張鴻暉　劉先發(fā)

【摘要】 目的：研究在肝細胞癌中STAT3下調(diào)后，caspase3、muc1及cyclinD1表達量的變化，篩選出針對肝癌STAT3信號通路的關(guān)鍵分子。方法：選擇2014年5月-2016年5月，40例來本院進行治療的肝癌患者為研究對象，分別取肝癌組織和癌旁正常組織為研究材料。進行免疫熒光、Western blot分析腫瘤組織和細胞中STAT3及P-STAT3蛋白的表達。根據(jù)GENEBANK上提供的STAT3編碼序列，篩選目標序列，取相同目標序列為潛在siRNA靶位點，BLAST比對后設(shè)計多個靶序列siRNA，以熒光素標記，體外轉(zhuǎn)染細胞株，篩選轉(zhuǎn)染效率最佳siRNA序列。用RT-qPCR技術(shù)分析人肝癌細胞株中caspase3、muc1、cyclinD1、P21、MMP2 mRNA的表達量，Western blot分析轉(zhuǎn)染后細胞株中STAT及P-STAT3蛋白的表達。結(jié)果：通過Western blot檢測肝癌組織和癌旁正常組織中STAT3和P-STAT3蛋白的表達量發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的STAT3和P-STAT3蛋白的表達量比癌旁正常組織中的表達量高；下調(diào)STAT3可以抑制肝癌細胞Hep-G2的增殖和體外侵襲能力，促進細胞凋亡，沉默STAT3基因，其STAT3信號通路上的信號分子也在不同時間點顯著性下調(diào)表達。結(jié)論：由此可見阻斷或下調(diào)STAT3信號通路可以抑制肝癌細胞増殖及侵襲生物學(xué)行為影響，STAT3有可能是肝臟腫瘤治療新的優(yōu)良分子靶點。

【關(guān)鍵詞】 肝癌； STAT3； 信號分子

Effect on the Expression of Caspase3，Muc1 and CyclinD1-A Mechanism Research after STAT3 Downregulation in Hepatocellular Carcinoma/ZHANG Hong-hui，LIU Xian-fa.//Medical Innovation of China，2016，13（35）：011-015

【Abstract】 Objective：To screen out key molecular for hepatocellular carcinoma（HCC） STAT3 signaling pathways and to study the expression quantity change of caspase3，muc1 and cyclinD1 in HCC after the STAT3 downregulated.Method：From May 2014 to May 2016， 40 liver cancerpatients of our hospital for treatment were as the research objects，and liver cancer tissue and normal adjacenttissue to carcinoma taken respectively from these people were as the research material.The techniques of immunofluorescence and Western blot were used to analyze the expression of STAT and P-STAT3 proteinin tumor tissues and cells.According to the GENEBANK of coding sequence of STAT3，and screening out target sequence，the same target sequences were taken as potential siRNA targeted point.Multiple target sequences of siRNA were designed after the BLAST comparison，modifiedwith fluorescein markers，then transfected in cell lines，to screen out transfection most efficient siRNA sequences.Using RT-PCR technique analyzing the mRNA level on expression quantity of caspase3，muc1，cyclinD1，P21 and MMP2 in human liver cell lines.Western blot was used to analyze the expression of the STAT and P-STAT3 protein after transfection cell lines.Result：We found that STAT3 and P-STAT3 protein expression content in cancer of the liver tissue was higher than that in normal tissue adjacent to carcinoma by Western blot to test the expression of STAT3 and P-STAT3 protein respectively in HCC tissue and normal tissue adjacent to carcinoma.Downregulation STAT3 could inhibit the Hep-G2 proliferation in liver cancer cell and invasion abilityin vitro，promoted apoptosis，and made STAT3 gene silence.STAT3 signal molecules on the signaling pathway also significantly lower expression at different time points.Conclusion：We find that STAT3 downregulation could inhibit the biological behaviour influence in the liver cancer cell proliferation and colonization.We speculate that STAT3 might be the new molecular targets of liver cancer in the treatment of HCC.

