陳新田陳泓宇王建功施明

華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院 河北唐山 063000;①軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學院研究所;②徐州醫(yī)科大學腫瘤研究所

腫瘤預轉(zhuǎn)移小生境的形成特點及意義

陳新田 陳泓宇①王建功施 明②

華北理工大學附屬唐山市人民醫(yī)院 河北唐山 063000;①軍事醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學院研究所;②徐州醫(yī)科大學腫瘤研究所

腫瘤；腫瘤轉(zhuǎn)移；預轉(zhuǎn)移小生境

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者致死的主要原因，約90%的實體瘤患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。腫瘤早期轉(zhuǎn)移灶在臨床上難以探查，多數(shù)患者確診時已處于腫瘤晚期，目前尚無有效的手段預防及控制腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，探索腫瘤轉(zhuǎn)移的相關分子機制一直是腫瘤研究領域的熱點。

1989年，Paget[1]在對晚期乳腺癌轉(zhuǎn)移的觀察中，提出了“種子與土壤”假說：作為“種子”的腫瘤細胞可隨循環(huán)系統(tǒng)到達全身，但“種子”只能在特定的“土壤”-靶器官中定植生長。2005年，Kaplan等[2]發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1,SDF-1)/CXCR4信號軸激活可介導VEGFR-1+骨髓來源造血前體細胞招募至預轉(zhuǎn)移組織，首次提出“預轉(zhuǎn)移小生境”(pre-metastatic niche)的概念，進一步完善了“種子與土壤”學說。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，預轉(zhuǎn)移小生境中各種細胞相互作用，共同決定了播散的腫瘤細胞實現(xiàn)轉(zhuǎn)移的命運。認識預轉(zhuǎn)移小生境形成的機制，揭示腫瘤轉(zhuǎn)移前或轉(zhuǎn)移灶形成早期的分子事件，對于防止腫瘤轉(zhuǎn)移或在形成難治愈的轉(zhuǎn)移灶前清除微小轉(zhuǎn)移灶具有重要的意義。本文將介紹腫瘤預轉(zhuǎn)移小生境的形成特點及其在腫瘤轉(zhuǎn)移和臨床治療中的意義。

1 預轉(zhuǎn)移小生境的細胞組成

播散的腫瘤細胞在預轉(zhuǎn)移器官中的成功定植依賴于預轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境，預轉(zhuǎn)移小生境的形成是腫瘤細胞與非腫瘤細胞(基質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì))相互作用導致機體系統(tǒng)性改變的結(jié)果。在腫瘤細胞分泌的多種物質(zhì)(包括細胞因子、酶)以及由此觸發(fā)的復雜信號網(wǎng)絡的調(diào)控下，基質(zhì)細胞(包括免疫細胞、巨噬細胞、成纖維細胞)歷經(jīng)修飾、馴化及適應過程，導致基質(zhì)細胞表型、生物學特性及組織結(jié)構暫時或永久性的改變。多種基質(zhì)細胞參與調(diào)控預轉(zhuǎn)移小生境的形成，包括免疫細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、腫瘤相關成纖維細胞(CAF)、周皮細胞(pericyte)等。

