鄧 燕 杜先智

(重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，重慶400010)

LL-37抑制結核分枝桿菌感染巨噬細胞炎性因子分泌的研究①

鄧 燕 杜先智

(重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科，重慶400010)

目的：探討LL-37在感染結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)的巨噬細胞(Macrophage,Mφ)中對炎性因子分泌的影響及其抗炎作用。方法：(1)使用豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)將THP-1細胞誘導分化為具有吞噬作用的巨噬細胞(Mφ)，用Mtb感染Mφ，構建細胞模型，用不同濃度的LL-37處理感染Mtb的巨噬細胞，并設置對照組。(2)實驗分組：①正常對照組：THP-1+生理鹽水;②Mtb組：THP-1+Mtb；③Mtb+LL-37 5 μg/ml組:THP-1+Mtb+5 μg/ml LL-37；④ Mtb+ LL-37 10 μg/ml組：THP-1+ Mtb+10 μg/ml LL-37；⑤ Mtb+ LL-37 20 μg/ml組：THP-1+Mtb+20 μg/ml LL-37。(3)各組培養(yǎng)6、12、24、48 h后用RT-PCR檢測促炎因子IL-12p40、TNF-α及抗炎因子IL-4、IL-10 mRNA的表達；ELISA測定上清中細胞因子IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10的分泌量。結果：與正常對照組相比較，Mtb感染組各時間段IL-12p40、TNF-α、IL-4及IL-10 的mRNA表達上調，并且其分泌量顯著增加(P<0.05)；LL-37刺激組與Mtb組相比較，各時間段外源性LL-37降低促炎因子IL-12p40、TNF-α mRNA的表達，IL-12p40、TNF-α分泌下降(P<0.05)；而IL-4、IL-10 mRNA的表達升高，抗炎因子IL-4、IL-10分泌增加(P<0.05)。結論：外源性LL-37可抑制Mtb感染的巨噬細胞炎性細胞因子分泌，其效應與LL-37的濃度、感染Mtb的時間相關。本研究為結核病的治療提供了新的見解。

LL-37；結核分枝桿菌；細胞因子

結核病(Tuberculosis)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)引起的慢性傳染性疾病，也是單一感染導致死亡率僅次于艾滋病的世界性傳染病。2013年WHO數(shù)據顯示，有 900萬新發(fā)病例，有 150萬死于結核[1]。我國是僅次于印度的第二大高結核病負擔國，據估計僅肺結核就使國民生產總值每年直接損失90億元以上，結核病仍然是影響國民健康、制約經濟發(fā)展的重大傳染病。近年來由于多重耐藥結核(MDR)和廣泛耐藥結核(XDB)[2]、艾滋病患者的增多，結核病的治療面臨著巨大挑戰(zhàn)。

人抗菌肽(The human cathelicidin microbial peptide，CAMP)在人的細胞核糖體合成，為12～60個氨基酸組成的小分子堿性多肽，具有較強的陽離子特征和兩親性結構。唯一明確的人類抗菌肽被稱為人類陽離子抗微生物蛋白(hCAP-18),LL-37是作為有活性的C-末端肽從hCAP-18裂解所得的[3]，具有廣泛的免疫活性，發(fā)揮既促炎又抗炎的效應[4]。研究證明，在生理水平1,25(OH)2D3的情況下，感染Mtb的Mφ內產生人抗菌肽顯著增多，并誘發(fā)巨噬細胞自噬[5]。內源性人抗菌肽調節(jié)Mφ內IL-12p40、TNF-α等細胞因子的產生[6]。目前，國內外對于外源性LL-37在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中抗炎作用研究較少，因此本實驗探究外源性LL-37在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中細胞因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和菌株 人單核巨噬細胞系THP-1細胞系購自第三軍醫(yī)大學中心實驗室。Mtb標準人型毒力株H37Rv(ATCC93009)由重慶市肺科醫(yī)院惠贈。