【Key words】 Liver cancer； STAT3； Signaling molecules

First-authors address：The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.35.003

我國是病毒性肝炎高發(fā)區(qū)，也是原發(fā)性肝細胞肝癌高發(fā)區(qū)，全世界每年新發(fā)肝癌病例的42.5%出現(xiàn)在我國大陸，近20年來我國原發(fā)性肝細胞肝癌患者的死亡率增加了41.17%，嚴重危害人民健康，影響社會生產(chǎn)力，因此尋找原發(fā)性肝細胞肝癌有效治療方法意義重大[1]。隨著醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)某些細胞信號通路的異常激活在腫瘤發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，而核因子扮演重要角色，負責完成細胞外信號傳遞至核內(nèi)，影響細胞生物學(xué)行為[2-3]。信號轉(zhuǎn)錄因子及活化子（STATS）是細胞內(nèi)和受體相結(jié)合的蛋白，可以完成從胞質(zhì)到核內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，當細胞受到刺激時，STATS上的SH3結(jié)構(gòu)域與受體上被磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，同時自身被JAK磷酸化，STAT3可能是一種癌基因[4]。STAT3是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點，在多種腫瘤細胞和組織中都有激活， STAT3激活后誘導(dǎo)某些與細胞增殖、分化、凋亡密切相關(guān)的關(guān)鍵基因異常高表達， 通過各種途徑促進細胞增殖、惡性轉(zhuǎn)化、阻礙細胞凋亡， 表現(xiàn)出致癌的作用[5-8]。因此有關(guān)腫瘤中STAT3的信號通路近年成為研究熱點，其很有可能成為腫瘤基因靶向治療的優(yōu)良分子靶點。本研究假設(shè)如果阻斷STAT3蛋白表達，作為酶促反應(yīng)的產(chǎn)物-磷酸化STAT3蛋白量也會相應(yīng)下降，最終肝臟腫瘤的增殖侵襲能力會受到抑制，STAT3有可能是肝臟腫瘤治療新的優(yōu)良分子靶點。本研究的目的是初步證實以STAT3為靶分子阻斷STAT3信號通路可以抑制肝癌細胞増殖侵襲，為下一步實驗提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年5月-2016年5月，40例來本院進行治療的肝癌患者為研究對象，分別取肝癌組織和癌旁正常組織為研究材料，40例患者中，男21例，女19例，年齡36～62歲，平均（47.46±3.02）歲。肝癌細胞株Smcc-7721，Hep-G2，MHCC97-H，人正常肝細胞株LO2，均來自本實驗室保存。

1.2 組織切片和免疫熒光 （1）將濕紙巾鋪于載玻片盒底部做成加濕盒，由冰凍切片儀中取出載有切片的載玻片，放入玻片盒中（每邊放6片），或故濕盒中（載玻片勿相互接觸）；（2）待載玻片達室濕且未干時，鋪加PBS于切片上（勿溢出玻片）；（3）稀釋的第一抗體于4 ℃用微量離心機以13 500 g離心

2 min，每一載玻片上加40～50 μL抗體，應(yīng)能蓋住切片；（4）用與泵相連的巴斯德吸管，在切片的一端吸去玻片上的PBS，并從另一端加上抗體，蓋上加濕盒，室溫溫育1 h；（5）以PBS冼玻片

3次（5 min/次），從切片一端加入新的PBS緩沖液，由另一端吸去舊的緩沖液；（6）稀釋的第二抗體于4 ℃用微量離心機以13 500 g離心2 min，每載玻片可加40～50 μL抗體；（7）將第二抗體加于切片上，置加濕盒中室溫溫育1 h，以PBS洗玻片3次（5 min/次）；（8）將蓋玻片放于紙巾上，滴加1滴Gelvatol于蓋玻片中央。翻過載玻片放于蓋玻片上（勿施壓），將玻片置工作臺上，用鋁箔覆蓋避光放置30 min，使Gelvatol 凝結(jié)；（9）顯微鏡下觀察結(jié)果，或置玻片盒中貯于4 ℃。

1.3 Western blot檢測STAT及 P-STAT3蛋白含量 （1）裂解肝癌組織和癌旁正常組織，用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白；（2）蛋白在沸水浴中加熱3～5 min，使蛋白質(zhì)充分變性，冷卻室溫，4 ℃保存待用；（3）配飾SDS-PAGE凝膠，將變性準備好的蛋白上樣電泳，使不同大小的蛋白質(zhì)分離；（4）轉(zhuǎn)膜，將目的蛋白用硝酸纖維素膜進行水浴轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完成后用Western洗滌液，漂洗1～2 min，洗去轉(zhuǎn)膜液；（5）封閉，將洗滌液吸凈后，加入封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h；（6）抗體標記，根據(jù)一抗和二抗的說明書，先后進行一抗和二抗孵育，對蛋白進行抗體標記；（7）標記完成后，進行顯影與圖像分析。