1.1免疫細胞 免疫細胞是機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，參與防御病原微生物的免疫應答，并可識別腫瘤抗原。然而，免疫細胞包括中性粒細胞、骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cell, MDSC)、樹突狀細胞(DC)、自然殺傷細胞(NK)以及T、B淋巴細胞等可通過分泌多種細胞因子，參與調(diào)控預轉(zhuǎn)移小生境的形成[3]。目前，關于預轉(zhuǎn)移小生境形成中免疫細胞的招募及其作用的知識甚少。中性粒細胞為循環(huán)中數(shù)量最大的白細胞，在炎癥發(fā)生時最先到達炎癥局部，通過釋放溶菌酶、活性氧(ROS)、過氧化氫(H2O2)等物質(zhì)發(fā)揮作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，中性粒細胞是招募至轉(zhuǎn)移組織中的主要免疫細胞。對荷瘤小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞播散至肺組織之前，即可見肺組織中有CD11b+Ly6G+中性粒細胞浸潤。浸潤的中性粒細胞多處于成熟狀態(tài)，但與對照組小鼠肺內(nèi)的中性粒細胞相比，荷瘤小鼠肺中的中性粒細胞的基因表達譜存在明顯的差異。隨轉(zhuǎn)移灶的形成，中性粒細胞的數(shù)量可進一步增多。小鼠乳腺癌細胞可誘導γδT細胞產(chǎn)生白細胞介素(IL)-17，驅(qū)動循環(huán)中性粒細胞擴增及極化，而中性粒細胞則可抑制CD8+T淋巴細胞的激活，從而有利于腫瘤轉(zhuǎn)移，提示γδT淋巴細胞/IL-17/中性粒細胞軸在乳腺癌肺轉(zhuǎn)移中的作用[5]。此外，曹雪濤院士課題組[6]發(fā)現(xiàn)，與對照小鼠相比Toll樣受體3(TLR3)缺陷的小鼠的腫瘤肺轉(zhuǎn)移明顯減少。其機制是正常的II型肺上皮細胞表面可表達天然免疫受體TLR3，識別腫瘤分泌到循環(huán)系統(tǒng)中的外泌體RNA，觸發(fā)趨化因子(CXCL1,CXCL2, CXCL5, CXCL12)表達，從而招募中性粒細胞至預轉(zhuǎn)移肺組織，形成炎性微環(huán)境，為腫瘤的轉(zhuǎn)移提供宜居環(huán)境。

腫瘤細胞可分泌多種腫瘤源性抑制因子(tumor derived suppressor factor,TDSF)，動員骨髓來源的細胞(bone marrow derived cell,BMDC)向原位腫瘤或預轉(zhuǎn)移部位遷移。例如，腫瘤來源的血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGF-A)、胎盤生長因子(PIGF)可招募VEGFR1+BMDCs向肺預轉(zhuǎn)移小生境遷移[2]。信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子-3(STAT3)組成性活化的腫瘤可通過分泌IL-6和IL-10，導致預轉(zhuǎn)移肺組織中STAT3活化，誘導成纖維細胞分泌纖連蛋白，進而招募CD11b+骨髓細胞在肺組織中聚集[7]。聚集于預轉(zhuǎn)移小生境中的MDSC可產(chǎn)生ARG1及ROS，抑制效應T淋巴細胞的殺傷功能[8]。不成熟的MDSC具有單核/巨噬細胞和中性粒細胞的特性[9]，低氧誘導因子-1(HIF-1)可活化NF-κB/G-CSF軸，而G-CSF的分泌則可招募MDSC至肺組織，促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移[10]。

NK細胞作為固有免疫的效應細胞，可通過細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞。然而，腫瘤組織中的NK細胞的細胞毒性明顯降低。Platonova等[11]分析了肺癌患者腫瘤組織中浸潤的NK細胞，發(fā)現(xiàn)這些NK細胞中激活型受體NKp30、NKp80、CD16、NKG2D及DNAM-1的表達水平明顯下調(diào)，IFN-γ分泌水平顯著降低。研究發(fā)現(xiàn)，非小細胞肺癌(NSCLC)患者腫瘤組織及外周血循環(huán)中的CD56+CD16- NK細胞高表達VEGF、PIGF、IL-8等細胞因子，肺鱗狀細胞癌(SCC)患者外周血NK細胞亞群亦產(chǎn)生高水平的VEGF和PIGF。體外實驗證實，NSCLC和SCC患者的NK細胞上清可誘導內(nèi)皮細胞的趨化活性，并可促進體外血管樣結(jié)構的形成[12]。這些研究結(jié)果提示，患者體內(nèi)NK細胞分泌的相關因子可誘導預轉(zhuǎn)移部位的血管生成，參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程。

