婁文勇, 趙 瑩, 彭 飛, 宗敏華
(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,應(yīng)用生物催化實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640; 2. 華南理工大學(xué),廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)
環(huán)氧化物水解酶的研究進(jìn)展
婁文勇1,2*, 趙 瑩1,2, 彭 飛1,2, 宗敏華1,2
(1. 華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,應(yīng)用生物催化實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640; 2. 華南理工大學(xué),廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)
環(huán)氧化物水解酶可高效率、高選擇性地水解環(huán)氧化物生成手性鄰二醇,對(duì)光學(xué)活性的鄰二醇的合成和光學(xué)活性的環(huán)氧化物的制備具有重要意義. 文章闡述了環(huán)氧化物水解酶的作用、來(lái)源、結(jié)構(gòu)及其催化機(jī)制,進(jìn)一步綜述了環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧化物水解、環(huán)氧化物水解酶的克隆表達(dá)等研究進(jìn)展.
水解酶; 環(huán)氧化物; 鄰二醇; 催化
環(huán)氧化物通過(guò)選擇性開(kāi)環(huán)可以制備具有光學(xué)活性的手性醇類(lèi)化合物及選擇性保留具有重要價(jià)值的環(huán)氧化物. 如作為神經(jīng)保護(hù)藥關(guān)鍵性合成子的(R)-4-氯苯基乙二醇可經(jīng)環(huán)氧化物水解酶水解相應(yīng)的環(huán)氧化物制備而得. 與之類(lèi)似,茚環(huán)類(lèi)環(huán)氧化物經(jīng)環(huán)氧化物水解酶催化開(kāi)環(huán)水解也可以制得抗艾滋病藥物齊夫而定的重要中間體物質(zhì):(1R,2S)-環(huán)氧化合物和(1R,2R)-二醇. 環(huán)氧化物水解酶廣泛存在于自然界中,在植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中均存在環(huán)氧化物水解酶,其催化環(huán)氧化物水解反應(yīng)相比化學(xué)催化有諸多優(yōu)點(diǎn),如選擇性高、催化效率高、環(huán)境友好等,因此引起了廣泛關(guān)注. 然而,從自然界篩選的環(huán)氧化物水解酶也存在一定的局限,如理論產(chǎn)率不超過(guò)50%,底物的耐受性較低,酶提取純化困難和酶表達(dá)量較低等缺點(diǎn). 針對(duì)這些問(wèn)題,研究人員采用了基因克隆表達(dá)及基因突變等技術(shù)有效地克服了這些困難.
近年來(lái),光學(xué)純的醇、氨基酸、胺、環(huán)氧化物和有機(jī)酸的制備成為研究的熱點(diǎn),其中手性醇具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]. 1,2-苯乙二醇是一種手性醇,因其烷基鏈上α位連有4個(gè)不同的化學(xué)基團(tuán)而具有一定的旋光性. 目前,像這種具有旋光性的手性醇被廣泛用于醫(yī)藥領(lǐng)域、農(nóng)藥領(lǐng)域和材料領(lǐng)域. 光學(xué)純的(S)-1,2-苯乙二醇因具有光學(xué)、熱學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)不僅是液晶材料中重要的添加劑,同時(shí)還可以作為農(nóng)藥的中間體;而光學(xué)純的(R)-1,2-苯乙二醇是制備具有光學(xué)活性的醫(yī)用藥物的重要中間體,如進(jìn)一步合成光學(xué)活性藥物β-腎上腺素阻斷劑、(R)-硝基心定、抗心律失常藥等[2-4]. (R)-1,2-庚二醇是用于合成鐵電液晶材料的γ-內(nèi)酯的前體[5]. (2R,3S)-3-(4-甲氧基苯基)縮水甘油酸酯可用于合成抗癌藥物氨肽酶N抑制劑Besattin、Phebetin、Porbestni和MR-387等一系列化合物[6]. (R)-芐基縮水甘油醚用于合成Acetogenins等免疫抑制劑[7].