1.4 篩選細胞株 （1）根據(jù)GENEBANK上提供STAT3序列，在網(wǎng)站上篩選目標序列。（2）取相同目標序列作為潛在的siRNA靶位點，經(jīng)BLAST比對，排除其他編碼序列/EST同源的序列，設(shè)計多個靶序列siRNA。（3）以熒光素標記，體外轉(zhuǎn)染Smcc-7721，Hep-G2，MHCC97-H三種肝癌細胞株和正常肝細胞株LO2，篩選轉(zhuǎn)染效率最佳siRNA序列。（4）收集24、48、72 h轉(zhuǎn)染細胞系，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，通過熒光定量PCR（RT-PCR）檢測STAT3基因的表達量，篩選出反應(yīng)最優(yōu)的肝癌細胞株。一步法提取細胞總RNA；逆轉(zhuǎn)錄cDNA；PCR 擴增；PAGE分離cDNA產(chǎn)物，用凝膠圖象分析系統(tǒng)處理

1.5 細胞培養(yǎng)和siRNA干擾 （1）37 ℃，5%CO2及飽和濕度下，培養(yǎng)篩選出來的反應(yīng)最優(yōu)的肝癌細胞株和正常肝細胞株LO2細胞。（2）轉(zhuǎn)入24孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，到對數(shù)生長期。（3）別用空白對照，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組，siRNA-STAT3，STAT3錯配siRNA轉(zhuǎn)染LO2和篩選出的肝癌細胞株。（4）轉(zhuǎn)染24、48、72 h，收集細胞用MTT法檢測腫瘤細胞的細胞增值率，加入MTT孵育3～4 h后，棄去各孔液體，加入200 μL DMSO震搖10 min，于550 nm處用酶標儀測定吸光值。（5）轉(zhuǎn)染24、48、72 h，收集細胞用流式細胞術(shù)（FCM）分析細胞周期，用Annexin V-FITC/PI雙標記檢測細胞的凋亡率，收集的細胞用PBS漂洗后，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書進行染色，然后采用流式細胞儀檢測，并計算細胞的凋亡率。（6）用Transwell法檢測腫瘤細胞的侵襲能力。首先將聚碳酸酯膜用Matrigel膠進行包被；調(diào)整細胞濃度為1×106/mL，在Transwell的上室中加入100 μL的細胞混懸液，在下室中加入600 μL含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基；細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出濾膜，用4%的多聚甲醛固定，胎盤蘭染色；顯微鏡下計數(shù)穿透的濾膜下層的細胞數(shù)，隨機選取8個視野求平均數(shù)。（7）轉(zhuǎn)染24、48、72 h，收集細胞siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染LO2和篩選出的肝癌細胞株，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用RT-PCR分析 caspase3、muc1、cyclinD1基因的表達量變化

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。用單因素變量方差分析法 （ANOVA）分析樣品間基因表達量差異，利用 Dunnettt-Test（2-sided）進行多重比對。利用GraphPad.Prism.v5.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 STAT3和P-STAT3在肝癌組織和癌旁正常組織中的表達量 通過Western blot檢測肝癌組織和癌旁正常組織正常中STAT3和P-STAT3蛋白的表達量發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中的STAT3和P-STAT3蛋白的表達量比癌旁正常組織中的表達量高，見圖1。

2.2 SiRNA-STAT3轉(zhuǎn)染效率的檢測 SiRNA-STAT3轉(zhuǎn)染四種細胞Smcc-7721、Hep-G2、MHCC97-H、LO2的結(jié)果，見圖2，其中肝癌細胞中Hep-G2細胞的轉(zhuǎn)染效果最佳。

2.3 MTT法檢測細胞增值率 細胞增值率用MTT法檢測，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Hep-G2后24、48、72 h的細胞增殖率比同時間點其他組和空白對照組低，且與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞的凋亡率 細胞凋亡率用Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染正常肝細胞LO2和肝癌細胞株Hep-G2后24、48、72 h的細胞增殖率均比同時間點空白對照組高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.5 Transwell法檢測腫瘤細胞的侵襲能力 用Transwell法檢測腫瘤細胞的侵襲能力，細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，取出濾膜，用4%多聚甲醛固定，胎盤蘭染色；在顯微鏡下計數(shù)穿透的濾膜下層的細胞數(shù)，隨機選取8個視野求平均數(shù)。統(tǒng)計結(jié)果如下：空白對照LO2細胞（93.2±7.2）個，空白對照Hep-G2細胞（98.5±8.5）個，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染LO2細胞（94.4±8.2）個，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染LO2細胞（83.4±5.7）個，STAT3錯配siRNA轉(zhuǎn)染LO2細胞（88.6±8.4）個，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hep-G2細胞（99.1±9.1）個，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染Hep-G2細胞（38.5±6.2）個，STAT3錯配siRNA轉(zhuǎn)染Hep-G2細胞（95.7±9.12）個，由此可見siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Hep-G2后24 h后穿膜細胞數(shù)目明顯低于其他組和空白對照組，且與空白對照組相比差異具有顯著性（P<0.05），因此可見沉默STAT3可以抑制肝癌細胞Hep-G2的體外侵襲能力。

