龐 盼 朱玥潔 胡金偉 賈 斌 甫拉提·熱西提 張峰波 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊830011)

·臨床免疫學(xué)·

布魯氏菌病患者血清sTim-3/HMGB1水平及外周血單個核細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β斑點形成細(xì)胞的變化①

龐 盼 朱玥潔②胡金偉 賈 斌 甫拉提·熱西提③張峰波 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，烏魯木齊830011)

目的：探討布魯氏菌病患者體內(nèi)可溶性T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(sTim-3)、高遷移率族蛋白1(HMGB1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的變化特點，分析這些變化與布魯氏菌感染的關(guān)聯(lián)性。方法：28例未經(jīng)治療布魯氏菌病患者為布病病例組，28例在年齡和性別上與布病病例組匹配的健康人為對照組，采用ELISA法檢測了布病病例組和對照組血清中sTim-3和HMGB1的水平，通過ELISPOT法檢測了這些患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)經(jīng)布魯氏菌抗原刺激產(chǎn)生TGF-β的斑點形成細(xì)胞(SFC)。結(jié)果：與正常對照組相比，布魯氏菌病患者血清中sTim-3和HMGB1水平及PBMC中產(chǎn)生TGF-β的SFC均明顯增高(P<0.01)；產(chǎn)生TGF-β的SFC與血清HMGB1水平呈正相關(guān)性(P<0.05)。結(jié)論：布魯氏菌病患者血清中sTim-3和HMGB1升高，且在布魯氏菌抗原刺激后PBMC中產(chǎn)生TGF-β的SFC亦升高，這些分子可能參與了布魯氏菌感染發(fā)生發(fā)展的過程，并與免疫逃避有關(guān)。

sTim-3；HMGB1；TGF-β；布魯氏菌病

布魯氏菌病(Brucellosis)簡稱布病，是由布魯氏菌(Brucella)感染引起的最常見的人畜共患傳染病[1-3]。全球每年大約50多萬例新發(fā)布病患者[4],以青壯年男性居多，高發(fā)于以畜牧業(yè)基地為主的農(nóng)牧區(qū)[5]。人主要通過接觸感染的動物或被污染的肉、奶制品等經(jīng)皮膚和消化道等不同途徑感染布魯氏菌[6]。該菌侵入機體后被吞噬細(xì)胞吞噬，成為胞內(nèi)寄生菌，到淋巴結(jié)繁殖形成感染灶；突破淋巴結(jié)進入血循環(huán)形成菌血癥，表現(xiàn)為發(fā)熱。該菌隨后又侵入宿主肝、脾和骨髓等器官，發(fā)熱消退，在寄生的臟器中大量繁殖，再次入血形成菌血癥而致體溫升高，如此反復(fù)，形成臨床上的波浪熱，伴隨關(guān)節(jié)痛和全身乏力等癥狀。

共抑制分子Tim-3(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein-3，Tim-3)主要表達于CD4+輔助性T1細(xì)胞(T helper 1，Th1)和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte，TCL)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(Natural killer cell，NK)和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)的表面，通過與其配體半乳凝素9(Gal-9)結(jié)合，抑制T細(xì)胞活化和增殖，從而負(fù)性調(diào)控機體的免疫應(yīng)答[7]。可溶性Tim-3(soluble Tim-3，sTim-3)是膜型Tim-3的可溶性分子；作為共抑制分子，同樣在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和細(xì)胞凋亡中起重要作用[8,9]。文獻報道已證實，膜型Tim-3和可溶性Tim-3的高表達在機體慢性病毒感染、腫瘤免疫逃逸等的發(fā)生發(fā)展中均扮演重要角色[10-12]?？勺鳛門細(xì)胞功能耗竭的主要標(biāo)志分子之一。HMGB1(High mobility group box 1，HMGB1)是sTim-3的配體，也是重要的促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧等,進而導(dǎo)致炎癥或細(xì)胞組織損傷[13]。sTim-3/HMGB1的相互作用可抑制核酸介導(dǎo)的固有免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[14，15]。然而，sTim-3/HMGB1在布病患者中的表達變化目前并不清楚，因此很有必要了解布病患者血清中的sTim-3及其配體HMGB1的變化特點，分析sTim-3/HMGB1與布病的關(guān)系，為布病治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2015年2月至2016年1月在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科就診的28例未治療且已明確診斷的布病患者，年齡為24～58歲，中位年齡為38歲，其中男性患者19例，女性患者9例。布病的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照布魯氏菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS268-2007)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、骨關(guān)節(jié)痛、全身乏力等，采用虎紅平板凝集試驗進行初篩，陽性者進一步采用試管凝集試驗檢測血清中抗布魯氏菌特異性抗體，滴度≥1∶50為陽性。選取28例同期體檢的健康人群作為正常對照組，年齡和性別均與病例組匹配。所有對照及患者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(20150225-94)。