環(huán)氧化物是合成手性醇的重要中間體,其立體選擇性開(kāi)環(huán)可得到手性環(huán)氧化物或手性醇化合物,并用于后續(xù)的應(yīng)用. 目前,環(huán)氧化物開(kāi)環(huán)水解成手性醇的反應(yīng)多集中在化學(xué)法和生物法[8]. 化學(xué)法常存在諸多不足,因?yàn)榄h(huán)氧化物在水中溶解性較差,需要添加有機(jī)溶劑,溶劑的消耗量比較大,步驟較繁瑣,反應(yīng)條件較苛刻,產(chǎn)品光學(xué)純度低,而且反應(yīng)中需要添加有毒的手性催化劑和保護(hù)劑[9-10]. 另外,Jacobsen法雖然能水解外消旋環(huán)氧化物得到手性鄰二醇和手性環(huán)氧化物,但其存在底物譜窄、反應(yīng)條件苛刻、選擇性低、產(chǎn)物分離純化困難和環(huán)境污染等問(wèn)題. 與化學(xué)法相比,生物法利用酶或細(xì)胞作為催化劑,不僅具有催化效率高、選擇性高、反應(yīng)溫和、污染小等優(yōu)點(diǎn),而且能夠制備一些化學(xué)法難以合成的對(duì)映體純的小分子手性鄰二醇和手性環(huán)氧化物,因而生物法日益受到人們青睞,逐漸成為手性化合物制備的重要手段[11-13].
環(huán)氧化物水解酶是可以將水分子選擇性地加成至環(huán)氧環(huán)上,從而生成鄰二醇類(lèi)化合物的一種酶[14],它還可通過(guò)水解人體內(nèi)環(huán)氧化物從而降低人體患癌癥的幾率[15]. 在活細(xì)胞中,芳香族和脂肪族的環(huán)氧化物均可被環(huán)氧化物水解酶水解,獲得二醇,取得解毒和信號(hào)調(diào)節(jié)作用.[16-17]. 環(huán)氧化物水解酶的來(lái)源較為廣泛,普遍存在于自然界的生物體中,幾乎所檢測(cè)過(guò)的哺乳動(dòng)物體內(nèi)都存在環(huán)氧化物水解酶. 在土豆、綠豆、黃豆、香蕉及煙草等植物中均發(fā)現(xiàn)了該水解酶. 另外,通過(guò)對(duì)微生物的研究也發(fā)現(xiàn),該酶廣泛存在于微生物體內(nèi),其主要微生物來(lái)源有Agrobacteriumradiobacter、Arthrobacterspp.、Aspergillusniger、Bacillusmegaterium、BeauveriaSulfurescens、Chryseomonasluteola、Corynebacteriumspp.、Mycobacteriumparaffinicum、Methylobacteriumspp.、Norcadiaspp.、Pseudomonasspp.、Rhodococcuserythropolis、Rhodosporidiumtoluloides、Rhodotorulaglutinis、Streptomycesantibioticus、Trichosporonloubierii、Xanthophyllomycesdendrorhous等[18].