1.1.2 主要試劑 LL-37購自上海吉爾生化公司；豆蔻酰佛波醇酯(PMA)購自Santa Cruz 公司；Trizol RNA提取試劑、RNA逆轉錄試劑盒、SYBR等PCR試劑購自TaKaRa公司；PCR引物由Invitrogen公司合成；ELISA試劑盒購自北京四正柏公司；RPMI1640、胎牛血清購自Gibco BRL公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌的培養(yǎng) 在生物安全柜中，按照法國梅里埃公司米氏M7H9液體培養(yǎng)基說明，將H37Rv(ATCC93009)菌株接種于M7H9液體培養(yǎng)基中，接種后的培養(yǎng)瓶置于法國梅里埃公司BacT/ALERT MP處理系統(tǒng)進行快速液體培養(yǎng)，取21 d培養(yǎng)物以吐溫80/PBS液稀釋成菌液，用生物梅里埃細菌濃度比濁儀測定其濁度，配制成2×108ml-1的菌懸液，備用。

1.2.2 細胞的培養(yǎng)、誘導及分化 人單核巨噬細胞系 THP-1細胞在含10%胎牛血清、100 U/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將細胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的THP-1接種于6孔板中，用不含抗生素的10%RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞生長至濃度為2×106ml-1時，分別加入100 ng/ml PMA孵育24 h，誘導THP-1細胞分化使之具有吞噬能力。

1.2.3 細胞的分組、感染 在生物安全柜中，將上述6孔板中已分化的THP-1細胞隨機分為5組，向各組加入濃度為2×107ml-1的Mtb懸液，感染2 h后，未被吞噬的Mtb用PBS洗滌3次除去，添加不含抗生素的10%RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，以此時間點計時感染6、12、24、48 h后收集上清液和細胞，實驗重復3次，每個樣本設置3個復孔。

1.2.4 RT-PCR檢測的IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA表達 提取RNA,將1×107ml-1細胞加入Trizol 裂解細胞，移液槍反復吹打，室溫靜置5 min,然后加入200 μl氯仿，混勻，快速震蕩30 s,4℃12 000 r/min 離心15 min；將上清液移至 1.5 ml離心管中，加入500 μl預冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置 15 min后 12 000 r/min 4℃ 離心 10 min,棄去上清，在離心管中加入預冷的75%的乙醇 1 ml，震蕩片刻，12 000 r/min 4℃離心5 min,棄上清，室溫靜置干燥2～5 min,去RNase水溶解沉淀。用紫外光分光光度計測總RNA含量和純度，以1 μg總RNA為模板，用Oligo為引物，按照說明書介紹的方法逆轉錄合成cDNA。IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10、β-Actin 引物由Invitrogen合成(表1)。將制取的cDNA照條件擴增：SYBR 12.5 μl、Forward Primer (10 μmol/L) 1 μl、Reverse Primer (10 μmol/L) 1 μl、模板DNA 2 μl、無核酸酶水調整總量至25 μl。然后設置96℃預變性3 min、96℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s、35個循環(huán)。RT-PCR實驗數(shù)據用2-ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需要PCR的循環(huán)數(shù))分析樣本IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA的相對表達量。

表1 PCR引物

Tab.1 Primer sequences of assayed genes

GeneSequencesLengthIL?12p40Forward5′?GACATTCTGCGTTCAGGTCCAG?3′98bpReverse5′?CATTTTTGCGGCAGATGACCGTG?3TNF?αForward5′?CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG?3′135bpReverse5′?ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC?3′IL?4Forward5′?AGGTGTCGATTTGCAGTGAC?3′145bpReverse5′?ACTAGGCCTCACCTGATACG?3′IL?10Forward5′?TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA?3′169bpReverse5′?GTCTTGGTTCTCAGCTTGGG?3′β?ActinForward5′?CACCATTGGCAATGAGCGGTTC?3′135bpReverse5′?AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT?3′