1.2 方法

1.2.1 血清sTim-3和HMGB1的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測布病患者組和正常對照組血清中sTim-3及HMGB1的含量，將收集到的28例布病患者組與28例正常對照組血清置-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。人sTim-3 ELISA 試劑盒和人HMGB1 ELISA 試劑盒均購自武漢貝茵萊生物科技有限公司，檢測的操作嚴(yán)格按照試劑盒中說明書進行。將sTim-3及HMGB1標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度，空白調(diào)零，以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。xMark酶標(biāo)儀(Bio-Rad)進行吸光值讀數(shù)，計算待測血清sTim-3及HMGB1的濃度值。

1.2.2 酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)檢測轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β) 采用ELISPOT法檢測布病患者組和正常對照組外周血PBMC中TGF-β的斑點形成細(xì)胞數(shù)(Spot forming cells，SFC)，檢測試劑盒購于美國R&D公司。采抗凝血3 h內(nèi)分離PBMC，在包被特異性抗人TGF-β抗體的96孔ELISPOT板，每孔加入100 μl培養(yǎng)液調(diào)至終濃度為2×105個PBMC。每份PBMC樣本加3個孔，即100 μl PBS為陰性對照孔；終濃度為5 μg/ml植物血凝素(PHA)為陽性對照孔；終濃度為5 μg/ml布魯氏菌重組蛋白抗原(rOMP31)(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科制備)為實驗刺激孔，置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，整個操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。將ELISPOT板置于ELISPOT自動讀板儀(AID Elispot Reader，德國AID公司)內(nèi)，調(diào)節(jié)好合適的參數(shù)，進行斑點計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 正常對照組和布病患者組血清sTim-3的水平 用ELISA法檢測布病患者組血清sTim-3的水平為(13.20±1.83) ng/ml，正常對照組血清sTim-3的水平為(7.09±3.23) ng/ml。與正常對照組相比，布病患者組血清中sTim-3的表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

2.2 正常對照組和布病患者組血清HMGB1的水平 用ELISA法檢測布病患者組血清中HMGB1水平為(23.34±5.57) ng/ml，正常對照組血清中HMGB1水平為(12.85±6.68) ng/ml。與正常對照組相比，布病患者組血清中HMGB1的表達明顯增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖1 布病患者組與正常對照組血清中sTim-3的水平Fig.1 Patients infected with brucella group and control group sTim-3 level in serumNote: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

圖2 布病患者組與正常對照組血清中HMGB1的水平Fig.2 Patients infected with brucella group and control group HMGB1 level in serumNote: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

圖3 ELISPOT檢測布魯氏菌重組抗原(rOMP31)刺激PBMC分泌TGF-β的SFCFig.3 Spot forming cells of secreting TGF-β from peripheral blood mononuclear cell stimulated by rOMP31Note: Patients infected with brucella vs control，*.P<0.01.

2.3 ELISPOT法檢測布病患者組和正常對照組TGF-β的SFC 在重組蛋白OMP31刺激下，布病患者分泌TGF-β的SFC中位數(shù)為151(182，281)，正常對照組分泌TGF-β的SFC中位數(shù)為13(4.5，28)；布病患者組PBMC中分泌TGF-β的SFC數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖3和圖4)。然而，在PHA和PBS條件下，布病患者和正常對照組PBMC中分泌TGF-β的SFC中位數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)重組蛋白OMP31刺激的布病患者組PBMC中分泌TGF-β的SFC顯著高于陰性對照下的相同個體SFC，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 ELISPOT檢測PBMC中分泌TGF-β的SFC照片F(xiàn)ig.4 Spot forming picture of secreting TGF-β by ELISPOTNote: A，B and C represents secreting of TGF-β in the brucellosis group;D，E and F represents secreting of TGF-β in the control group ;A and D by stimulating rOMP31 protein;B and E by stimulating PHA； C and F by stimulating PBS.a represents count range,b represents the hole wall.

圖5 布病患者組PBMC中分泌TGF-β SFC與血清HMGB1水平的相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of spot forming cells secreting TGF-β and HMGB1

2.4 布病患者組PBMC中分泌TGF-β斑點數(shù)與血清sTim-3和HMGB1水平的相關(guān)性分析 通過Spearman法進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，布病患者組PBMC中分泌TGF-β的SFC與血清中sTim-3水平不相關(guān)(P>0.05)，但與血清中HMGB1的水平呈正相關(guān)(r=0.425,P=0.024，圖5)。

4 討論

布病的早期癥狀多不明確，容易發(fā)生診斷不清，耽誤治療，使病情拖延至慢性期而導(dǎo)致患者終身難愈[16,17]。目前缺乏有效的治療慢性布病的方法，因此，研究布病的發(fā)病機制，尋找布病的治療靶點就顯得尤為重要。