自HECHTBERGER等[19]報(bào)道了利用來(lái)源于紅球菌的環(huán)氧化物水解酶選擇性地催化1,2-環(huán)氧庚烷不對(duì)稱(chēng)水解生成相應(yīng)的R-二醇后,在水相中不同來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶催化不同結(jié)構(gòu)的環(huán)氧化物不對(duì)稱(chēng)水解的研究相繼出現(xiàn). 21世紀(jì)初,我國(guó)的研究人員在產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的菌株篩選方面做了大量工作. 曲音波課題組從全國(guó)多地收集到的長(zhǎng)期被石油、動(dòng)物油或植物油污染的土壤或水樣中分離得到一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的類(lèi)產(chǎn)堿假單胞菌,該菌可用于拆分苯基縮水甘油酸乙酯. 研究發(fā)現(xiàn),在添加吐溫60的反應(yīng)體系中,該菌全細(xì)胞催化的底物濃度可達(dá)78 mmol/L,且產(chǎn)物的光學(xué)純度達(dá)98%,但產(chǎn)率較低(33%)[20-21]. 孫萬(wàn)儒課題組從土壤樣品中篩選出一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的黑曲霉菌株[22],利用該菌株催化外消旋環(huán)氧苯乙烷不對(duì)稱(chēng)水解,得到(R)-1,2-苯基乙二醇的光學(xué)純度大于99%,但隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),底物的非酶水解嚴(yán)重,導(dǎo)致產(chǎn)物的光學(xué)純度明顯下降[23]. 許建和課題組從土壤中篩選出一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的巨大芽孢桿菌,該菌具有較高的對(duì)映體選擇性,可選擇水解(R)-縮水甘油苯基醚,對(duì)映體選擇率E值高達(dá)47.8%,可選擇性地水解(R)-縮水甘油苯基醚[24],后期他們還報(bào)道了綠豆中存在環(huán)氧化物水解酶的事實(shí)[25]. 國(guó)外同樣也對(duì)產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的菌株進(jìn)行了篩選研究. DUARAH等[26]從土壤里篩選到一株塔賓曲霉,該菌株具有反應(yīng)速度快、選擇性高等優(yōu)點(diǎn),反應(yīng)45 min可將外消旋的環(huán)氧苯乙烷水解成光學(xué)純度達(dá)97%的(R)-苯乙二醇,且底物的轉(zhuǎn)化率高達(dá)99%. 同時(shí)還研究了苯環(huán)上的氯取代對(duì)反應(yīng)的影響,結(jié)果表明,取代后底物的轉(zhuǎn)化率不受影響,但是產(chǎn)物的光學(xué)純度以及反應(yīng)時(shí)間受到嚴(yán)重影響.
目前,已發(fā)現(xiàn)的環(huán)氧化物水解酶可以分為以下幾類(lèi):可溶性環(huán)氧化物水解酶、微粒體環(huán)氧化物水解酶、保幼激素環(huán)氧化物水解酶、膽固醇環(huán)氧化物水解酶、羥環(huán)氧烯酸水解酶、白三烯A4環(huán)氧化物水解酶以及檸檬烯環(huán)氧化物水解酶7個(gè)亞家族[27-29].
對(duì)比不同來(lái)源環(huán)氧化物水解酶的蛋白氨基酸序列發(fā)現(xiàn),不同來(lái)源酶的氨基酸序列相似程度很高,且基本上都屬于α/β折疊型的水解酶[30],它們具有三位一體的結(jié)構(gòu)[31],1個(gè)電荷中繼網(wǎng)和親核基團(tuán)共同組成了催化三聯(lián)體. 活性位點(diǎn)由核心結(jié)構(gòu)和帽子結(jié)構(gòu)組成,核心結(jié)構(gòu)由2個(gè)天冬氨酸殘基和1個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成[32-33]. 目前接受程度較高的催化機(jī)理為:先由酶的帽子結(jié)構(gòu)中2個(gè)酪氨酸殘基將環(huán)氧化物中的1個(gè)O原子質(zhì)子化,再經(jīng)酶的1個(gè)天冬氨酸殘基進(jìn)攻該部分被質(zhì)子化的環(huán)氧化物,形成1個(gè)共價(jià)結(jié)合的中間體,然后落入酶活性中心的1個(gè)水分子受到組氨酸殘基和另一個(gè)天冬氨酸殘基的活化,失去1個(gè)質(zhì)子,形成1個(gè)羥基,該羥基進(jìn)而進(jìn)攻乙二醇-單酯-酶中間體,酪氨酸被還原,環(huán)氧化物被水解生成二醇[33]. 然而,不同類(lèi)型和不同來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量大小卻明顯不同,哺乳動(dòng)物的可溶性環(huán)氧化物水解酶是由2個(gè)62 kDa單體結(jié)構(gòu)組成的同型二聚體,而來(lái)源于植物的可溶性環(huán)氧化物水解酶一般以單體或二聚體蛋白的形式存在,其相對(duì)分子質(zhì)量為35 kDa左右[33-34]. 微粒體環(huán)氧化物水解酶的相對(duì)分子質(zhì)量約50 kDa[35],而羥環(huán)氧化物烯酸水解酶和白三烯A4環(huán)氧化物水解酶的相對(duì)分子質(zhì)量分別為53 kDa和70 kDa.
