尚秋萍+黃林+胡雨薇

摘要：為探討蛋白質(zhì)泛素化與牦牛雜交后代睪丸精子發(fā)生異常的相關(guān)性，比較了參與泛素化的2種酶基因（泛素結(jié)合酶基因Ube2n、泛素連接酶基因Trim36）在成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中的mRNA水平。定量PCR分析顯示，牦牛（n=9）睪丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分別顯著、極顯著高于犏牛（n=7），其中Trim36 mRNA水平相差10倍以上。研究結(jié)果提示，犏牛睪丸蛋白質(zhì)泛素化水平明顯下降，可能會(huì)影響精子發(fā)生過(guò)程中正常的蛋白質(zhì)更新。

關(guān)鍵詞：牦牛；雜交雄性不育；睪丸；蛋白質(zhì)降解；泛素化

中圖分類(lèi)號(hào)： S823.82；Q786 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）01-0019-03

牦牛（Bos grunniens）主要分布在中國(guó)，數(shù)量3 000萬(wàn)頭以上，是青藏高原特有的牛種和畜牧業(yè)主體。牦牛與普通牛（Bos taurus）的雜交后代稱(chēng)為犏牛，具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)乳和產(chǎn)肉量顯著提高，但表現(xiàn)為回交三代內(nèi)雄性不育，無(wú)法產(chǎn)生正常精子[1]，而雌性雜交后代生殖正常，其分子機(jī)制尚未明確。

已有研究表明，犏牛睪丸中很多生殖相關(guān)基因的mRNA或蛋白質(zhì)水平均顯著低于其親本牦牛和黃牛，如SYCP3、Boule、Dazl、Dmrt7、Dmc1等[2-5]。也存在少量蛋白質(zhì)在犏牛睪丸中上調(diào)的情況[6]。也有研究表明，犏牛睪丸中細(xì)胞凋亡增加[7]。盡管目前犏牛雄性不育的分子機(jī)制尚不明確，但總體認(rèn)為，犏牛雄性不育的機(jī)制可能涉及精子發(fā)生過(guò)程中復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并與睪丸中多種特異或非特異蛋白質(zhì)的異常表達(dá)有關(guān)。然而，這些變化是否影響睪丸中蛋白質(zhì)降解尚不明確。鑒于蛋白質(zhì)泛素化在蛋白質(zhì)降解中的重要作用，本研究比較牦牛與犏牛睪丸中與泛素化相關(guān)的泛素結(jié)合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme E2 N，Ube2n）、泛素連接酶（E3 ubiquitin-protein ligase TRIM36，Trim36）基因的mRNA水平，以探討泛素化與犏牛雄性不育是否具有相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

麥洼牦牛（Bosgrunniens）和犏牛（公黃牛與母麥洼牦牛的雜交F1代）的睪丸組織于秋季采自四川省成都市近郊某屠宰場(chǎng)。健康的成年公牦牛（n=9）和雄性不育公犏牛（n=7）在屠宰后立刻取其睪丸，切成適當(dāng)大小后，與干冰一同帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃下保存?zhèn)溆?。本研究?duì)牦牛和犏牛睪丸均進(jìn)行常規(guī)組織切片分析，證實(shí)犏牛睪丸中無(wú)精子。

1.2 主要試劑和儀器

RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Ambion公司，QuantiFast SYBR Green PCR Kit購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，Super Taq DNA Polymerase購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司。

C1000 Thermal Cycler型梯度PCR儀、C1000 Touch Thermal Cycler型熒光定量PCR儀、Versa Doc 1000型凝膠成像系統(tǒng)均為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品，CR21G型高速冷凍離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

采用Trizol法并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取牦牛睪丸的總RNA，采用核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定核酸濃度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit以2 μg總RNA為模板，利用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.4 睪丸組織Ube2n和Trim36基因的定量PCR分析

參照普通牛的Ube2n（NM_001076258）、Trim36（XM_005890859）、內(nèi)參基因GAPDH（NM_001034034）、18S RNA（NR_036642）序列，采用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)定量PCR引物（表1）。分別對(duì)上述4個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化后經(jīng)10倍梯度稀釋作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。利用定量PCR儀上的軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。表1 引物序列

目的基因引物（5′→3′） 產(chǎn)物長(zhǎng)度（bp）Ube2nF：CCTTAGAGGGCATCAGATCCTCAG；R：AAGGTTCCAACCCACAGGTTAACA240Trim36F：TCTATGGCTCATTGGTAATAAGTAT；R：AAACCACCCAAGAAAGAGTATCT185GAPDHF：CGACTTCAACAGCGACACTCA；R：GGTCCAGGGACCTTACTCCTT16918S RNAF：CTGAGAAACGGCTACCACATC；R：CAGACTTGCCCTCCAATGG168