1.2.5 ELISA檢測IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 按照試劑盒說明加樣，置于37℃溫育60 min，加入稀釋30倍的洗滌液洗板5次，加顯色劑，37℃避光顯色5～15 min 后加入終止液，終止反應。450 nm 波長檢測吸光度(OD)值并測各細胞因子濃度。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10 mRNA水平

2.1.1 各組不同時段IL-12p40 mRNA水平 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組IL-12p40 mRNA表達增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激比較，IL-12p40 mRNA的表達與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越大，抑制作用越明顯(P<0.05)。見圖1。

2.1.2 各組不同時段TNF-α mRNA水平 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組TNF-α mRNA表達增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，TNF-α mRNA的表達與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越大，抑制作用越明顯(P<0.05)。見圖2。

2.1.3 各組不同時段 IL-4 mRNA水平 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組 IL-4 mRNA表達增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-4 mRNA的表達與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越小，IL-4 mRNA表達水平越高(P<0.05)。見圖3。

圖1 各組不同時段IL-12p40 mRNA水平Fig.1 mRNA of IL-12p40 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: *.P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group .n=3 .

圖2 各組不同時段TNF-α mRNA水平Fig.2 mRNA of TNF-α in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: * .P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group .n=3 .

圖3 各組不同時間段IL-4 mRNA水平Fig.3 mRNA of IL-4 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: * .P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

2.1.4 各組不同時段IL-10 mRNA水平 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組IL-10 mRNA表達增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-10 mRNA的表達與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越小，IL-10 mRNA表達水平越高(P<0.05)。見圖4。

2.2 ELISA檢測IL-12p40、TNF-α、IL-4、IL-10的分泌

2.2.1 各組不同時段IL-12p40分泌 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組IL-12p40分泌增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-12p40分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越大，IL-12p40分泌越少(P<0.05)。見表2。

2.2.2 各組不同時段TNF-α分泌 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組TNF-α分泌增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，TNF-α分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越大，TNF-α分泌越少(P<0.05)。見表3。

2.2.3 各組不同時段IL-4分泌 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較，Mtb感染組IL-4分泌增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-4分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越小，IL-4分泌越多(P<0.05)。見表4。

2.2.4 各組不同時段IL-10分泌 各時間段Mtb感染組與正常對照組相比較,Mtb感染組IL-10分泌增加。在相同作用時間下,LL-37刺激組與未刺激組比較，IL-10分泌與LL-37的濃度和LL-37作用于巨噬細胞的時間有關。在相同作用時間下，濃度越小，IL-10分泌越多(P<0.05)。見表5。

圖4 各組不同時段IL-10 mRNA水平Fig.4 mRNA of IL-10 in various groups at 6 h,12 h,24 h and 48 hNote: *.P<0.05 Mtb group vs control group；# .P<0.05 Mtb group vs Mtb+5 μg/ml LL-37 group；**.P<0.05 Mtb group vs Mtb+10 μg/ml LL-37 group；△.P<0.05 Mtb group vs Mtb+20 μg/ml LL-37 group.n=3.

Groups0h6h12h24h48hControlgroup10158±106511138±128711153±126911136±123611145±1248Mtbgroup10208±105521362±21791)67984±70231)126354±126561)101338±108851)Mtb+LL?375μg/mlgroup10176±108817933±27832)50554±52652)100605±100752)91843±93782)Mtb+LL?3710μg/mlgroup10168±104514093±15943)40098±41143)85129±90193)65836±66063)Mtb+LL?3720μg/mlgroup10136±103712196±12284)29825±29794)70588±71344)52050±53814)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup6676±6706687±6706650±6686707±6736788±682Mtbgroup6696±67110341±11521)176162±180051)119590±120661)161240±162241)Mtb+LL?375μg/mlgroup6796±6698139±8202)155978±170522)108105±108482)138969±140792)Mtb+LL?3710μg/mlgroup6796±6737062±7173)135450±155503)96967±97333)108979±110773)Mtb+LL?3720μg/mlgroup6796±6715068±5084)113825±114564)76738±87044)90064±900824)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup9662±9609663±9679694±9729696±9799656±1763Mtbgroup9663±963 38827±38851) 47867±48021) 60568±61391) 40807±40901)Mtb+LL?375μg/mlgroup9668±957 45366±45452) 92367±93052) 150768±152642) 73637±74632)Mtb+LL?3710μg/mlgroup9657±967 43168±44103) 52935±53283) 69819±70033) 47473±47523)Mtb+LL?3720μg/mlgroup9661±966 30346±30374) 40852±40824) 53855±54084) 32829±33054)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