環(huán)氧化物水解酶可以高效催化環(huán)氧化物水解并生成鄰二醇,這也引起了研究人員對(duì)該酶催化反應(yīng)條件的探索. 婁文勇課題組先后研究了來(lái)源于綠豆和黃豆的環(huán)氧化物水解酶的催化特性[32,36-40]. 在2012年,該課題組陳文靜[32]利用從綠豆中提取的環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷. 由于環(huán)氧苯乙烷在水相中(特別是在高底物濃度情況下)易水解的性質(zhì),建立了在磷酸緩沖液體系中,底物濃度為5 mmol/L的綠豆環(huán)氧化物水解酶高效催化環(huán)氧苯乙烷的反應(yīng)體系. 在這個(gè)體系里,催化終止時(shí)可獲得(R)-1,2-苯乙二醇的對(duì)映體過(guò)量率高達(dá)92.6%,且產(chǎn)率高達(dá)47.6%. 為解決水相體系中催化反應(yīng)時(shí)底物濃度較低的問(wèn)題,隨后研究了在有機(jī)溶劑-緩沖液雙相反應(yīng)體系中綠豆環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷,選取6種有機(jī)溶劑構(gòu)建雙相催化體系,分別是乙酸乙酯、三氯甲烷、環(huán)己烷、正己烷、辛烷和癸烷. 采用這6種有機(jī)溶劑-緩沖液雙相反應(yīng)體系,利用綠豆環(huán)氧化物水解酶催化環(huán)氧苯乙烷生成(R)-1,2-苯乙二醇,對(duì)比研究了這6種有機(jī)溶劑體系中反應(yīng)的對(duì)映體過(guò)量率、產(chǎn)率以及有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響. 結(jié)果表明,乙酸乙酯和三氯甲烷對(duì)綠豆環(huán)氧化物水解酶的毒性較大,易使酶失活. 進(jìn)一步研究底物和產(chǎn)物在雙相體系的分配系數(shù)發(fā)現(xiàn),所選取的有機(jī)溶劑對(duì)底物都具有較好的萃取效果,反應(yīng)體系的底物濃度得到了一定程度的提高,表明在所選取的有機(jī)溶劑-緩沖液體系中可以有效解除底物對(duì)酶的毒性. 綜合酶在6種雙相反應(yīng)體系中的催化結(jié)果以及底物的分配情況,最終確定正己烷-緩沖液體系為進(jìn)一步研究的催化反應(yīng)體系. 經(jīng)過(guò)催化反應(yīng)條件的優(yōu)化后,最終底物濃度有效提高4倍,且產(chǎn)率和對(duì)映體過(guò)量率也有提高,分別為49.2%和94.3%.