最近的研究結(jié)果提示，Treg可進入淋巴結(jié)、肝、肺及骨髓，參與腫瘤預轉(zhuǎn)移小生境形成的調(diào)控[13]，并與MDSC協(xié)同，共同維持預轉(zhuǎn)移小生境的免疫抑制性微環(huán)境[14,15]。脯氨酰羥化酶可誘導Treg聚集于肺組織，抑制預轉(zhuǎn)移小生境中CD4+和CD8+T淋巴細胞對腫瘤細胞的殺傷[16]。腫瘤相關的調(diào)節(jié)性B細胞(Breg)則可通過活化TgfβR1/TgfβR2信號通路，促進MDSC產(chǎn)生ROS和NO，進一步抑制CD4+、CD8+T淋巴細胞的功能[17]。值得注意的是，在不同類型的腫瘤組織中，Treg具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能[18]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[19]，乳腺癌組織中FOXP3+Treg數(shù)量增多常提示疾病無進展及總生存期縮短，并預示患者5年后復發(fā)的風險增加。但是，當結(jié)腸癌組織中浸潤的FOXP3+Treg的數(shù)量增加時，患者5年存活率則提高[20]。關于Treg和Breg在腫瘤轉(zhuǎn)移以及預轉(zhuǎn)移小生境中的作用仍缺乏深入的探索。

1.2其他類型的細胞 TAM是腫瘤微環(huán)境中重要的細胞群體，通過多種機制參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。利用小鼠移植瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移前數(shù)月，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細胞即已被招募至肝臟。從肺癌患者腫瘤組織中分離的TAM高表達Cathepsin K、COX-2、MMP-9、PDGF-B、uPA、VEGFA及HGF，這些細胞因子和酶在腫瘤微環(huán)境重塑的過程中可能發(fā)揮重要的作用[21]。臨床研究發(fā)現(xiàn)[22]，胰腺導管癌患者中的循環(huán)單核細胞及肝組織中的轉(zhuǎn)移相關巨噬細胞(metastasis associated macrophage, MAM)可通過高表達的顆粒體蛋白(granulin)激活肝星形細胞產(chǎn)生peritostin，誘導預轉(zhuǎn)移肝組織纖維化微環(huán)境的形成，以維持轉(zhuǎn)移至肝臟的腫瘤細胞生長。Qian等[23]報道發(fā)現(xiàn)，腫瘤和基質(zhì)細胞合成的CCL2可對CCR2+的MAM進行招募，促進乳腺癌細胞在肺組織中的定植。

腫瘤微環(huán)境中存在大量的CAF，但這些CAF的起源尚不清楚[24]。有人認為，CAF發(fā)生于腫瘤EMT的轉(zhuǎn)化過程[25]，但亦有報道提出爭議。Erez等[26]通過基因轉(zhuǎn)錄譜的比較分析發(fā)現(xiàn)，皮膚癌、乳腺癌及胰腺癌的CAF表達大量的促炎細胞因子及趨化因子，用PDSC5(HPV-16衍生的皮膚癌細胞系)的培養(yǎng)上清處理正常皮膚成纖維細胞，可使細胞馴化為具有促炎活性的CAF。這就提示腫瘤細胞分泌的TDSFs可隨脈管到達預轉(zhuǎn)移組織部位，馴化預轉(zhuǎn)移部位中的成纖維細胞轉(zhuǎn)化為CAF，參與預轉(zhuǎn)移小生境的形成，進而介導腫瘤細胞生長、血管形成及巨噬細胞的招募。

2 預轉(zhuǎn)移小生境的誘導及形成

在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生之前，腫瘤細胞可對遠處器官進行時空性調(diào)控，誘導、重塑并形成預轉(zhuǎn)移小生境。在預轉(zhuǎn)移小生境形成的初級階段，來自原位腫瘤低氧及炎性環(huán)境的多種TDSF招募BMDC、免疫細胞等至預轉(zhuǎn)移組織，并對預轉(zhuǎn)移小生境進行誘導馴化。此時，預轉(zhuǎn)移小生境尚不能支持轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的定植及生存。隨著招募細胞及其產(chǎn)生的細胞因子或其他分子在預轉(zhuǎn)移部位的相互作用，間質(zhì)細胞、ECM及脈管系統(tǒng)的重塑，腫瘤預轉(zhuǎn)移小生境逐步成熟[27,28]。成熟的預轉(zhuǎn)移小生境為腫瘤細胞定植、存活及增殖提供了宜居環(huán)境，進而開啟腫瘤轉(zhuǎn)移的開關。