Groups0h6h12h24h48hControlgroup11637±116011847±119111798±119111785±118811757±1179Mtbgroup11707±114015941±16051)19371±21321)32052±32051)21885±22091)Mtb+LL?375μg/mlgroup11647±115218429±18502)24529±25122)37851±38232)27059±27872)Mtb+LL?3710μg/mlgroup11628±117117050±17363)23089±23443)35064±35243)26210±26313)Mtb+LL?3720μg/mlgroup11827±114016394±16484)22817±22384)33516±33094)24071±24354)

Note：1)P<0.05 Mtb group vs control group；2)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 5 μg/ml group；3)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 10 μg/ml group；4)P<0.05 Mtb group vs Mtb+LL-37 20 μg/ml group.n=3 .

3 討論

我國是世界三大結核病高負擔國家之一，結核病是影響我國國民健康和制約我國經濟發(fā)展的重大傳染病。機體抗結核主要通過細胞免疫，巨噬細胞是人體抗結核的第一道防線，主要通過產生和分泌細胞因子參與機體抗結核反應。LL-37是從人類陽離子抗微生物蛋白裂解所得、有活性的C-末端肽，由37個氨基酸組成,呈螺旋狀的,包含親水和疏水部分；LL-37表達于胃腸道、呼吸道上皮細胞、單核細胞、中性粒細胞、T細胞、NK細胞及B細胞。LL-37主要是中性粒細胞和上皮細胞分泌產生，生理情況下，機體可分泌2～5 μg的LL-37，當機體發(fā)生炎癥和病原體入侵時，LL-37的分泌量增加[7]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，LL-37是具有多種活性作用且唯一存在于人體內的防御素，其活性包括調節(jié)炎癥反應,趨化免疫細胞至損傷或感染部位，結合并中和LPS，促進再上皮化及損傷修復等。

人抗菌肽主要通過細胞膜形成通道而破壞細胞膜，從而殺傷病原微生物。抗菌肽主要通過其直接的抗菌活性參與清除機體的結核分枝桿菌。研究表明，肺泡巨噬細胞和單核-巨噬細胞在結核感染時通過產生抗菌肽而清除結核分枝桿菌[8-10]。IL-12p40是活化的單核/巨噬細胞合成的細胞因子，其功能是促進T細胞分化，增加Th1應答，調節(jié)細胞免疫。Emi等[6]的研究結果表明，內源性的LL-37抑制IL-12p40的生成。TNF-α是巨噬細胞產生的具有多種生物學活性的細胞因子，對白細胞、血管內皮細胞及結締組織中的細胞因子具有免疫調節(jié)作用。TNF-α 不僅能夠刺激細胞產生前列腺素和蛋白酶，還可增強血管通透性，具有促炎作用[11]。有研究表明，內源性的LL-37可以減少LPS和LTA刺激的單核巨噬細胞產生TNF-α[12，13]，我們在實驗中使用外源性LL-37同樣可抑制IL-12p40及TNF-α的生成。