離子液體作為一種替代有機(jī)溶劑的綠色溶劑,具有低毒、難揮發(fā)、呈液態(tài)的溫度范圍大、生物相溶性好的特點(diǎn),在催化領(lǐng)域表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景. 用疏水性離子液體替代有機(jī)溶劑,構(gòu)成疏水性離子液體-緩沖液雙相體系,研究綠豆環(huán)氧化物水解酶在此類(lèi)雙相體系中的催化性能. 在所研究的9種疏水性離子液體中,C4MIM·PF6對(duì)綠豆環(huán)氧化物水解酶的生物相容性最好,可以較好地保留酶的活性,經(jīng)過(guò)處理后,活性仍保留85.5%. 進(jìn)一步優(yōu)化該反應(yīng)體系的反應(yīng)條件后,所得產(chǎn)物的產(chǎn)率和對(duì)映體純度均有提高,分別為49%和97%,證明離子液體可用于催化體系中提高環(huán)氧化物水解酶的催化性能[36]. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),親水性離子液體可以促進(jìn)環(huán)氧化物水解酶的活力,其中C2OHMIM·BF4和C2OHMIM·TfO對(duì)該酶的毒性較低,且C2OHMIM·BF4能有效提高酶的催化速度[32].
酶的固定化技術(shù)有利于提高酶的穩(wěn)定性,固定化酶可以重復(fù)使用并容易與反應(yīng)體系分離,降低了產(chǎn)物的純化難度. 本課題組于春楊等[37-38]使用戊二醛作交聯(lián)劑,形成綠豆環(huán)氧化物水解酶交聯(lián)聚體,該酶聚集體的酶活性回收率達(dá)到92.5%,且重復(fù)使用4次后,仍保留有原始酶活性的85%以上. 進(jìn)一步研究酶聚集體在正己烷-緩沖液雙相體系中催化環(huán)氧苯乙烷發(fā)現(xiàn),該酶聚集體的活性明顯較游離酶的活性高,大大縮短了催化的時(shí)間(由20 h縮短至6 h),這也說(shuō)明該種固定化方法能有效提高酶的穩(wěn)定性. 黃豆也被證實(shí)具有環(huán)氧化物水解酶,本課題組岳東梅等[39-40]從黃豆中提取出環(huán)氧化物水解酶(SEH),并成功地將其固定在金屬有機(jī)框架材料UiO-66-NH2中,制備出SEH@UiO-66-NH2固定化酶. 考察在水相緩沖液體系,添加深度共熔溶劑作助溶劑時(shí)發(fā)現(xiàn),SEH@UiO-66-NH2在含氯化膽堿:尿素的緩沖液體系中,利用1,2-環(huán)氧辛烷作底物可選擇性制備(R)-1,2-辛二醇,產(chǎn)率和產(chǎn)物光學(xué)純度可以達(dá)到40.29%和80.52%.
環(huán)氧化物水解酶因其野生菌株表達(dá)量較低、菌體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、或從其它來(lái)源提取酶的過(guò)程復(fù)雜且酶的純度較低等缺點(diǎn),不少研究人員將環(huán)氧化物水解酶的基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá),以獲得高表達(dá)環(huán)氧化物水解酶的工程菌,并可使工程菌內(nèi)的目的基因進(jìn)一步突變,從而得到更高效的環(huán)氧化物水解酶. 另外,又因環(huán)氧化物水解酶只能高選擇性水解對(duì)映體中的一種環(huán)氧化物,這樣會(huì)造成產(chǎn)物的理論產(chǎn)率不超過(guò)50%的現(xiàn)象. 為了進(jìn)一步提升產(chǎn)物的產(chǎn)率,研究人員將可以水解不同構(gòu)型底物但能生成相同構(gòu)型產(chǎn)物的環(huán)氧化物水解酶的基因克隆表達(dá)于同一工程菌中,以提高產(chǎn)物的產(chǎn)率,突破理論上產(chǎn)率不超過(guò)50%的限制.
