孫楠+付云磊+李　偉

（1.黃淮學(xué)院，河南駐馬店 463000；2.天方藥業(yè)，河南駐馬店 463000）

摘 要 克隆茶樹II型核糖體失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2，能夠參與茶樹的防衛(wèi)反應(yīng)，加深對CsRIPs基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及RIPs的生物學(xué)功能理解。以鳧早2號的幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，對茶樹II型核糖體失活蛋白基因CsRIPI和CsRIP2進(jìn)行了研究，其在營養(yǎng)缽生長了2 a，分析了CsRIP基因克隆與序列、CsRIP因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹、CsRIP基因在不同組織中的表達(dá)等，并對CsRIP基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域分析和同源性進(jìn)行了比較。

關(guān)鍵詞 茶樹；II型核糖體；失活蛋白基因；CsRIPI；CsRIP2

中圖分類號：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.24.087

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇茶樹品種“鳧早2號”的幼苗進(jìn)行假眼小綠葉蟬和機(jī)械傷害處理，其在營養(yǎng)缽中生長了2 a。在處理材料之前，筆者在光照時(shí)間12h/b，強(qiáng)度160μmol/（m2·s1），溫度25～28 ℃的條件下，讓茶樹幼苗生長了7 d。假眼小綠葉蟬處理：用通風(fēng)良好的塑料網(wǎng)，將茶樹幼苗罩上，將50個(gè)左右的假眼小綠葉蟬成蟲，接種到每一株茶樹上，3、6、12、24、48h后，將充分伸展的茶樹葉片剪取。機(jī)械傷害：將茶樹葉片的邊緣用剪刀剪去，分別在處理3、6、12、24、48h后剪取葉片。為了培養(yǎng)在相同條件下沒有進(jìn)行處理的茶樹幼苗作為對照，每次取6株。每種處理3次重復(fù)。對照和各種處理的葉片采集后，置于-80℃冰箱中保存，迅速用液氮處理[1]。

1.2 CsRIP2基因cDNA的克隆

從茶樹葉子中，利用RNeasy plantmini kit提取總RNA，而總RNA則用DNaseI去除其中殘余的DNA。合成第1鏈cDNA采用了First Strand c DNA Synthesis 試劑盒，利用特異引物CsRIP-F2和CsRIP-R2擴(kuò)增Csrip2基因的cDNA序列。凝膠電泳PCR產(chǎn)物后，將目的片段與pMD19-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5α，對質(zhì)粒進(jìn)行重組后測序。

1.3 CsRIP1 基因全長cDNA的克隆

設(shè)計(jì)1對特異性引物CsRIP-F1和CsRIP-R1時(shí)，根據(jù)Cs-Ev2cDNA片斷的核苷酸序列，并用于5，RACE和3，RACE。利用5，通用引物和CsRIP-R1擴(kuò)增該基因cDNA的5，末端，以 5-ready RACE cDNA文庫為模板；利用3，通用引物和CsRIP-F1擴(kuò)增該金銀的3，末端，以3-ready RACE cDNA文庫為模板；拼接這兩個(gè)產(chǎn)物，根據(jù)5和 3非編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物得到CsRIP-F2、CsRIP-R2，得到CsRIP1的全長cDNA，擴(kuò)增該基因完整的ORF，反映程序都為：96℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)。

1.4 CsRIP基因組DNA的克隆

以茶樹葉片為材料，按照Plant DNAIsolation Reagent試劑盒說明書，提取茶樹的基因組DNA。利用特異引物，以基因組為模板，擴(kuò)增CsRIP基因的gDNA序列。

1.5 Real-time qRT-PCR 分析 CsRIP 基因的表達(dá)

分別選取茶樹的幼根、莖、葉片和子葉，采用Real-time qRT-PCR分析CsRIP的基因表達(dá)，用Trizol Reagent提取總RNA，檢測其完整性和濃度，采用了瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)。合成第1鏈cDNA采用了First Strand c DNA Synthesis試劑盒，用于檢測不同組織中CsRIP1和CsRIP2的表達(dá)水平。為了檢測CsRIP基因的表達(dá)水平，選取完全伸展，經(jīng)過不同處理的茶樹幼苗葉片，分別提出總RNA。

設(shè)計(jì)CsRIP1基因特異性的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR，根據(jù)2個(gè)CsRIP基因3 UTR的差異性區(qū)域，分析引物CsRIPI-R、CsRIP1-R。采用茶樹的α-tubulin基因作為內(nèi)參對不同樣品cDNA模板量進(jìn)行校準(zhǔn)。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照TaKaRa公司的試劑盒說明書，且每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，是定程序使擴(kuò)增結(jié)束后PCR儀自動(dòng)運(yùn)行繪制溶解曲線。在組織表達(dá)分析中，用表達(dá)量最低的組織作為對照，以未處理的材料作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsRIP基因克隆與序列分析

擴(kuò)增后，分別得到1條特異條帶，發(fā)現(xiàn)5，RACE產(chǎn)物長1330bp，3，端RACE產(chǎn)物長936bp。前者3，端序列與

Cs-Ev2的5，端序列完全重疊，后者5，端序列與Cs-Ev23，端序列完全重疊。拼接后得到2032bp的全場cDNA，該序列包含5，非翻譯區(qū)73bp、3，非翻譯區(qū)224bp、閱讀框1713bp等，其等電點(diǎn)位4.75，預(yù)測分子質(zhì)量為63.55kDa。植物的II型RIPs常常在植物的種子中積累，本文通過上述實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)新的茶樹II性核糖體失活蛋白基因。并且CsRIP2與CsRIPI含有一個(gè)1713bp的ORF，有98%的序列一致，編碼產(chǎn)物與CsRIP1具有96%的相似性。已克隆的CsRIP2的3，UTR與CsRIPI相比，缺失了一段15bp的序列。另外，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)CsRIP1和CsRIP2基因的gDNA都不含內(nèi)含子。