布魯氏菌作為胞內(nèi)寄生菌感染宿主后，主要以CD4+T淋巴細(xì)胞引起的細(xì)胞免疫為主，且Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子起關(guān)鍵保護作用[18]。當(dāng)布魯氏菌感染至慢性期，轉(zhuǎn)為以Th2細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答為主，不利于宿主對體內(nèi)布魯氏菌的清除[19]。已知，免疫分子Tim-3和sTim-3均可與T細(xì)胞表面的配體結(jié)合抑制Th1細(xì)胞的增殖和功能[20]。Ren等[21]認(rèn)為sTim-3在膿毒血癥、細(xì)粒棘球蚴病和結(jié)核病中升高，可抑制Th1分泌IFN-γ，導(dǎo)致Th1/Th2細(xì)胞失衡，在病原體感染中起重要的免疫抑制作用。亦有研究表明，HMGB1與受體Tim-3結(jié)合，可阻斷機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤生長和浸潤[22-24]。當(dāng)HMGB1異常高表達，可促進Treg細(xì)胞的分泌，減少Treg細(xì)胞凋亡以及增強Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制作用[25]。本研究結(jié)果顯示，布魯氏菌患者血清中sTim-3 和HMGB1的表達均顯著高于正常對照組，可能造成Tim-3與其配體HMGB1的結(jié)合增加，從而負(fù)性調(diào)控特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，不利于機體抵抗布魯氏菌的侵入。TGF-β1作為一個細(xì)胞抑制因子,能在布病患者體內(nèi)抑制IFN-γ激活巨噬細(xì)胞的殺菌功能和促進Treg細(xì)胞的免疫抑制功能而發(fā)揮重要的負(fù)性調(diào)控作用[26,27]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，在布魯氏菌重組蛋白(rOMP31)的刺激下，布病患者PBMC分泌TGF-β的細(xì)胞斑點數(shù)顯著增多。進一步相關(guān)性分析顯示，布病患者PBMC中分泌TGF-β的細(xì)胞斑點數(shù)與血清HMGB1水平呈正相關(guān)。

總之，根據(jù)本研究的發(fā)現(xiàn)，我們推測布魯氏菌感染可以刺激機體sTim-3/HMGB1信號通路的激活，抑制Th1細(xì)胞的免疫功能，并產(chǎn)生較多的TGF-β。TGF-β是Treg細(xì)胞等分化和發(fā)揮功能必需的細(xì)胞因子，Treg細(xì)胞數(shù)量的增多和功能增強又進一步抑制機體的免疫功能。同時，布病患者體內(nèi)高表達HMGB1也可促進Treg細(xì)胞分泌TGF-β，使感染的細(xì)菌逃避宿主的免疫攻擊，有助于在體內(nèi)增殖擴散。然而，由于本研究觀察的布魯氏菌病患者數(shù)量有限，且尚未進行免疫功能的評價。因此，亟待加大臨床樣本量，并通過各種功能性研究以驗證我們的推測。

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[收稿2016-06-14 修回2016-10-12]

(編輯 倪 鵬)

Changes of sTim-3/HMGB1 and Spot forming cells of TGF-β secreting from peripheral blood mononuclear cell in patients infected with brucella

PANGPan,ZHUYue-Jie,HUJin-Wei,JIABin,REXITI·Fulati,ZHANGFeng-Bo,DINGJian-Bing.

DepartmentofClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830011，China

Objective:To investigate the changes of sTim-3，HMGB1 and TGF-β in the brucellosis patients and to analyse the relationship between the changes of these molecules and brucella infection.Methods: 28 cases of brucellosis patient untreated and 28 healthy control cases in the age and gender matched with brucellosis cases were collected.The serum levels of sTim-3 and HMGB1 were detected by ELISA,and the levels of Spot forming cells secreting TGF-β were measured by ELISPOT in patients and healthy control group.Results: Compared with healthy controls,sTim-3/HMGB1 expression levels and Spot forming cells secreting TGF-β were significantly increased in the brucellosis patients (P<0.01).The changes of Spot forming cells secreting TGF-β were positively correlated with the levels of HMGB1 (P<0.05).Conclusion: The serum levels of sTim-3/HMGB1 and Spot forming cells of secreting TGF-β from peripheral blood mononuclear cell are significantly increased in the brucellosis patients.Those molecules may be involved in the process of brucella infection and may play a significant role in the immune escape of patients infected with brucella.

sTim-3；HMGB1；TGF-β；Brucellosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.02.017

①本文為國家自然科學(xué)基金項目(81560322)、新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項目(2015211C100)和新疆醫(yī)科大學(xué)科學(xué)創(chuàng)新基金(XYDCX201507)。

龐 盼(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事布魯氏菌感染方面的研究，E-mail: 2449579487@qq.com。

及指導(dǎo)教師：張峰波(1982年-)，男，博士，主管技師，主要從事病原學(xué)方面的研究，E-mail: 765219598@qq.com。 丁劍冰(1960年-),女，博士，教授，免疫教研室主任，博士生導(dǎo)師，主要從事感染免疫和生殖免疫方面的研究，E-mail: djbing002@sina.com。

R392.11 R378.5

A

1000-484X(2017)02-0247-05

②共同第一作者。

③新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊830011。