的20組樣品進行檢測，測試片法和國標方法檢出率均達到80%，測試片法檢測限為1 mL-1，靈敏度相當于國標方法。

2.4 線性實驗

原奶樣品和奶粉樣品按照10倍梯度進行稀釋，分

別選取1～10，10～30，30～100，100～200，200～300 mL-1的樣品采用測試片法和國標方法進行計數(shù)。

用國標法和測試片法進行預測，結(jié)果R=0.988，R2=0.976，調(diào)整R2=0.975，標準估計誤差為0.12169。

表4 方差分析結(jié)果

表5 回歸系數(shù)

對數(shù)據(jù)進行回歸線性分析，結(jié)果如下。

表4“方差”分析中，“回歸”P值為0.000，如果“回歸”P值小于0.05是顯著的，因此建立的模型是可行的。表5“系數(shù)”中計算出的系數(shù)的概率值都是小于顯著性水平（P）0.05，說明兩種方法回歸系數(shù)達到了顯著水平，因此得出測試片法和國標方法具備相關(guān)性。由圖3可知相關(guān)系數(shù)R2=0.975，測試片法相關(guān)系數(shù)不低于0.95，因此測試片法測定菌落總數(shù)符合線性關(guān)系。

3 結(jié)論

圖3 3M測試片法和國標法檢驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明快速菌落總數(shù)測試片法和國標方法檢測純牛奶、奶粉、酸性產(chǎn)品(包括酸酸乳、真果粒)、冰激凌等產(chǎn)品中的菌落總數(shù)，結(jié)果無統(tǒng)計學差異（P>0.05）,準確度、精密度、定量限、線性試驗均符合要求；快速測試片法檢測奶粉樣品，48 h會有水化現(xiàn)象，與48 h菌落測試片相比水化程度有所改善，建議奶粉樣品24 h預讀數(shù)，再培養(yǎng)到48 h讀數(shù)?？焖倬淇倲?shù)測試片可用于酸性產(chǎn)品菌落總數(shù)測定，pH值大于4的酸性樣品不需要調(diào)節(jié)。

快速菌落總數(shù)測試片采用雙聯(lián)指示劑，使測試片中的菌落顯不同顏色計數(shù)更簡單，操作簡便，并且相對傳統(tǒng)的測試片方法檢測時間為48h縮短至24 h，在更短的時間內(nèi)獲得樣品的測試結(jié)果，能更加迅速地采取有效的措施解決發(fā)現(xiàn)的問題，因此用于乳與乳制品中菌落總數(shù)的檢測可提高檢測效率。

[1]GB 4789.2-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[S].

[2]國家藥典委員會，中國藥典（2010版）:藥品微生物檢驗替代方法驗證指導原則.中國醫(yī)藥技術(shù)出版社,2010（3）:340-345.

Petrifil mtest piece method o f rapid total colony nu mber count to detect the aer?abic p late count in dairy p roducts

LIANG Chunmei1，YU Dongwei1，WU Yuqiu1，LIU Xiaochuan2，XUE Zhiqing1，XIEXin1，ZHAO Yuan1，XU Lu1，Zhamuzeren1
（1.Inner Mongolia Meng N iu Dairy Products Co.,Ltd，Hohhot 010018，China；2.Beijing Anapure BioScientific Co., Ltd,Beijing 100027，China）

The test compared the Petrifilmtest piecemethod of rapid aerabic plate count and national standard method,evaluatedaccuracy, specificity,sensitivity,stability,and other performance attributesof the Petrifil mtest piecemethodof rapid aerabic plate count,and validated the consistency of test resultsof Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic p late count and the national standard method(GB 4789.2-2010). In the test results,the Petrifil mtest piecemethod of rapid aerabic plate count has si mpler colony-counting,more convenient operation,and shorter detection time;it only take 24 hours to start colony-counting.

Petrifil mtest piece;national standard method;dairy products

TS252.7

A

1001-2230（2017）01-0047-03

2016-09-28

國家重大科學儀器設(shè)備開發(fā)專項（2013YQ 14037108）。

梁春梅（1983-），女，工程師，從事食品檢測及分析工作。