2.2 CsRIP基因編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)域分析和同源性比較

通過上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CsRIP含有1個(gè)信號肽，由22個(gè)氨基酸殘基組成，第22位的纈氨酸和第23位的半胱氨酸之間是切割點(diǎn)；并且CsRIPs含有1個(gè)RIP結(jié)構(gòu)域，相當(dāng)于II型RIP的A鏈；含有2個(gè)ricin結(jié)構(gòu)域。相思子毒素-a和蓖麻毒素A鏈的N-糖苷酶活性中心裂隙中所有氨基酸殘基均出現(xiàn)在CsRIPs的相應(yīng)位置上，CsRIPs與樟的辛納毒蛋白III前體、蓖麻毒素前體等具有較高的序列相似性。另外，蓖麻毒素、白果槲寄生的凝集素I等含有2個(gè)同源的RBL結(jié)構(gòu)域，并且其具有3個(gè)谷氨酰胺-任意氨基酸-色氨酸重復(fù)基序。同時(shí)在對應(yīng)位置上，都含有3個(gè)保守的QXW基序，且5個(gè)保守的氨基酸殘疾組成了蓖麻毒素的2個(gè)碳水化合物結(jié)合位點(diǎn)，在CsRIPs的B鏈中，這2組氨基酸殘基也高度保守。而CsRIPs的A鏈靠近C末端的位置上有1個(gè)半胱氨酸殘疾，與其他的一樣，B鏈上有9個(gè)。

2.3 CsRIP基因在不同組織中的表達(dá)分析

在茶樹4種不同組織中，利用Real-time qRT-PDR技術(shù)檢測CsRIP1和CsRIP2的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，在幼根、葉子等兩者均有表達(dá)。CsRIP1葉子中的表達(dá)水平最高，CsRIP2在子葉中的表達(dá)水平最高。

2.4 CsRIP基因編碼產(chǎn)物的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

以多基因家族的形式，該糖體失活蛋白存在于植物的基因組中。采用DNAMAN軟件中的鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果表明，茶樹的2中RIPs與樟的RIPs聚為一支，同物種的RIPs首先聚類合并，蓖麻、荷蘭鳶尾等的RIPs聚為一支，相思子和美麗相思子的RIPs聚為一支。

2.5 假眼小綠葉蟬和機(jī)械傷害處理對CsRIP基因表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)表明，CsRIP1和CsRIP2表達(dá)在假眼小綠葉蟬取食3h后開始升高，取食48h后，兩者的轉(zhuǎn)錄本水平大約分別是對照的120和100倍。機(jī)械傷害處理6h后，CsRIP1的表達(dá)達(dá)到最大值。處理4h后，再度增強(qiáng)。而在機(jī)械傷害處理6h后，CsRIP2表達(dá)水平升高，處理后48h，降至對照水平1/2。

3 結(jié)論與討論

本研究從茶樹中分裂出2個(gè)II型核糖體失活蛋白質(zhì)基因，其編碼570個(gè)氨基酸殘基，并且都含有1個(gè)1713bp讀碼框。CsRIPI的5，和3，UTR等長度分別為73、224bp，CsRIP2與CsRIP1基因的3，UTR相比，缺失了一段15bp的核苷酸序列。在成熟的過程中，II型核糖體失活蛋白前體信號肽和連接肽被切除，通過1個(gè)二硫鍵A鏈和B鏈連接起來。II型RIPs的活性中心點(diǎn)保守的氨基酸殘疾均出現(xiàn)在CsRIPsA鏈的相應(yīng)位置上[2]。另外，A鏈發(fā)揮其酶學(xué)活性的關(guān)鍵因素是低水平的賴氨基酸殘基，B鏈能夠結(jié)合細(xì)胞表面寡糖鏈上的半乳糖殘基，介導(dǎo)毒蛋白的內(nèi)吞過程。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，B鏈含有2個(gè)重復(fù)的結(jié)構(gòu)域，因此，B鏈可能起源于一個(gè)編碼40個(gè)氨基酸殘基的基因。并且相同的結(jié)構(gòu)模式和保守的氨基酸殘基也存在與CsRIPs的B鏈上。

在已檢測的4重組織中，盡管2個(gè)CsRIP基因都有所表達(dá)，但是也具有一定的組織特異性。本實(shí)驗(yàn)中，假眼小綠葉蟬取食快速誘導(dǎo)CsRIPs基因表達(dá)，機(jī)械傷害顯著誘導(dǎo)CsRIPs基因的表達(dá)，但是結(jié)果表明CsRIPs已經(jīng)發(fā)生亞功能化，可能參與茶樹的防衛(wèi)反應(yīng)。并且根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，可以設(shè)想在進(jìn)化的過程中，昆蟲取食的選擇壓力導(dǎo)致CsRIPs獲得了葉片中表達(dá)，演變成了一種防衛(wèi)蛋白，且受昆蟲取食誘導(dǎo)的特性。

參考文獻(xiàn)

[1]黃亞輝，張覺晚.茶樹抗假眼小綠葉蟬的葉片解剖特征[J].茶葉科學(xué)，1998（1）：35-38.

[2]謝素霞，程琳，曾威，等.茶樹HCT基因的克隆及表達(dá)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013（6）：19-22.

（責(zé)任編輯：趙中正）