2.6 RT-PCR檢測caspase3、muc1及cyclinD1基因的表達量 用熒光定量PCR檢測caspase3、muc1及cyclinD1基因的表達量結(jié)果，見圖3。轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，caspase3、muc1及cyclinD1均有下調(diào)，且caspase3在24 h，muc1在72 h，cyclinD1在48 h時，下調(diào)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

RNA干擾（RNAi）技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)，設(shè)計一段微小的RNA分子，與需要干擾的基因的某個片段吻合，使之無法正常傳遞遺傳信息，使致病的基因“沉默”下來，RNAi的機制可能是細胞內(nèi)雙鏈RNA在Dicer酶的作用下，可形成22 bp大小的小干擾RNA（small interfering RNAs，siRNAs）[9]，siRNAs可進一步摻入多部分核酸酶（multicomponent nuclease，RISC）并使其激活，從而精確降解與siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了該基因在細胞內(nèi)的翻譯和表達。哈佛醫(yī)學(xué)院的研究人員首次用RNA干擾使活體動物的致病基因“沉默”[10]，已經(jīng)成功地利用這種核糖核酸干擾技術(shù)治愈了實驗鼠的肝炎，如果進一步證實這種技術(shù)在人體內(nèi)有效，將為包括肝癌在內(nèi)的眾多疾病提供新療法。而影響治療效果的重要因素之一，RNA干擾靶基因的選擇尤為重要，STAT3的激活對于細胞的生長與凋亡，以及細胞周期的調(diào)控都有著重要的影響，而STAT3自身又是EGFR、IL-6/JAK、Src等多個致癌性酪氨酸激酶信號通道匯聚的焦點，因此STAT3是腫瘤基因沉默靶向治療的優(yōu)良分子靶點[11-12]。

我國是原發(fā)性肝癌高發(fā)國，相對于歐美國家，我國原發(fā)性肝癌的流行病學(xué)特征，發(fā)病機理存在明顯差異，肝癌患者往往伴有乙型肝炎病毒感染、肝硬化，肝臟細胞處于缺血缺氧微環(huán)境，同時由于長期肝炎病毒感染刺激，體內(nèi)各類炎性反應(yīng)因子長期處于高水平狀態(tài)，其中包括gp130亞基受體家族配體的IL-6、IL-12等[13-14]。Cascio等[2]在研究結(jié)腸癌細胞系HT-29時發(fā)現(xiàn)STAT3可以上調(diào)細胞內(nèi)瘦素表達，牛麗文等研究瘦素誘導(dǎo)的肝星狀細胞Ⅰ型膠原基因的表達時提出，瘦素可以刺激定植在肝臟內(nèi)的KUPPER細胞合成分泌IL-6，由此可以做出假設(shè)，在肝炎肝硬化背景下，細胞處于缺氧和病毒感染微環(huán)境下，使體內(nèi)IL-6水平升高，進一步與肝臟腫瘤細胞表面的含有g(shù)p130亞基受體結(jié)合，在JAK2的作用下，使STAT3磷酸化處于激活狀態(tài)，相應(yīng)的下游分子表達發(fā)生變化[15-16]。同時細胞瘦素表達水平提高，刺激KUPPER細胞分泌IL-6，如此反復(fù)，使得腫瘤細胞內(nèi)STAT3磷酸化水平不但升高而且持久，最終促進肝臟腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸等演進行為[17-20]。

本研究結(jié)果顯示，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染肝癌細胞株Hep-G2后24、48、72 h后其下游分子caspase3、muc1及cyclinD1基因的表達量均在不同時間點顯著性下調(diào)，由此可見，沉默STAT3蛋白，阻斷了STAT3信號通路。細胞增殖率檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測時間點細胞增殖率都顯著性低于同時間點的其他組和空白對照組，因此可見下調(diào)STAT3可以抑制肝癌細胞Hep-G2的增殖。同時細胞凋亡率結(jié)果可見，siRNA-STAT3轉(zhuǎn)染正常肝細胞LO2和肝癌細胞株Hep-G2后24、48、72 h的細胞增殖率顯著性高于同時間點的空白對照組，因此可見沉默STAT3促進正常肝細胞LO2和肝癌細胞Hep-G2的凋亡，并且細胞侵襲力也受到了抑制。由此可見阻斷或下調(diào)STAT3信號通路可以抑制肝癌細胞増殖及侵襲生物學(xué)行為影響，STAT3有可能是肝臟腫瘤治療新的優(yōu)良分子靶點。

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（收稿日期：2016-11-14） （本文編輯：程旭然）