以反轉(zhuǎn)錄的牦牛和犏牛睪丸組織cDNA為模板，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Ube2n、Trim36基因在睪丸中的相對(duì)表達(dá)量。25 μL PCR體系為：2×QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL、上游及下游引物各1 μL、模板cDNA 1 μL、RNase-free water 9.5 μL。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s（Ube2n）或54 ℃退火20 s（Trim36），72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。于65～95 ℃下制作溶解曲線(xiàn)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因在睪丸中的mRNA水平。采用雙內(nèi)參GAPDH和18S RNA的幾何平均數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以牦牛睪丸的表達(dá)量為對(duì)照。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用SPSS 18.0軟件對(duì)熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ube2n和Trim36基因表達(dá)的熒光定量PCR分析方法

本研究提取的睪丸RNA質(zhì)量經(jīng)核酸蛋白檢測(cè)儀和瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)的檢測(cè)分析，濃度和質(zhì)量均符合要求。本試驗(yàn)建立了牦牛Ube2n和Trim36基因mRNA的定量PCR檢測(cè)方法，采用雙內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。目的基因和內(nèi)參基因擴(kuò)增的特異性高（圖1），擴(kuò)增效率為98.6%～103.8%，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系較好（R2約為0.99），符合所用儀器的定量及相應(yīng)算法要求。

2.2 牦牛和犏牛睪丸組織Ube2n、Trim36基因mRNA水平的比較

對(duì)成年牦牛和雄性不育犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因mRNA水平的定量PCR檢測(cè)顯示，犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因的mRNA水平分別顯著、極顯著低于牦牛，其中Ube2n mRNA水平相差約2倍，而Trim36 mRNA水平相差10倍以上（圖2）。

3 結(jié)論與討論

蛋白質(zhì)的泛素化是其在細(xì)胞中降解的關(guān)鍵，在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程（細(xì)胞周期、DNA損傷的修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等）中發(fā)揮重要作用，涉及3種酶的參與以及多種修飾模式[8-9]。本研究在mRNA水平證實(shí)，2種參與泛素化的酶基因（Ube2n、Trim36）在犏牛睪丸中的表達(dá)均顯著下降，提示犏牛睪丸中蛋白質(zhì)的泛素化降解可能存在異常。牦牛和犏牛睪丸中Ube2n、Trim36基因mRNA的變化趨勢(shì)與其蛋白質(zhì)水平的變化趨勢(shì)相同[6]（部分為待發(fā)表資料），進(jìn)一步驗(yàn)證了參與泛素化的2種酶在犏牛睪丸中表達(dá)異常。

犏牛的雜種優(yōu)勢(shì)具有重要的應(yīng)用價(jià)值，但其雄性不育在很大程度上制約了犏牛的高效利用。犏牛睪丸組織中無(wú)精子[7]，精子發(fā)生受阻很可能與減數(shù)分裂異常有關(guān)。犏牛睪丸中很多與生殖相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)[2-7]，但與其雄性不育的因果關(guān)系尚未明確。犏牛睪丸組織泛素化水平降低與其精子發(fā)生異常是否存在關(guān)聯(lián)，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。筆者推測(cè)，由于犏牛睪丸中多數(shù)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平可能下降[2-7]，其泛素化水平的降低很可能是適應(yīng)蛋白質(zhì)水平改變的結(jié)果。Ube2n和Trim36 mRNA水平在犏牛睪丸中的顯著下降或許不是犏牛雄性不育的關(guān)鍵原因，但其機(jī)制可能涉及睪丸精子發(fā)生過(guò)程中復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。精子發(fā)生過(guò)程中減數(shù)分裂異常的原因很多，如生殖隔離中減數(shù)分裂前期DNA雙鏈斷裂（DSB）不能修復(fù)、染色體聯(lián)會(huì)或重組異常等[10]。這種DNA的修復(fù)或許直接導(dǎo)致蛋白質(zhì)泛素化修飾相關(guān)酶的改變，已有研究表明，參與DNA雙鏈斷裂修復(fù)的蛋白質(zhì)或DNA損傷可通過(guò)一些機(jī)制影響其他蛋白質(zhì)的泛素化[11-12]。雄性不育犏牛睪丸組織Ube2n和Trim36 mRNA水平顯著下降， 是其精子發(fā)生異常所涉及的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的一部分。

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