為探討抗菌肽在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中免疫抑制功能，我們檢測了抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA的水平和分泌。IL-4和IL-10是Th2細胞分泌的抗炎因子，參與機體的抗結核反應。研究表明，正常人可以分泌一定量的LL-37，當機體分泌抗菌肽不足時，結核的易感性增加[10,12]，在活動性結核患者體內IL-4和IL-10均升高[14]。我們的實驗表明，5 μg/ml和10 μg/ml的LL-37增加IL-4 mRNA水平，IL-4的分泌量增加，而20 μg/ml的LL-37抑制了IL-4 mRNA水平，IL-4的分泌量減少，這提示外源性LL-37對IL-4的生物學作用與LL-37的濃度相關；同時另一抗炎因子IL-10 mRNA水平， IL-10的分泌量在外源性LL-37的作用下，其表達和分泌是升高的。LL-37對抗炎因子IL-4和IL-10 mRNA水平和分泌的影響，提示LL-37增加抗炎因子的生成。綜上，LL-37具有免疫調節(jié)功能，既可以通過抑制促炎因子的生成避免過度的炎癥反應，又可以增加抗炎因子的生成避免過度的炎癥反應，從而使機體在結核分枝桿菌感染時維持動態(tài)平衡。

既往研究表明內源性LL-37具有抗細菌、真菌、病毒、寄生蟲的作用[15-19]。本研究是首次致力于外源性LL-37在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞的免疫調節(jié)作用。LL-37對結核分枝桿菌感染的巨噬細胞的細胞因子分泌影響為我們臨床治療結核提供了新的視野和見解，然而，LL-37在結核分枝桿菌感染的巨噬細胞中炎癥因子分泌的機制不清，有待進一步研究。

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[收稿2016-06-03 修回2016-09-05]

(編輯 張曉舟)

LL-37 inhibited secretion of inflammatory cytokines in mycobacterium tuber-culosis infected macrophages

DENGYan，DUXian-Zhi.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China

Objective:To research the anti-inflammatory effect of LL-37 in mycobacterium tuberculosis (Mtb) infected-macrophages,as well as its influence on the secretion of inflammatory cytokines.Methods:(1) THP-1 cells were cultured and incubated with phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to transform into an adherent macrophage-like state (macrophage,Mφ).Then the THP-1 cell derived macrophages were infected with mycobacterium tuberculosis,and then stimulated with different concentrations of LL-37.(2)The experiment was divided into following groups： ① Control group:THP-1+normal saline (NS);② Mtb group:THP-1+Mtb;③Mtb+LL-37 5 μg/ml group:THP-1+Mtb+5 μg/ml LL-37;④Mtb+LL-37 10 μg/ml group:THP-1+Mtb+10 μg/ml LL-37;⑤Mtb+LL-37 20 μg/ml group:THP-1+Mtb+20 μg/ml LL-37.(3)The mRNA expression levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4,and IL-10 will be determined by Real-time PCR respectively at 6,12,24 and 48 hours.The secreted levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4,and IL-10 will be determined by ELISA analysis respectively at 6,12,24 and 48 hours.Results:The mRNA expression levels and secreted levels of IL-12p40,TNF-α,IL-4 and IL-10 were increased in Mtb group than those in control group.The mRNA expression levels and secreted levels of pro-inflammatory cytokines IL-12p40 and TNF-α were decreased in the LL-37 groups than those in Mtb group.However,anti-inflammatory cytokines IL-4 and IL-10 mRNA expression levels and secreted levels were increased in the LL-37 groups than those in Mtb group.Conclusion: Exogenous LL-37 inhibited the secretion of inflammatory cytokines in macrophages during mycobacterium tuberculosis infection.The effect is related to the concentrations of LL-37 and the stimulated time of macrophages which were infected with mycobacterium tuberculosis.The results will provide new insights into the treatment of Mtb infection.

LL-37;Mycobacterium tuberculosis(Mtb);Cytokines

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.006

鄧 燕(1989年-)，女，碩士，主要從事肺部感染性疾病與免疫的研究。

及指導教師：杜先智(1964年-)男，教授，碩士生導師，主要從事肺部感染性疾病與免疫的研究，E-mail:dxzdjy868@sina.com。

R392.12

A

1000-484X(2017)02-0190-06

①本文為重慶市衛(wèi)計委重點項目(No.2015ZDXM013)。