HWANG等[41]報(bào)道了一株產(chǎn)環(huán)氧化物水解酶的Caulobactercrescentus菌株,該菌株所產(chǎn)生的環(huán)氧化物水解酶能將外消旋的對(duì)氯環(huán)氧苯乙烷不對(duì)稱(chēng)水解成R型的鄰二醇,將該環(huán)氧化物水解酶的基因克隆表達(dá)于其它細(xì)胞中,該細(xì)胞在產(chǎn)物濃度大于40 mmol/L時(shí),存在較明顯的產(chǎn)物抑制作用. 后續(xù)又進(jìn)行了一個(gè)制備級(jí)的規(guī)模實(shí)驗(yàn),在底物質(zhì)量濃度為16.8 g/L時(shí),催化終止時(shí)可獲得高純度、高產(chǎn)率的產(chǎn)物,對(duì)映體純度為95%,產(chǎn)率為72%. 賀婉紅[42]對(duì)來(lái)源于綠豆環(huán)氧化物水解酶的基因進(jìn)行克隆表達(dá),先提取出編碼該酶的mRNA,再通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后擴(kuò)增成雙鏈的DNA,將該DNA在大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá),獲得了產(chǎn)綠豆環(huán)氧化物水解酶的工程菌株,同時(shí)評(píng)價(jià)了該工程菌株產(chǎn)的綠豆環(huán)氧化物水解酶的酶學(xué)性質(zhì). 該酶的米氏常數(shù)為2.05 mmol/L,最大反應(yīng)速率為14.8 μmol/(min·mg). JIN等[43]發(fā)現(xiàn)一株Agrobacteriumradiobacter菌株,該菌株具有編碼環(huán)氧化物水解酶的基因,所編碼的水解酶能高效且特異性地拆分外消旋3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷. 通過(guò)將該環(huán)氧化物水解酶的目的基因成功克隆表達(dá)于大腸桿菌,進(jìn)一步研究了重組工程菌動(dòng)力學(xué)拆分3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的性能. 結(jié)果表明,重組后的大腸桿菌對(duì)3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的兩種對(duì)映體均有較好的水解能力,但由于S構(gòu)型的對(duì)映體對(duì)酶的親和力較強(qiáng),催化過(guò)程會(huì)優(yōu)先水解S型的環(huán)氧化物對(duì)映體,從而保留R型的環(huán)氧化物對(duì)映體. 然而,當(dāng)S型底物被消耗殆盡后,R型的環(huán)氧化物水解加快,導(dǎo)致R型底物的產(chǎn)率下降,因此催化時(shí)間的控制對(duì)該拆分反應(yīng)尤為重要. 此外,由于底物和產(chǎn)物的抑制作用,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?84 mmol/L時(shí),盡管延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間,最終獲得的R型3-氯-1,2-環(huán)氧丙烷的光學(xué)純度也明顯下降. 在所驗(yàn)證的重組菌菌量的范圍內(nèi),光學(xué)純度不超過(guò)61%. 為進(jìn)一步提升底物濃度,通過(guò)分批添加底物和使用雙相反應(yīng)體系來(lái)降低底物的抑制作用. 在分批添加底物時(shí),最終添加底物的嘗試濃度為448 mmol/L,可獲得目標(biāo)產(chǎn)物的光學(xué)純度超過(guò)80%,而在環(huán)己烷-緩沖液雙相反應(yīng)體系中,底物的最終添加濃度為512 mmol/L,目標(biāo)產(chǎn)物的光學(xué)純度大于98%.
來(lái)源于BacillusmegateriumECU1001的環(huán)氧化物水解酶的結(jié)構(gòu)與其它來(lái)源的水解酶的結(jié)構(gòu)相似,均含有α和β結(jié)構(gòu),且含有1個(gè)覆蓋活性位點(diǎn)的蓋子. KONG等[44]成功將該菌株的環(huán)氧化水解酶的目的基因克隆表達(dá)于大腸桿菌,但來(lái)源于該野生菌株的環(huán)氧化物水解酶的產(chǎn)物釋放通道較窄,限制了酶的催化速率. 通過(guò)對(duì)釋放通道附近的氨基酸(如第128位和第145位氨基酸)進(jìn)行突變,有效拓寬了產(chǎn)物的釋放通道,提升了酶的催化速率.