炎癥和低氧環(huán)境可誘導腫瘤細胞產(chǎn)生TDSF，以旁分泌的方式促進腫瘤細胞浸潤及預轉(zhuǎn)移小生境形成。腫瘤實質(zhì)細胞、間質(zhì)細胞及其釋放的多種細胞因子、生長因子、趨化因子、活化的基質(zhì)成分、金屬蛋白酶共同參與促炎微環(huán)境的誘導、形成及維持[29]。 Sceneay等[30]應用乳腺癌小鼠模型證實，注射低氧誘導的乳腺癌細胞上清可在缺乏原發(fā)腫瘤的情況下，誘導MDSC進入肺組織。進一步研究發(fā)現(xiàn)，浸潤于肺組織的細胞群體包括CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+ MDSC及CD3-/NK1.1+ NK細胞，提示原發(fā)腫瘤在低氧環(huán)境下產(chǎn)生的細胞因子和生長因子可調(diào)控CD11b+/Ly6Cmed/Ly6G+ MDSC及CD3-/NK1.1+/CD11blow/CD27low NK細胞招募至預轉(zhuǎn)移肺組織，這些細胞將成為預轉(zhuǎn)移小生境的重要細胞群體。

間質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)(ECM)及血管的重塑對于預轉(zhuǎn)移小生境的形成是十分必要的，它們?yōu)檗D(zhuǎn)移腫瘤細胞的復蘇、活化、存活及增殖提供了宜居環(huán)境。在發(fā)育過程中，ECM重塑受精確的機制調(diào)控，主要通過控制酶的表達及活性而完成。預轉(zhuǎn)移組織中ECM的重塑可能是預轉(zhuǎn)移小生境形成的第一步。腫瘤來源的外泌體(exosome)和微泡(microvesicle, MV)含多種miRNA和蛋白分子，這些外泌體或MV被基質(zhì)細胞捕獲后，可誘導基質(zhì)細胞生物學行為或功能的改變，并調(diào)變ECM。乳腺癌細胞產(chǎn)生的MV可被肺成纖維細胞和腦星形膠質(zhì)細胞攝取。這些MV中含miR-122，后者可通過下調(diào)丙酮酸激酶限制小生境細胞對葡萄糖的攝取，提示腫瘤細胞可能對宿主能量代謝進行重編程，改變預轉(zhuǎn)移小生境細胞對葡萄糖的利用，從而使腫瘤細胞在預轉(zhuǎn)移小生境中具有競爭性以維持生存[31]。ECM中膠原沉積、組織纖維化及金屬蛋白酶活性異常是腫瘤ECM的重要特征。除生化特性改變外，腫瘤相關ECM的結(jié)構及力學特征亦呈現(xiàn)明顯的異常。Elkabets[32]等的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌移植瘤小鼠骨髓中Sca1+cKit-CD45+造血祖細胞可被招募至腫瘤部位，并可介導成纖維細胞的活化，提示來自原發(fā)腫瘤的內(nèi)分泌信號通過動員骨髓細胞，誘導基質(zhì)細胞及ECM重塑，影響預轉(zhuǎn)移小生境的形成，從而支持轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞在遠處器官定植。

預轉(zhuǎn)移小生境中的脈管系統(tǒng)直接影響循環(huán)腫瘤細胞的浸潤及轉(zhuǎn)移。多種TDSF可通過旁分泌的方式調(diào)控預轉(zhuǎn)移小生境中血管、淋巴管的重塑，為腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移及定植提供“營養(yǎng)通路”。對小鼠肺轉(zhuǎn)移模型的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)移發(fā)生之前即可觀察到肺局部血管通透性增強。原發(fā)腫瘤分泌的TDSF(如CCL2、TNFα、VEGF等)可直接或間接刺激肺血管內(nèi)皮細胞CCR2的表達及分泌炎性介質(zhì)(血清淀粉樣蛋白A3和S100A8)，增強局部血管的通透性，并吸引外周血白細胞及BMDC到達局部高滲區(qū)，從而促進腫瘤細胞侵入肺組織[33]。不同類型的間質(zhì)細胞活躍地參與了血管系統(tǒng)的重塑。在結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)原位腫瘤中肥大細胞的浸潤程度及其分泌的類胰蛋白酶(Tryptase)與腫瘤血管密度呈正相關[34]。Orimo等[35]發(fā)現(xiàn)，從浸潤性乳腺癌患者中分離的CAF可通過分泌高水平的SDF-1，招募內(nèi)皮祖細胞，促進血管生成。

某些腫瘤可優(yōu)先通過癌周淋巴管轉(zhuǎn)移[36]，發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移的患者預后較差[37]。Lee等[38]在腹股溝脂肪墊接種的乳腺模型中發(fā)現(xiàn)，用三陰性乳腺癌細胞(MDA-MB-231及SUM-149)的無血清培養(yǎng)上清(TCM組)及無血清培養(yǎng)基(SFM組)分別預處理小鼠，TCM組可較早的發(fā)生腋窩、臂淋巴結(jié)及肺轉(zhuǎn)移，且其發(fā)生轉(zhuǎn)移的肺及淋巴結(jié)中可見明顯的淋巴管生成，提示乳腺癌細胞的培養(yǎng)上清在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移的同時，還可能調(diào)控預轉(zhuǎn)移部位的淋巴管形成。隨后實驗發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌細胞系通過分泌的IL-6誘導淋巴管內(nèi)皮細胞(lymphatic endothelial cells,LECs)中的Stat3磷酸化，介導HIF-1α/VEGF/pStat3-pc-Jun-pATF-2聚合體形成，后者可誘導LECs表達CCL5，從而招募腫瘤細胞至預轉(zhuǎn)移肺組織和淋巴結(jié)[39]。

3 潛在的臨床應用價值

綜上所述，腫瘤轉(zhuǎn)移依賴預轉(zhuǎn)移小生境的形成。因此，理論上根據(jù)預轉(zhuǎn)移小生境的形成過程及其組成特點，阻斷預轉(zhuǎn)移小生境的形成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移相關的基質(zhì)細胞在預轉(zhuǎn)移部位的招募、抑制腫瘤脈管系統(tǒng)的重塑，有可能成為控制腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略。

Labelle等[40]提出，預轉(zhuǎn)移小生境形成早期，血小板源性趨化因子(CXCL5和CXCL7)為中性粒細胞的快速招募所必須，阻斷CXCL5/CXCL7的受體CXCR2可減少粒細胞在預轉(zhuǎn)移部位的聚集及抑制轉(zhuǎn)移腫瘤的定植。在小鼠乳腺癌模型的研究中，CCL2的中和性抗體可抑制骨髓中單核細胞的動員及乳腺癌肺轉(zhuǎn)移。但停用CCL2抗體后，可觀察到大量的單核細胞入血、腫瘤血管生成及肺組織中轉(zhuǎn)移腫瘤細胞的增殖，這一現(xiàn)象主要依賴IL-6、VEGFA實現(xiàn)，而聯(lián)用CCL2和IL-6中和抗體，則可有效抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[41]。

目前，預轉(zhuǎn)移小生境的形成、功能、維持仍有待進一步深入探索。例如，不同類型腫瘤依賴的預轉(zhuǎn)移小生境的特性及預轉(zhuǎn)移小生境的誘導機制有何異同？預轉(zhuǎn)移小生境產(chǎn)生的決定性因素有哪些？哪些因素可能喚醒預轉(zhuǎn)移小生境中休眠的腫瘤細胞？相關線索的揭示將有助于抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進展以及建立轉(zhuǎn)移性腫瘤治療的新策略。

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(2017-03-17 收稿)(張愛國 編輯)

R 730.231

A

2095-2694(2017)06-500-05

國家自然科學基金(編號：81572845)。

陳新田(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：腫瘤免疫。

施 明。