環(huán)氧化物選擇性水解或拆分受限于理論產(chǎn)率不超50%,通過(guò)將選擇性不同的兩種或多種酶克隆表達(dá)于1個(gè)工程菌中,可有效突破這一限制. KIM等[45]通過(guò)將來(lái)源于新月柄桿菌和鯔魚(yú)的環(huán)氧化物水解酶基因同時(shí)克隆表達(dá)于大腸桿菌中,從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)外消旋環(huán)氧苯乙烷的催化水解,生成R型鄰二醇的產(chǎn)率超過(guò)50%,產(chǎn)物光學(xué)純度高達(dá)94%,且底物濃度較高,達(dá)到50 mmol/L. CAO等[46]將來(lái)源于土豆和Agrobacteriumradiobacter的環(huán)氧化物水解酶的基因表達(dá)于大腸桿菌中,該菌可將廉價(jià)易得的環(huán)氧苯乙烷選擇性地水解為(R)-1,2-型苯乙二醇,在底物濃度為5 mmol/L時(shí),其轉(zhuǎn)化率高達(dá)100%且產(chǎn)物的光學(xué)純度高達(dá)98%.
環(huán)氧化物水解酶的來(lái)源廣泛,普遍存在于自然界的植物和微生物中,較易獲得. 在水相和非水相反應(yīng)體系中(如:有機(jī)溶劑-緩沖液雙相體系、含離子液體反應(yīng)體系等),環(huán)氧化物水解酶均表現(xiàn)出優(yōu)異的催化選擇性,且酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)清晰. 但是,由于環(huán)氧化物難溶于水或易水解的性質(zhì),限制了該催化反應(yīng)在水相體系中的應(yīng)用,而在非水相反應(yīng)體系中催化環(huán)氧化物水解可有效克服這些問(wèn)題,提升催化的效率. 分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了環(huán)氧化物水解酶的研究進(jìn)展,其可以用來(lái)獲得不同來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶,研究酶的酶學(xué)性質(zhì),以及對(duì)自然來(lái)源酶的改造,獲得更加高效的環(huán)氧化物水解酶或重組工程菌.
探索綠色且有利于環(huán)氧化物溶解的反應(yīng)介質(zhì)是建立高效催化環(huán)氧化物反應(yīng)體系的關(guān)鍵一環(huán),深度共熔溶劑也已證明可用于土豆環(huán)氧化物水解酶的催化反應(yīng),提高酶對(duì)底物的選擇性,但其它來(lái)源的環(huán)氧化物水解酶在該類(lèi)介質(zhì)中反應(yīng)的研究并不多. 隨著生物技術(shù)的發(fā)展,利用基因工程技術(shù)改造原有的環(huán)氧化物水解酶,提升其催化的選擇性、活力以及底物的耐受力,也逐漸成為主要發(fā)展趨勢(shì).
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Research Progress on Epoxide Hydrolase
LOU Wenyong1,2*, ZHAO Ying1,2, PENG Fei1,2, ZONG Minhua1,2
(1. Laboratory of Applied Biocatalysis, School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China; 2. Guangdong Province Key Laboratory for Green Processing of Natural Products and Product Safety, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)
Epoxide hydrolases can highly and selectively catalyze epoxides to chiral diols, which is an effective way to synthesize chiral diols. This article introduces the structure, functions, sources and mechanism of catalysis of this enzyme. The research on the hydrolyzation of epoxides by epoxide hydrolases, the enzyme cloning and expression in other bacteria are summarized.
hydrolase;epoxide;chiral diol;catalysis
2017-10-13 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址:http://journal.scnu.edu.cn/n
國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21676104,21376096)
*通訊作者:婁文勇,教授,Email:wylou@scut.edu.cn.
Q556.9
A
1000-5463(2017)06-0001-06
【中文責(zé)編:譚春林 英文審校:李海航】